Manipulation du tuina pour réduire l’inflammation et la perte de cartilage chez les rats souffrant d’arthrose du genou

Résumé

Nous présentons un protocole de manipulation de Tuina réalisé sur des rats souffrant d’arthrose du genou induite par un plâtre. Sur la base des résultats préliminaires, il a suggéré que l’efficacité de la méthode reposait sur la réduction de l’inflammation et de la perte de cartilage.

Résumé

Les essais cliniques suggèrent que la manipulation du Tuina est efficace dans le traitement de l’arthrose du genou (KOA), tandis que d’autres études sont nécessaires pour découvrir son mécanisme. Par conséquent, la manipulation de modèles animaux d’arthrose du genou est essentielle. Ce protocole fournit un processus standard pour la manipulation du Tuina sur les rats KOA et une exploration préliminaire du mécanisme du Tuina pour le KOA. La méthode de manipulation de la presse et du pétrissage (une sorte de manipulation Tuina qui fait référence au pressage et au pétrissage de la zone spécifique de la surface du corps) est appliquée sur 5 points d’acupuncture autour de l’articulation du genou des rats. La force et la fréquence de la manipulation ont été normalisées par des enregistrements de la pression des doigts, et la position du rat pendant la manipulation est décrite en détail dans le protocole. L’effet de la manipulation peut être mesuré par des tests de comportement à la douleur et des résultats microscopiques dans le synovial et le cartilage. Les rats KOA ont montré une amélioration significative du comportement de la douleur. L’infiltration inflammatoire du tissu synovial a été réduite dans le groupe Tuina, et l’expression du facteur de nécrose tumorale (TNF)-α était significativement plus faible. Par rapport au groupe témoin, l’apoptose des chondrocytes était moindre dans le groupe Tuina. Cette étude fournit un protocole standardisé pour la manipulation du Tuina sur des rats KOA et des preuves préliminaires que les effets thérapeutiques du Tuina peuvent être liés à la réduction de l’inflammation synoviale et à l’apoptose retardée des chondrocytes.

Introduction

L’arthrose du genou (KOA) est une maladie dégénérative qui se manifeste principalement par des douleurs articulaires. La fibrose, la fissuration, l’ulcération et la perte de cartilage articulaire sont les principales causes de cette maladie¹. Le KOA a une prévalence élevée et peut avoir un impact profond sur la vie quotidienne des patients, entraînant une invalidité dans les cas graves. Chez les personnes âgées de 45 à 84 ans, la prévalence de KOA augmente avec l’âge, et la prévalence chez les personnes âgées de 85 ans et plus est de 15 %, avec une prédominance chez les femmes ^2,3. De plus, le KOA pourrait représenter un lourd fardeau économique à la fois pour l’individu et pour la société. Une enquête a montré que les coûts directs des soins de santé par habitant atteignaient jusqu’à 8 858 $ ± 5 120 $ par an⁴. Avec le vieillissement de la société, le KOA est devenu un problème de santé mondial et un enjeu sociétal majeur, ainsi qu’un sujet d’actualité pour la recherche scientifique.

Des études fondées sur des preuves ont montré l’efficacité de la manipulation de Tuina dans le traitement du KOA⁵. La manipulation du Tuina pourrait soulager la douleur et améliorer le dysfonctionnement chez les patients KOA, dont le mécanisme est lié aux effets anti-inflammatoires ^6,7. Les chercheurs ont découvert que la manipulation de Tuina inhibait efficacement l’expression des facteurs inflammatoires interleukine (IL)-β et 5-hydroxytryptamine et ralentissait la dégénérescence du cartilage articulaire chez un lapin KOA modèle⁸. Il a suggéré que Tuina pouvait favoriser la circulation sanguine et le métabolisme au site de la lésion, ce qui a aidé à éliminer les facteurs inflammatoires tels que l’IL-1, l’IL-6 et le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α, soulageant ainsi les symptômes cliniques de KOA⁹. De plus, le mouvement passif de l’articulation par la manipulation du Tuina peut favoriser la pénétration et la diffusion du liquide synovial dans le cartilage articulaire et améliorer le métabolisme des nutriments tissulaires¹⁰. D’autres études ont suggéré que la manipulation de Tuina peut améliorer efficacement les indices biomécaniques chez les patients KOA¹¹. Les manipulations appliquées sur les tissus mous peuvent améliorer la répartition du stress sur les membres et améliorer la fonction d’équilibre^12,13. Dans le même temps, avec quelques manipulations d’ajustement articulaire, l’alignement des membres inférieurs peut également être ajusté pour corriger les allures anormales^14,15.

