백신 개발을 위한 Chlamydia muridarum 의 재조합 주요 외막 단백질에 무세포 규모 생산 및 보조제 추가

요약

이 프로토콜은 서브유닛 백신에서 항원으로 사용할 수 있는 나노디스크에 지지된 막 단백질을 생산하기 위해 상업용 무세포 단백질 발현 키트를 사용하는 것을 설명합니다.

초록

서브유닛 백신은 안전성, 안정성 및 표준 제조 면에서 기존의 비활성화 또는 약독화 전세포 유래 백신에 비해 이점을 제공합니다. 효과적인 단백질 기반 서브유닛 백신을 달성하기 위해 단백질 항원은 종종 천연과 유사한 형태를 채택해야 합니다. 이것은 막 결합 단백질인 병원체 표면 항원에 특히 중요합니다. 무세포 방법은 일반적으로 나노디스크로 알려진 나노지단백질 입자(NLP)의 공동 번역을 통해 올바르게 접힌 기능성 막 단백질을 생산하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

이 전략은 지질 결합 환경에서 막 단백질로 구성된 서브유닛 백신을 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 무세포 단백질 생산은 종종 소규모(<1mL)로 제한됩니다. 소규모 생산에서 생산되는 단백질의 양은 일반적으로 생화학 및 생물물리학 연구에 충분합니다. 그러나 동물 모델에서 백신 연구에 충분한 단백질을 얻기 위해 무세포 공정을 확장, 최적화 및 신중하게 테스트해야 합니다. 정제, 보조제 첨가 및 동결건조와 같은 백신 생산과 관련된 다른 공정은 병렬로 최적화되어야 합니다. 이 논문은 막 결합 단백질 서브유닛 백신을 발현, 정제 및 공식화하기 위한 확장된 프로토콜의 개발을 보고합니다.

스케일 업된 cell-free 반응은 제형화된 나노지단백질 입자의 높은 수준의 생산을 위해 다중 플라스미드 발현 벡터, 지질 선택 및 보조제 첨가를 사용할 때 플라스미드 농도 및 비율의 최적화가 필요합니다. 이 방법은 여기에서 클라미디아 주요 외막 단백질(MOMP)의 발현으로 입증되지만 다른 막 단백질 항원에도 널리 적용될 수 있습니다. 항원 유효성은 여기에서 입증된 바와 같이 항체 생산을 측정하기 위한 면역화 연구를 통해 생체 내에서 평가될 수 있다.

서문

단백질의 무세포 발현을 위한 원핵생물 또는 진핵생물 용해물은 관심 있는 단백질을 합성하기 위한 상용 제품으로 쉽게 사용할 수 있습니다(전체 검토는 ¹ 참조). 이러한 발현 시스템은 다양한 규모로 이용 가능하며 대장균, 담배 식물 및 포유류 배양을 포함한 다양한 유기체의 용해물을 활용합니다. 무세포 용해물은 사용 편의성, 강력하고 빠른 단백질 생산 등 기존의 재조합 단백질 생산 방식에 비해 여러 가지 이점을 제공합니다. 이러한 접근법은 주로 수용성 단백질을 생산하는 데 사용되지만, 이 그룹은 막 단백질을 발현하는 데 사용하는 접근법을 개척했습니다.

이 새로운 접근법은 발현을 위해 두 가지 단백질 생성물인 아포지단백질과 관심 있는 막 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하여 기존의 무세포 발현 시스템을 약간 수정합니다. 발현된 아포지단백(ApoA1 또는 ApoE4의 유도체)은 cell-free lysate에 첨가된 지질과 상호작용하여 NLP를 자발적으로 조립(~20nm)합니다. 관심 있는 막 단백질과 함께 번역될 때, NLP 및 막 단백질은 가용성 나노입자 복합체를 형성하며, 여기서 막 단백질은 NLP 지질 이중층 내에 매립됩니다. 따라서, 막 단백질은 용해성, 분리된 입자 내에 포함되어 있기 때문에 다운스트림 응용 분야에 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 이 접근법은 NLP 이중층² 내에서 기능성 올리고머 단백질 복합체를 생산할 수 있고, 서브유닛 백신의 항원 성분을 생성할 수 있으며, 이는 연속적으로 친유성 보조제와 혼합되어 생체 내 평가에 적합한 공동-국소화된 항원 및 보조제를 특징으로 하는 나노입자 백신을 형성합니다.

이 현재 방법은 이전에 게시된 프로토콜³에서 수정되었습니다. 주요 변형은 cell-free 반응의 스케일 업 및 단백질-NLP 복합체의 후속 정제에 중점을 둡니다. 추가 변형은 텔로덴드리머로 알려진 양친매성 폴리머의 첨가를 포함하며, 이는 무세포 반응에 첨가되기 전에 먼저 지질과 혼합됩니다. 텔로덴드리머와 지질의 존재 하에서 플라스미드의 공동번역은 텔로덴드리머 NLP(tNLP)를 생성한다. 텔로덴드리머의 첨가는 또한 생성된 tNLP 나노입자의 크기 및 단분산성을 조절하는 데 도움이 된다⁴. 이 프로토콜은 막 결합 서브유닛 항원 단백질인 클라미디아 MOMP ^5,6을 생산하기 위한 대규모 백신 연구에 특별히 최적화되어 있습니다. 상기 방법은 tNLP와 관련된 재조합 MOMP를 생성하여 MOMP 올리고머화를 유지하는 고가용성 MOMP-tNLP 복합체를 형성한다. 일반적인 3mL 스케일업 생산은 >1.5mg의 정제된 MOMP를 산출합니다. 무세포 생산 MOMP-tNLP는 생체 내 면역원성 시험을 위한 신속한 보조제 첨가가 가능하다.