Le mécanisme d’action de la manipulation du Tuina dans le traitement du KOA reste à explorer, et par conséquent, une étude expérimentale est nécessaire. La clé de l’application du Tuina chez les animaux de laboratoire est la standardisation des méthodes de modélisation, de fixation et d’intervention chez les animaux¹⁶. La méthode de modélisation détermine si l’animal de laboratoire peut présenter les caractéristiques de la maladie. Pendant ce temps, des méthodes de fixation appropriées peuvent faciliter l’intervention de la manipulation Tuina et mieux refléter l’effet de Tuina. La standardisation des méthodes d’intervention est la partie la plus difficile de la manipulation du Tuina. En 2010, le système de base des normes d’acupuncture chinoises mentionnait les normes de points d’acupuncture pour les animaux de laboratoire, offrant la possibilité d’opérations d’acupuncture et de Tuina dans l’expérimentation animale¹⁷. Cependant, il y a encore des difficultés à normaliser la manipulation du Tuina. Il existe plusieurs types de manipulation de Tuina¹⁸. Le choix de la manipulation spécifique dépend principalement de la maladie à traiter et des théories thérapeutiques préférées de l’interprète. Dans l’étude du Tuina pour le KOA, une plus grande attention a été accordée à la manipulation par pression de points (pression sur les points d’acupuncture spécifiques avec le pouce ou le coude), à la manipulation de poussée Yizhichan (une manipulation de poussée en remuant le pouce) et à la manipulation de la presse et du pétrissage (qui fait référence à la pression et au pétrissage de la zone spécifique de la surface du corps par le doigt ou la paume)¹⁹. La manipulation par presse et pétrissage est l’une des manipulations les plus utilisées par Tuina, qui combine le pressage et le pétrissage pour déplacer le tissu sous-cutané²⁰. La manipulation de la presse et du pétrissage appliquée sur les points d’acupuncture peut favoriser la circulation sanguine et soulager la douleur et représente l’effet thérapeutique du Tuina sur KOA¹⁹.

Dans ce protocole, le fonctionnement de la manipulation de la presse et du pétrissage sur les rats KOA sera décrit en détail, y compris les points d’acupuncture sélectionnés, l’intensité et la fréquence de la manipulation et la position du corps du rat, afin de fournir une référence pour les recherches futures.

Protocole

Cette étude a passé avec succès l’examen de l’éthique animale mené par le comité d’éthique des animaux expérimentaux de l’hôpital Yueyang de médecine traditionnelle chinoise et occidentale intégrée affiliée à l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (YYLAC-2022-166).

1. Préparation et regroupement d’animaux de laboratoire

1. Préparation des animaux
   1. Élever un total de 10 rats femelles SPF SD en bonne santé de 200-220 g à température ambiante (18-21 °C), humidité 40%-50%, 12 h : 12 h d’alternance du rythme circadien. Mener des expériences sur des animaux liés à la douleur dans le strict respect des dispositions pertinentes des directives et directives éthiques sur les animaux.
2. Groupement d’animaux
   1. Divisez au hasard les rats en deux groupes, le groupe Tuina et le groupe témoin. Traitez les rats du groupe Tuina avec une presse et une manipulation de pétrissage pendant 21 jours après le modelage. Placez les rats du groupe témoin dans la même pièce Tuina et placez-les simultanément dans un sac en tissu noir pendant que le groupe Tuina subit un traitement.