프로토콜

모든 동물 연구는 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 정한 지침에 따라 캘리포니아 대학교 어바인(University of California, Irvine)의 공중 보건 서비스(PHS) 보증 시설에서 수행되었습니다.

1. 유리 제품 준비

참고: 동물용 백신 등급 제제 생산에 사용되는 모든 재료는 내독소가 없습니다.

1. 오염된 내독소를 파괴하려면 완충액을 180°C의 오븐에서 4시간 동안 보관할 수 있는 세척된 유리 제품을 굽습니다.

2. 버퍼 준비

1. 표 1에 열거된 Ni 친화성 정제 완충액 250mL를 준비한다. 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하세요.

3. 반응 준비

1. 20mg의 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DMPC)을 내독소가 없는 1.5mL 원심분리기 튜브에 계량합니다. 내 독소가없는 물 1mL에 녹이고, 6 A에서 1 분 동안 최소 4 회 프로브 초음파 처리하고, 그 사이에 1 분 동안 일시 중지하여 투명해질 때까지 초음파 처리합니다. 22°C에서 2분 동안 13,000× g 에서 원심분리하여 프로브에서 오염 금속을 제거한 다음 가용화된 지질을 새로운 1.5mL 내독소가 없는 튜브로 옮깁니다.
2. PEG5k-CA8 텔로덴드리머 1mg을 1.5mL 내독소가 없는 튜브에 계량합니다. 내독소가 없는 물에 20mg/mL 농도로 녹입니다. 완전히 용해될 때까지 소용돌이치고 2mg/mL로 희석합니다.
3. 새로운 내독소가 없는 튜브에서 20mg/mL DMPC 용액 210μL와 2mg/mL 텔로덴드리머 용액 210μL를 결합합니다.

4. 서브유닛 백신 제형을 위한 MOMP-tNLP의 무세포 생산

1. 이전에 발표된 프로토콜⁵에서 수정된 cell-free 방법을 사용하여 MOMP-tNLP를 준비합니다.
   1. cell-free 반응을 설정하기 2시간 전에 원핵생물 cell-free 단백질 발현 키트를 열고 재구성 완충액 중 하나를 해동합니다. 일단 해동되면, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일의 1 정을 추가하고 완전히 녹이되게하십시오.
2. 5 x 1 mL 반응을 실행하도록 설계된 키트를 사용하여 이 프로토콜을 따르십시오.
   참고: 일반적인 스케일 업 생산은 3 x 1mL입니다.
   1. 각 1mL 반응에 대해 525μL의 재구성 완충액을 대장균 용해물 병에 넣고 부드럽게 굴려 용해시킵니다. 반응 첨가제(예: ATP, GTP)가 들어 있는 병에 재구성 완충액 250μL를 넣고 부드럽게 롤링하여 용해시킵니다.
   2. 8.1mL의 재구성 완충액을 반응 공급 병에 넣고 고무 마개로 다시 덮고(고무 마개 내부를 만지지 않도록 주의) 부드럽게 뒤집거나 굴려 용해시킵니다.
   3. 재구성 완충액 3mL를 아미노산 혼합물 병에 넣고 고무 마개로 뚜껑을 덮고 부드럽게 뒤집거나 굴려 녹입니다.
      알림: 고무 마개 내부를 만지면 오염될 수 있으므로 주의하십시오.
   4. 재구성 완충액의 1.8 mL를 메티오닌 병에 추가하고, 녹이기 위하여 살찐 후에 구르고, 그 후에 사용할 때까지 얼음에 저장하십시오.
3. 반응 용액을 준비한다.
   1. 대장균 용해물 병에 225 μL의 재구성 반응 혼합물, 270 μL의 메티오닌 없이 재구성 아미노산 혼합물, 30 μL의 재구성된 메티오닌을 추가합니다. 또한 DMPC/텔로덴드리머 혼합물 400μL, MOMP 플라스미드 15μg 및 Δ49ApoA1 플라스미드 0.6μg을 추가합니다. 롤/부드럽게 흔들어 섞습니다.
      참고: 두 플라스미드가 동일한 플라스미드 백본에서 구성되었는지 확인합니다. 소용돌이치지 마십시오.
   2. 총 용액 20μL를 취하여 GFP 발현 대조군 반응을 위해 1.5mL 튜브에 따로 보관합니다(아래 참조).
4. 공급 용액을 준비하십시오. 사료 혼합 병에 메티오닌이 없는 재구성 아미노산 혼합물 2.65mL와 재구성 메티오닌 300μL를 추가합니다. 롤링/부드럽게 흔들어 녹입니다.
   알림: 이때 사용하지 않은 재구성 완충액과 메티오닌은 냉동실에 넣어 보관할 수 있습니다.
5. 반응 용액 1 mL를 무세포 반응 키트에 제공된 내부 반응 챔버로 옮기고 채워지면 밀봉한다. 10 mL의 공급 용액을 반응 용기의 외부 챔버로 옮기고 밀봉한다.
   알림: 챔버를 과도하게 채우지 마십시오! 내부 반응 챔버와 내부 공급 챔버 모두의 상단에 기포가 존재하면 반응에 악영향을 미칩니다. 나머지 반응 용액을 1.5mL 튜브에 넣고 주 용기와 함께 혼합할 수 있습니다.
6. 이전에 분취된 20 μL 반응 혼합물에 0.5 μL의 GFP 대조군 플라스미드(0.5 mg/mL)를 추가합니다.
   참고: 많은 키트에는 품질 관리 목적으로 대조 플라스미드가 함께 제공됩니다. T7 프로모터 및 E.coli 리보솜 결합 부위(RBS)를 갖는 대부분의 GFP 발현 플라스미드는 또한 대조군 플라스미드로서 사용될 수 있다.
7. 300rpm, 30°C에서 최대 18시간 동안 진탕기에 반응물을 넣습니다. 반응이 성공적이었는지 확인하려면 UV 광원을 사용하여 배양 15분 후 대조군 GFP(그림 1A)의 합성으로 인한 형광을 확인했습니다.
   참고: 이러한 조건, 특히 온도는 다른 막 단백질의 발현을 위해 최적화되어야 할 수 있습니다.