2. Modélisation des animaux

1. Anesthésier l’animal
   1. Utilisez l’isoflurane pour l’anesthésie gazeuse. Placez le rat dans la boîte d’induction avec une concentration d’induction de 3%. Secouez la boîte après avoir couché le rat et confirmez l’anesthésie lorsque le rat se retourne sans tenter de revenir à la position couchée.
   2. Retirez le rat de la boîte d’induction et fixez son nez dans le masque anesthésique. Ajustez la concentration d’isoflurane à 2 % pour maintenir l’anesthésie. Confirmez l’anesthésie lorsque le rat ne réagit pas lorsqu’il se pince les pattes. Appliquez une pommade oculaire sur les rats pour éviter la sécheresse lorsque les rats sont anesthésiés, car les paupières ne peuvent pas être fermées.
2. Méthode de modélisation²¹
   1. Utilisez une machine à raser pour enlever les poils du membre postérieur droit. Placez un coton médical entre la cheville droite et l’articulation de la hanche du rat. Fixez uniformément l’articulation droite du genou à l’extension de 180° avec 5 à 6 couches de pansement humide. Enroulez le bandage en spirale en partant de la cheville et en couvrant 1/3 du précédent. Utilisez un sèche-cheveux pour sécher et durcir le plâtre.
   2. Enveloppez le plâtre avec un matériau de base pour prothèses dentaires une fois que le pansement a séché et durci pour fixer le plâtre et l’empêcher de ronger.
   3. Mélangez les matériaux de base de la prothèse dentaire pour la rendre collante et faites adhérer le mélange à l’extérieur du pansement (le mélange ne doit pas dépasser le bord du pansement, Figure 1). Une fois que le mélange devient dur, éteignez l’appareil d’anesthésie et attendez que l’animal se réveille naturellement. Surveillez les rats pour éviter les accidents d’anesthésie avant qu’ils ne se réveillent.
   4. Fixez le pansement de manière appropriée sur la patte arrière droite du rat, car une fixation serrée restreint la circulation sanguine, tandis qu’une fixation lâche a tendance à tomber. Observez la circulation sanguine dans le membre terminal. Si vous détectez un gonflement de l’extrémité terminale ou un teint violet, coupez rapidement une partie du pansement pour aider à rétablir la circulation. Refaites le pansement s’il est cassé et ne parvient pas à maintenir l’extension du membre inférieur.
   5. Retirez le pansement après 3 semaines d’immobilisation continue. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper le matériau de base de la prothèse dentaire à l’extérieur et le pansement plâtré. Rincez le membre inférieur du rat avec du sérum physiologique et séchez-le avec de la gaze. S’il y a des lésions cutanées locales, stériliser avec de l’iodophore.
3. Vérification du modèle²²
   1. Vérification par rayons X
      1. Effectuer une radiographie du genou droit 1 jour après la fin de la modélisation. Prenez des radiographies antéropostérieures en décubitus dorsal avec flexion de la hanche à 30°, extension du genou à 0° et abduction de la hanche à 15°. Gardez la rotule directement devant le genou et placez le tube de radiateur à 110 mm de l’articulation du genou.
      2. Prenez des radiographies latérales en position de décubitus latéral droit avec la flexion de la hanche droite à 30° et l’extension du genou droit à 0°. Faites la flexion de la hanche du membre gauche à 70° et la flexion du genou à 45°, et placez le tube de radiateur à 110 mm de l’articulation du genou. Réglez les paramètres de détection comme tension d’exposition 50 kV, courant 250 mA, dose d’exposition 32 mAs et temps d’exposition 128 ms.
      3. Comparez avec la radiographie de rats normaux, vérifiez que la radiographie modélisée du genou montre un espace articulaire plus étroit avec une hyperplasie ostéophyte au bord.
   2. Société internationale de recherche sur l’arthrose (OARSI) :^{score de 23}
      1. Placez le rat dans la boîte d’euthanasie et perfusez du CO₂ à raison de 30 % à 70 % de volume de cage par minute. Arrêtez de perfuser le CO₂ après avoir détecté que le rat est immobile, qu’il ne respire pas et que la pupille est dilatée. Observez pendant encore 2 minutes pour confirmer la mort.
         REMARQUE : La luxation cervicale peut être pratiquée après une euthanasie à base de CO₂ comme forme secondaire pour confirmer le décès. Fixez le rat sur la table et saisissez sa queue d’une main. Appuyez sur la tête du rat avec le pouce et l’index de l’autre main. Confirmez la mort lorsque vous entendez le bruit d’un craquement, et le rat perd ses mouvements et son rythme cardiaque en même temps.
      2. Fixez le rat en position couchée sur le dos à l’aide d’une aiguille de seringue sur une planche en mousse avec le membre postérieur droit fléchi en abduction et rotation externe. Pincez la peau autour de l’articulation du genou avec des ciseaux chirurgicaux. Exposez les muscles autour de l’articulation du genou en coupant la peau, puis en coupant le fascia sous-cutané.
      3. Coupez la diaphyse du fémur et du tibia avec des ciseaux à os et retirez l’articulation du genou droit. Retirez délicatement les tissus mous supplémentaires, tels que les muscles et les ligaments, à l’extérieur de l’articulation.
      4. Fixer le joint dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 à 48 h à 4 °C. Détartrer l’articulation dans une solution d’acide formique à 10 % pendant 3 jours jusqu’à ce que le tissu osseux puisse être facilement piqué avec une aiguille.
      5. Placez et coupez le tissu détartré dans la hotte et transférez-le dans une boîte de déshydratation dans la machine de déshydratation. Ajouter 75 % d’éthanol pendant 4 h, puis 90 % d’éthanol pendant 2 h, puis 95 % d’éthanol pendant 1 h, de l’éthanol absolu pendant 30 min, une autre série d’éthanol absolu frais pendant 30 min, du benzène alcoolique pendant 5 à 10 min, du xylène pendant 5 à 10 min, une autre série de xylène frais pendant 5 à 10 min, de la cire pendant 1 h, une autre série de cire fraîche pendant 1 h, et dernier tour de cire fraîche pendant 1 h pour la déshydratation et l’immersion dans la cire transparente.
      6. Ensuite, placez le mouchoir dans la machine pour l’enrobage. Coupez le bloc de cire en tranches de cire de 4 μm après la prise de la paraffine et aplatissez la tranche dans de l’eau tiède. Placez la tranche sur une lame de verre et séchez-la. Conservez-le à température ambiante.
      7. Observez l’échantillon de cartilage et notez-le selon l’évaluation du grade d’histopathologie du cartilage de l’arthrose (tableau 1)²³. Si le score des rats après modélisation est significativement plus élevé que celui des rats normaux, la modélisation a réussi.