5. MOMP-tNLP 정제

1. 고정화된 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 Δ49ApoA1 단백질에 His-tag를 사용하여 무세포 반응 혼합물로부터 MOMP-tNLP 나노입자 복합체를 정제합니다.
   1. His-Tag 정제 수지의 50% 슬러리 1mL를 일회용 10mL 크로마토그래피 컬럼으로 옮기고 3mL의 결합 완충액으로 평형을 이룹니다.
   2. 버퍼를 배수하고 배출구를 덮은 다음 250μL의 결합 버퍼를 수지에 추가합니다.
   3. cell-free 반응을 컬럼에 추가하기 전에 SDS-PAGE에 의한 추후 분석을 위해 20 μL를 저장한다. 무세포 반응물을 평형화된 수지와 혼합하고 4°C의 실험실 로커에서 1시간 동안 배양합니다.
2. 컬럼의 캡을 열고 500μL의 추가 결합 완충액으로 캡을 세척한 후 이 액체를 컬럼의 나머지 부분에 추가합니다.
3. SDS-PAGE에 의한 추후 분석을 위해 컬럼에서 액체 유동을 수집합니다.
4. 20 mM 이미다졸을 함유하는 세척 완충액 1 mL로 컬럼을 6회 세척하고 분획을 수집한다. 세탁 사이에 수지가 마르지 않도록 주의하십시오. 두 번째 세척 시 1mL 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 수지를 세게 교반합니다.
5. 용출 완충액 1(250mM 이미다졸 함유)의 300μL 분획 6개에서 MOMP-tNLP를 용리한 후 300μL의 용출 완충액 2(500mM 이미다졸 함유)로 최종 용출합니다. 두 번째 용출 시, 1mL 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 수지를 세게 교반합니다.

6. SDS-PAGE에 의한 분석

참고: 모든 용출 분획은 SDS-PAGE로 분석하여 관심 단백질의 양과 순도를 선별해야 합니다.

1. 총 용해물과 플로우 스루에 각각 1μL를 로드한 다음 수집된 모든 세척 및 용출 분획에 대해 5μL를 로드합니다.
   1. 용리된 MOMP–tNLPs, 세척, 플로우 스루 및 총 용해물의 분취량을 4x SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼와 혼합합니다. 달리 명시되지 않는 한 샘플을 10x 샘플 환원제로 혼합하고 열 변성합니다.
   2. 적절한 분자량 표준물질과 함께 1x MES-SDS 실행 완충액이 있는 1.0mm, 4 내지 12% Bis-Tris SDS-PAGE 겔을 사용하여 겔 전기영동으로 분획을 분석합니다. 200V에서 35분 동안 젤을 실행합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 젤을 얼룩지게하십시오.
   1. 카세트에서 젤을 제거하고 60mL의 젤 얼룩에 넣습니다. 젤 스테인에 젤을 전자레인지에 30초 동안 돌리고 용기를 30초 동안 부드럽게 흔들어 열을 고르게 분산시킵니다. 얼룩에 있는 젤을 전자레인지에 80–85°C로 30초 더 돌리고 젤을 오비탈 셰이커에 올려 5분 동안 흔들어 놓습니다.
   2. 젤을 전자레인지에 30초 동안 세 번 돌린 다음 궤도 셰이커로 돌아가 23분 더 돌립니다.
   3. 겔을 깨끗한 용기에 옮기고 100mL의 세척 용액(10% 메탄올, 7% 아세트산)에서 30분 동안 세척합니다.
      알림: 이것은 세척 용액을 가열하지 않는 것이 필수적이므로 중요한 단계입니다. 그렇게 하지 않으면 최종 젤 이미지에서 배경 얼룩과 불규칙성이 발생할 수 있습니다.
   4. 세척 후 초순수로 젤을 각각 5분씩 두 번 헹굽니다.
   5. 600nm에서 겔 이미저를 사용하여 겔을 이미지화합니다(그림 2). 비교를 위한 단백질 표준이 있는 경우 SDS-PAGE를 사용하여 나노입자 용액에서 개별 단백질의 양을 정량화합니다.
      참고: 이 예에서ample, 재조합적으로 발현된 MOMP의 연속 희석은 SDS-PAGE에 의해 해결되고 밴드의 밀도는 기기 소프트웨어를 사용하여 정량화됩니다.
   6. MOMP 대역의 밀도를 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 동일한 SDS-PAGE 겔에서 MOMP-tNLP 시료를 분해하고 MOMP 표준 곡선을 사용하여 입자의 MOMP 성분을 계산합니다 (그림 3).

7. 서양 및 도트 얼룩 및 보관

1. 웨스턴 블로팅의 경우, SDS-PAGE로 샘플을 분리하고 제조업체의 프로토콜에 따라 표준 설정을 가진 상업용 건식 블로팅 시스템을 사용하여 겔을 옮깁니다.
   1. 전사가 완료된 후 스택으로부터 블롯을 제거하고, 각각의 블롯을 0.2% 트윈 20 및 0.5 mg/mL MAb40 또는 0.2 mg/mL MAbHIS 항-태그 항체를 함유하는 적합한 블로킹 완충액에서 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.
      참고: 블롯팅에 사용되는 항체 희석액은 MAb40의 경우 1:1,000, MAbHIS 항체의 경우 1:500–1,000입니다.
   2. 각 블롯을 PBS-T(1x PBS, 0.2% 트윈 20, pH 7.4)로 5분 동안 3회 세척합니다.
   3. 형광단(예: IRDye)에 접합된 2차 항체를 1:10,000 희석으로 함유하는 블로킹 완충액에서 1시간 동안 블롯을 인큐베이션합니다.
   4. PBS-T로 5분 동안 블롯을 3회 다시 세척합니다. 형광 이미저를 사용하여 최종 세척 후 얼룩을 이미지화합니다.
2. 도트 블롯의 경우, 정제된 MOMP-tNLP 3 μg과 빈 tNLP를 도트 블롯 장치를 이용하여 블롯하였다. 웨스턴 블로팅을 위해 상술한 것과 동일한 방법을 사용하여 블롯을 차단하고 현상한다.

8. 내독소 평가

1. Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 분석을 기반으로 하는 내독소 검사 시스템을 사용하여 내독소 수준을 정량화합니다. 1M Tris 염산염 용액과 내독소가 없는 물을 사용하여 내독소가 없는 25mM Tris, pH 7.4, 샘플 버퍼를 준비합니다.
   참고: 일반적으로 samples는 이 s를 사용하여 희석해야 합니다.ample 버퍼, 그리고 개별 s에 적합한 범위를 찾기 위해 희석액을 조정amp르. 여기서 MOMP-tNLP 샘플은 샘플 버퍼에서 500배 희석되고 25μL는 0.05EU/mL 감도로 장치 카트리지의 각 웰에 로드됩니다. 아래에 설명된 마우스 연구에 사용된 MOMP-tNLP 및 빈 tNLP의 내독소 수준은 샘플에 따라 0.4에서 12 EU/μg 단백질 사이입니다.

9. 동결건조

1. MOMP-tNLP 나노입자를 -20°C에서 장기간(최대 수년) 사용하기 위해 동결건조하여 보관한다. 동결건조를 위한 tNLP 및 MOMP-tNLP 현탁액을 제조하기 위해, 동결 및 동결건조 과정에서 보호제로 트레할로스를 첨가한다.
   참고: 이 공정은 다양한 tNLP 제형 ^7,8에 대해 광범위하게 검증되었습니다.
2. MOMP-tNLP 용액의 현재 부피를 9로 나누어 0.1 M 트레할로스의 최종 농도에 도달하는 데 필요한 멸균, 내독소가 없는, 탈이온수에서 1 M 트레할로스의 부피를 얻는다. 최종 부피를 기록하고 원하는 대로 내독소가 없는 15mL 또는 50mL 폴리프로필렌 튜브에 분취량을 넣습니다.
3. 혼합 용액을 드라이아이스에 동결하고 동결건조기를 사용하여 밤새 동결건조한다. 건조된 제형을 필요할 때까지 -20°C에서 보관한다.
4. 내독소가 없는 물을 사용하여 동결건조된 tNLP를 재구성합니다. 동결건조된 케이크가 완전히 용해되고 재수화될 때까지 부드럽게 굴립니다. 트레할로스를 제거하기 위해, 3.5 kDa 컷오프 투석막을 사용하여 PBS에 대해 용액을 투석한다.

10. 보조제 첨가

참고: 이들 및 기타 유사한 NLP 기반 서브유닛 백신 제형은 CpG-ODN1826 및 FSL-1과 같은 친유성 보조제를 쉽게 통합할 수 있습니다. CpG-ODN1826은 5' 콜레스테롤 부분(5'-chol-C6)을 특징으로 하는 완전한 포스포로티오에이트 골격을 가진 변형된 클래스 B CpG 올리고뉴클레오티드(5'-tccatgacgttcctgacgtt-3')입니다. tNLP에 대한 CpG-ODN1826의 접합은 콜레스테롤 부분과 tNLP의 인지질 이중층 사이의 소수성 상호작용에 의해 매개되며, 이전에 보고된 바와 같이 입증되고 잘 특성화되었다 ^9,10.

1. 이러한 제형에 혼입하기 전에 역상 크로마토그래피로 콜레스테롤 변형 CpG를 정제하여 오염된 내독소 및 변형되지 않은 CpG 분자를 제거합니다.
   1. 공급업체로부터 수령 시 동결건조된 CpG 물질을 내독소가 없는 물에서 재수화하고 10mM 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA)(이동상 A) 및 아세토니트릴(이동상 B)로 구성된 분리 구배를 사용하여 분취용 C4 RP-HPLC 컬럼에서 정제합니다.
      참고: 자세한 내용은 표 2에서 확인할 수 있습니다.
   2. 콜레스테롤 변형 CpG를 함유한 분획을 풀링하고 동결건조합니다. 잔류 TEAA를 완전히 제거하려면 CpG를 15mL의 내독소가 없는 물로 재구성하고 3회 재동결건조합니다.
   3. 최종 동결건조 후 CpG를 내독소가 없는 물(>20mg/mL 최종 CpG 농도)으로 재구성하고 분취하고 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 제형 외에 CpG를 1–2.5 mg/mL의 농도로 희석하십시오.
      참고: FSL-1은 백신 등급의 동결건조 분말로 제공됩니다. 이것은 1mg/mL 농도의 멸균 및 내독소가 없는 물을 사용하여 재구성됩니다. 백신은 근육내(i.m)로 투여되며, 각 용량은 총 부피 50μL에 10μg의 MOMP를 함유합니다.
2. 원하는 제형 용량을 얻으려면 나노 입자를 PBS로 투석하고 보조제 첨가 전에 원심 진공 농축기를 사용하여 농축합니다. 샘플이 완전히 건조되지 않도록 이 작업을 수행할 때 주의하십시오 - 원심분리 중에 20-30분마다 샘플 부피를 확인하십시오.
3. 생물 안전 캐비닛에 멸균 조건에서 보조제를 추가합니다. 성공적인 통합을 평가하려면 분석 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 최종 제형과 그 성분을 분석하십시오.
   참고: 이러한 준비를 위해 PBS 버퍼(유속 0.5mL/m)에서 SEC 컬럼을 사용하고 UV-vis 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 용출을 검출했습니다. 혼입은 214 및 280 nm에서 보조제된 입자의 흡수와 보조제가 없는 입자의 흡수를 비교하여 평가되었습니다.
4. 동물 사용 전에 보조제가 있는 MOMP-tNLP와 빈 tNLP를 4°C에서 최대 14일 동안 보관하십시오. 새로운 tNLP 제형의 안정성을 완전히 평가하기 위해 SEC에 의해 저장된 tNLP를 주기적으로 분석합니다.
   참고: 안정성은 제형마다 다릅니다.

11. 혈청 검사

1. 암컷 3주령 마우스(BALB/c, n = 6)를 얻습니다.
2. 5 μg의 CpG 및 1 μg FSL-1 (주사 당 총 부피 = 50 mL)로 보조된 MOMP-tNLP의 형태로 10 μg의 MOMP로 각 뒷다리에 마우스를 근육 내 (im) 접종한다.
3. 예방 접종 후, 흉골 누운 상태를 유지할 수있을 때까지 생쥐를 관찰하십시오.
4. 초기 백신 접종 (프라임) 4 주 후, 5 μg의 CpG 및 1 μg FSL-1 (주사 당 총 부피 = 50 mL)로 보조된 MOMP-tNLP의 형태로 10 μg의 MOMP로 두 번째 (부스트) 동물에게 백신을 접종한다.
5. 초기 백신 접종 후 56일째에 혈액을 채취하여 항체 역가를 평가합니다. 자일라진(체중 0.3mg/20g)과 케타민(체중 3.0mg/20g) 용액을 주입하여 마우스를 마취하는 것으로 시작합니다. 앞다리와 뒷다리를 꼬집어 경련이 발생하지 않도록 합니다. 마취 중 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 주위에 바셀린을 바르십시오.
6. 미세 헤마토크릿 모세관을 사용하여 retro-orbital plexus에 구멍을 뚫습니다. 미세 원심 분리기 튜브에 혈액 100mL를 수집합니다.
7. 채혈 후 마취에서 회복되고 흉골 누운 상태를 유지할 수있을 때까지 마우스를 관찰하십시오.
8. 혈전을 실온에서 30분 동안 방치한 다음 2,000× g 에서 10분 동안 회전시킵니다. 혈청을 수집하고 -80°C에서 동결합니다.
9. 이때 클라미디아 무리다룸 으로 동물에게 도전하거나 안락사시킨다. 먼저 i.p. 자일라진(체중 0.3mg/20g)과 케타민(체중 3.0mg/20g) 용액을 주사한 후 경추 탈구를 합니다.
10. 상기와 같이 웨스턴 블롯팅 기술을 사용하여 MOMP에 특이적인 혈청 항체를 테스트합니다. 면역화된 모든 마우스에서 마우스 혈청을 풀링하고 1차 항체 대신 풀링된 혈청을 1:5,000 희석으로 사용합니다.

결과

무세포 반응물로부터 1 mL의 MOMP-tNLP의 Ni 친화도 정제의 SDS-PAGE 프로파일을 도 1B에 나타내었다. 이 반응은 MOMP와 Δ49ApoA1 단백질 모두에 대해 높은 수준의 발현을 초래했습니다. 이전 결과는 DMPC 및 텔로덴드리머의 존재 하에서 Δ49ApoA1의 무세포 발현이 텔로덴드리머 나노지단백질 입자(tNLP^)의 형성을 초래한다는 것을 보여주었습니다4. MOMP와 Δ49ApoA1의 동시 용출은 His-tag가 tNLP 스캐폴드 Δ49ApoA1에만 존재하고 MOMP에는 존재하지 않기 때문에 MOMP가 tNLP와 연관되어 있음을 나타냅니다. MOMP는 막 단백질의 가용화를 촉진하는 것으로 밝혀진 tNLP와의 복합체를 통해서만 용리될 수 있는 고불용성 단백질입니다.

MOMP-tNLP를 포함하는 용출 분획을 풀링하고 형광 기반 정량 장치 또는 단백질 정량에 대한 제조업체의 지침에 따라 280nm에서 흡광도를 통해 농도를 측정하는 장치를 사용하여 총 단백질 농도를 측정했습니다. MOMP 백신의 정확한 투여를 허용하기 위해, 정제된 복합체 중의 MOMP의 농도를 결정하는 것도 중요하다. 우리는 겔 밀도 측정법을 기반으로 MOMP를 정량화하는 방법을 개발했으며(그림 2), 알려진 농도의 정제된 재조합 MOMP를 표준으로 사용했습니다. 표준 곡선을 설정하고 MOMP-tNLP 샘플과 비교함으로써 MOMP 농도를 정확하게 정량화할 수 있습니다. 정제된 샘플의 MOMP 농도 측정은 다양한 규모로 cell-free 반응에서 MOMP의 수율을 추정할 수 있게 했으며, 이는 다운스트림 연구에 적합한 반응 설정을 계획하는 데 중요합니다(표 3).

MOMP는 강력한 면역 반응을 이끌어내기 위해 올리고머를 형성해야 한다¹¹. MOMP의 올리고머 상태를 테스트하기 위해, MOMP-tNLP는 열 및 환원제 dithiothreitol (DTT, 50 mM, 도 3A)의 존재 유무 하에서 분석되었다. MOMP의 고차 올리고머는 샘플이 열 및 DTT로 처리되지 않았을 때 SDS-PAGE를 통해 확인되었습니다. 비교해 보면, DTT의 존재 하에서 열로 처리된 샘플은 주로 겔 상에서 MOMP 및 Δ49ApoA1(각각 약 40 kDa 및 22 kDa)에 해당하는 두 개의 뚜렷한 밴드를 나타내었다. 이러한 결과는 MOMP의 올리고머 형성에 기인하는 겔 밴딩 패턴과 매우 유사하며, 이는 그 효과에 매우 중요합니다.

MOMP 단백질의 가변 도메인 상의 선형 에피토프에 대한 항체인 MAb40을 사용한 추가 웨스턴 블롯 분석은 유사한 밴딩 패턴을 나타내어 비변성 상태에서 MOMP 단백질에 의한 올리고머 형성을 확인했습니다(그림 3B). MOMP 올리고머 형성에 영향을 미치는 중요한 요인은 cell-free 반응 설정 동안 MOMP 플라스미드와 Δ49ApoA1 플라스미드 사이의 비율입니다. 표 4 는 플라스미드의 비율 및 tNLP에 대한 MOMP의 결과적인 삽입률을 나열한다. 이전의 연구들은 클라미디아 MOMP와 다른 외막 단백질이 주로 삼량체로 존재할 수 있음을 시사했다¹². 무세포 반응에서 삼량체 형성을 최대화하기 위해, ~25:1 MOMP 대 Δ49ApoA1 플라스미드 비율에 해당하는 NLP 당 3개의 MOMP 단백질에 가까운 삽입률을 갖는 것이 바람직하다.

도트 블롯 분석은 MOMP 및 tNLP의 존재를 검출하기 위한 보다 간소화된 방법으로 사용되었습니다. MAb40 항체를 사용하여 총 MOMP를 검출하였다. tNLP의 Δ49ApoA1 스캐폴드 상의 His-tag를 표적으로 하는 MAbHIS 항체를 사용하여 tNLP의 존재를 평가했습니다. MAb40 및 MAbHIS 항체의 공동 신호전달은 MOMP-tNLP 형성을 나타내었다. 대조군 반응은 빈 tNLP를 생성했으며, 이는 MAbHIS에서 양성 신호만 나타냈습니다(그림 3C). 무세포 반응에서 생성된 MOMP-tNLP의 면역원성을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 MOMP-tNLP를 CpG + FSL-1과 함께 보조하고, 상기와 같이 프라임-부스트 요법으로 마우스에 근육내(i.m.) 주사하였다. 면역화된 마우스로부터 혈청을 채취하고, 웨스턴 블랏 분석법을 이용하여 MOMP 특이적 IgG 항체를 측정하였다(도 4). 보조제 MOMP-tNLP를 주사한 마우스의 혈청은 강력한 MOMP 결합을 보였으며, 이는 MOMP-tNLP가 생체 내에서 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타냅니다.

그림 1: MOMP-tNLP의 발현 및 정제. (A) GFP 플라스미드가 없는 용해물(왼쪽)과 비교하여 UV 광원 하에서 발광하는 GFP 대조군을 성공적으로 발현한 무세포 반응의 작은 분취량을 포함하는 튜브의 이미지(왼쪽). (b) SDS-PAGE 후 루비프로 SYPRO로 단백질 염색한 겔은 MOMP-tNLP의 정제 프로파일을 나타낸다. MOMP는 40kDa에서 마이그레이션하고 49ApoA1은 22kDa에서 마이그레이션합니다. 약어: MOMP = 클라미디아 주요 외막 단백질; tNLP = 텔로덴드리머 나노지단백 입자; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP 복합체; GFP = 녹색 형광 단백질-코딩 플라스미드; MW = 분자량 마커; T = 총 무세포 용해물; FT = 플로우 스루; R1-R3 = 무세포 반응 분취량; W1, W6 = 세척 1 및 6; E1-E7 = 용합 1 내지 7; Δ49ApoA1 = 그의 태그가 붙은 마우스 ApoA1 유도체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: MOMP-tNLP 샘플에서 MOMP의 정량화. (a) MOMP의 정량화를 위해 SYPRO Ruby로 염색된 SDS-PAGE 겔. 농도가 알려진 재조합 MOMP를 겔 상에 로딩하여 표준 곡선을 얻었다. 각 레인은 0.1 μg, 0.5 μg, 1.0 μg, 2.0 μg 및 4.0 μg의 MOMP를 함유하였다. 정량화되고 있던 MOMP-tNLP 샘플을 동일한 겔에 로딩하였다. (B) MOMP 농도 표준곡선은 밀도계를 이용하여 생성하였다. 정규화된 대역 밀도와 MOMP의 양을 관련시키는 방정식이 설정되었습니다. 이 방정식은 미지의 샘플에서 MOMP 함량을 계산하는 데 사용되었습니다. 약어: MOMP = 클라미디아 주요 외막 단백질; tNLP = 텔로덴드리머 나노지단백 입자; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP 복합체; SDS-PAGE = 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 무세포 생산 MOMP-tNLP를 통해 MOMP는 고차 구조를 형성할 수 있습니다. (A) SYPRO Ruby로 염색된 열 및 환원제 DTT를 처리하거나 처리하지 않은 MOMP-tNLP의 SDS-PAGE 젤. 열과 DTT에서 MOMP는 열과 환원제가 대부분의 고차 MOMP 구조를 분해함에 따라 주로 ~40kDa에서 단량체 밴드로 나타났습니다. 열과 DTT가 없는 경우, 고차 밴드가 존재하여 MOMP 올리고머 형태를 나타냅니다. (b) MOMP-tNLP 및 MOMP 단독의 웨스턴 블롯, 열처리 및 DTT로 처리하지 않은 것. 전사 후, 멤브레인을 MAb40(1:1,000 희석)으로 프로브했습니다. SYPRO Ruby-염색 겔과 유사한 밴딩 패턴이 관찰되었으며, 이는 더 높은 분자량 밴드가 실제로 MOMP 올리고머임을 확인했습니다. (C) MAb40 및 MAbHIS로 조사된 MOMP-tNLP 및 빈 tNLP 샘플(중복)의 도트 블롯. 약어: MOMP = 클라미디아 주요 외막 단백질; tNLP = 텔로덴드리머 나노지단백 입자; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP 복합체; SDS-PAGE = 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; DTT = 디티오트레이톨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 무세포 생산 MOMP-tNLP는 면역원성이 높습니다. 면역화된 마우스로부터의 혈청은 강한 항-MOMP IgG 신호를 나타내었다. CpG + FSL-1과 함께 면역된 MOMP-tNLP를 마우스에 면역화하기 위해 사용하였다. 6마리의 면역화된 마우스의 혈청을 수집, 풀링하여 MOMP-tNLP를 조사하는 데 사용했습니다. 혈청은 웨스턴 블랏팅 분석에서 MOMP에 결합할 수 있었고 강한 IgG 신호를 보였다(왼쪽). MAb40을 1차 항체로 사용한 웨스턴 블롯(오른쪽)은 유사한 밴드를 나타내어 혈청에 MOMP 특이적 IgG가 포함되어 있음을 나타냅니다. 약어: MOMP = 클라미디아 주요 외막 단백질; tNLP = 텔로덴드리머 나노지단백 입자; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP 복합체; CpG = 콜레스테롤-변형된 CpG 보조제; FSL-1 = 친유성 보조제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

버퍼 이름	NaH2포4	염화나트륨(NaCl)	이미다졸	수소 이온 농도
바인딩 버퍼	50 밀리엠	300 밀리엠	10 밀리엠	8.0
세척 버퍼	50 밀리엠	300 밀리엠	20 밀리엠	8.0
용출 버퍼 1	50 밀리엠	300 밀리엠	250 밀리엠	8.0
용출 버퍼 2	50 밀리엠	300 밀리엠	500 밀리엠	8.0

표 1: 니켈 친화성 정제에 필요한 완충액 목록, 각 성분의 농도 및 pH를 자세히 설명합니다.

런타임	50 분
유량	6.0mL/분
그라데이션 유형	바이너리
버퍼 A	H2 중 10 mM TEAA 0
버퍼 B	증권 시세 표시기
그라데이션	% 버퍼 B
0 분	25%
30 분	60%
30.5 분	100%
40 분	100%
40.5 분	25%
50 분	25%

표 2: 콜레스테롤 변성 CpG의 역상 HPLC 정제를 위한 조건. 약어: TEAA = 트리에틸암모늄 아세테이트; MeCN = 아세토니트릴.

무세포 용해물(mL)	DMPC 지질(mg)	텔로덴드리머 (mg)	MOMP 플라스미드(μg)	정제된 MOMP 수율(mg)
1	4	0.4	15	0.5
2	8	0.8	30	1.1
3	12	1.2	45	1.6
5	20	2	75	2.7

표 3: 지질, 텔로덴드리머 및 플라스미드의 양은 상이하게 스케일링된 cell-free 반응에 사용되며 해당 수율입니다. 약어: MOMP = 클라미디아 주요 외막 단백질; DMPC = 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린.

플라스미드 투입 비율, MOMP : Δ49ApoA1		1:1	5:1	10:1	25:1	50:1	100:1
생산되는 단백질의 양의 비율, MOMP : Δ49ApoA1		0.02	0.32	0.64	3.46	6.55	20.04
tNLP당 예상 MOMP 삽입 횟수		0.03	0.37	0.75	4.04	7.65	23.39

표 4: 무세포 반응에서의 플라스미드 비율 및 생성된 MOMP 삽입률. 약어: MOMP = 클라미디아 주요 외막 단백질; tNLP = 텔로덴드리머 나노지단백 입자; Δ49ApoA1 = 그의 태그가 붙은 마우스 ApoA1 유도체.

토론

클라미디아는 남성과 여성 모두에게 영향을 미치는 가장 흔한 성병입니다. 클라미디아에 대한 백신 연구는 수십 년에 걸쳐 진행되고 있지만, 대량 생산까지 확대할 수 있는 안전하고 효과적인 백신은 여전히 찾기 어렵다¹³. 클라미디아 MOMP는 보호 백신 항원으로서 주요 후보로 간주됩니다. 그러나 MOMP는 소수성이 높고 잘못 접히기 쉽습니다^14,15. 추가 연구에 따르면 MOMP는 면역원성에 필수적인 올리고머 상태에 존재한다¹¹. 여기에 자세히 설명된 것은 tNLP 나노입자 내에 형성된 올리고머 MOMP를 백신으로 생산하는 검증된 무세포 동시 발현 방법으로, 용해물 3mL당 약 1.5mg의 정제된 MOMP를 수율로 제공합니다. 이 완전히 대조된 절차는 산업 생산을 위해 추가로 확장될 수 있어 백신 생성을 위한 유용한 접근 방식으로서의 전망을 높일 수 있습니다.

우리는 이전에 NLP ^3,16에 내장된 막 단백질을 생산하기 위해 무세포 발현을 사용하고 텔로덴드리머 안정화 디스크로 발현하는 방법에 대해 발표했습니다. 그러나 이 후자의 기술은 더 큰 이질성과 더 낮은 용해도를 갖는 막-단백질 입자를 생성했습니다. ⁴ 또한, MOMP-텔로덴드리머 입자의 면역원성은 MOMP-tNLP 입자에 비해 불분명하다⁶.

이 절차는 서브유닛 백신에 사용하기 위한 항원으로서 유망한 후보인 박테리아 막 단백질의 발현을 확장하는 데 적용할 수 있습니다. 이 절차는 가용화된 박테리아 막 단백질을 생성할 뿐만 아니라 전체 나노입자 구조는 콜레스테롤 부분에 접합된 CpG 또는 FSL-1을 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 친유성 백신 보조제를 사용하여 추가 변형이 가능합니다. 박테리아에서 다른 후보 항원의 발현은 가능하지만 최적의 수율을 달성하기 위해 발현 온도, 지질 선택 및 발현 시스템 유형과 같은 매개변수를 탐색해야 할 수 있습니다.

또한 플라스미드 선택과 비율은 이 과정에서 매우 중요합니다. 사용되는 두 플라스미드는 동일한 골격에서 구성되어야 합니다. 삽입물이 대략 동일한 길이인 경우, 비율은 여기에 기재된 바와 같이 첨가된 플라스미드의 질량에 기초할 수 있다. 그러나 몰을 기준으로 비율을 지정하면 특히 반응을 스케일링할 때 더 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 스크린 스케일 반응(< 0.5mL)에서 잘 작동하는 비율은 더 큰 반응에는 적용되지 않을 수 있으며 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. 비막 단백질은 여전히 cell-free 키트를 사용하여 발현할 수 있지만 가용성 제품을 생성하기 위해 지질 나노입자(동시 발현)가 필요하지 않을 수 있습니다. 추가로, 이 프로토콜은 CpG 및 FSL-1을 사용한 보조제를 설명하지만, 이 시스템은 다른 친유성 보조제와 함께 제형화하거나 원하는 대로 가용성 보조제와 혼합할 수 있습니다.

cell-free 발현 반응을 설정할 때 오염은 수율에 영향을 미칠 수 있으므로 피하는 것이 중요합니다. 플라스미드 자체를 포함하여 반응에 대한 모든 첨가제는 매우 순수해야 합니다. 또한 발현된 단백질은 내독소 오염이 없는 물질 및 용액과만 접촉해야 합니다. 후보 제형의 내독소 오염은 면역학적 분석의 일관되지 않고 가짜 결과를 초래할 수 있으며 충분한 양으로 유해할 수 있습니다. 여기에 설명되지는 않았지만 SDS-PAGE와 같은 후속 분석 단계에서 많은 오염 물질이 관찰되는 경우 니켈 친화성 크로마토그래피에 따른 추가 정제가 필요할 수 있습니다. 이것은 SEC를 사용하여 달성 할 수 있지만, 조건에 따라 제형별로 제형에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder	Avanti Polar Lipids	850345
1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes	Eppendorf	2600028
1 M Trizma hydrochloride solution	Millipore Sigma	T2194
Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7%	Millipore Sigma	695092
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Buffer Dam for XCell SureLock	Life Technologies	EI0012
C24 Incubator shaker	New Brunswick Scientific
Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit	BiotechRabbit	BR1400201
cOmplete His-Tag Purification Resin	Roche Molecular Diagnostics	5893682001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche Molecular Diagnostics	4693132001
CpG-ODN1826	Biosearch Technologies	T9449
D-(+)-Trehalose dihydrate	Millipore Sigma	71509
Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi	Millipore Sigma	71508-3
Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity	Bio-Rad	7311550EDU
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS)	Millipore Sigma	D8537
Electrophoresis Power Supply
Endosafe PTS cartridge	Thermo Fisher Scientific	NC9594798
Endosafe-PTS Testing System	Charles River
Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid
HCl and NaOH solutions for pH adjustment
HPLC with UV-vis diode array detector	Shimadzu
HyClone HyPure culture-grade water	VWR	82007-328
iBlot 2 Dry Blotting System	Life Technologies
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF	Life Technologies	IB24001
Image Studio V2.0 software	Li-COR Biiosciences
Imidazole	Millipore Sigma	I5513
Immun-Blot PVDF Membrane	Bio-Rad	1620177
LI-COR Odyssey Fc imager	Li-COR Biiosciences
Lyophilizer	Labconco
Methanol (≥99.9%)	Millipore Sigma	34860
Microcentrifuge
Microwave oven
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	NP000202
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	Life Technologies	NP0009
Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20	Li-COR Biosciences	927-50000
Orbital Shaker
PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)
PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)
pIVEX2.4d vector	Roche Molecular Diagnostics
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12162
Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4
Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody	Qiagen	34660
Probe sonicator
Qubit 3.0 Fluorometer	Life Technologies	Q33216
Qubit Protein Assay Kit	Life Technologies	Q33212
Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL	Rainin	17002428
Rainin Pipette tips: LTS 20 µL	Rainin	17002429
Rainin Pipette tips: LTS 200 µL	Rainin	17002426
Rainin Pipettes	Rainin
Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)	Li-COR Biosciences	926-32210
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Life Technologies	LC5925
Sodium chloride NaCl	Millipore Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic NaH2PO4	Millipore Sigma	S0751
Superdex 200, 5/150 GL column	Cytiva	GE28-9909-45
Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1	Invivogen	tlrl-fsl
SYPRO Ruby Protein Gel Stain	Life Technologies	S12001
TWEEN 20	Millipore Sigma	P1379
UV light source
Vacufuge Bench Top Centrifuge	Eppendorf
Vortexer
VWR 15 mL conicals (89039-666)	VWR
VWR 50 mL conicals (89039-656)	VWR
XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )	Life Technologies	EI0001