Tableau 1. Évaluation du grade d’histopathologie du cartilage arthrosique. Le grade est la progression de la profondeur dans le cartilage. Note totale = Note x Mise en scène. 0 pour les articulations normales, 24 pour l’arthrite sévère. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Graphique 1. Rats immobilisés dans le plâtre. Après l’anesthésie des rats, leurs membres inférieurs droits ont été enveloppés de bandages en plâtre, fixés en position hyperétendue et recouverts d’une couche de matériaux de base de prothèses dentaires à l’extérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Manipulation du tuina

1. Domaine d’application
   1. Sélectionnez un total de 5 points d’acupuncture sur le membre postérieur droit des rats, y compris ST34, ST35, SP10, EX-LE4 et BL40 (Figure 2). Localisez les points d’acupuncture selon les principes de positionnement des points d’acupuncture en ²⁴.
2. Position pour l’application
   1. Découpez un chiffon noir dans un sac de 9 cm x 15 cm avec une ouverture latérale et serrez l’ouverture avec une corde. Avant la manipulation du Tuina, tirez doucement sur la queue du rat pour qu’il s’enfouisse dans le sac et expose ses membres postérieurs à l’extérieur du sac.
   2. Utilisez une main pour maintenir le rat en position couchée, en tenant sa queue et sa patte arrière pendant que l’autre main applique une pression et une manipulation de pétrissage sur un point d’acupuncture spécifique (Figure 3).
3. Manipulation du Tuina
   1. Opérer la presse et la manipulation du pétrissage sur les 5 points d’acupuncture du membre postérieur droit pendant 2 min chacun. Placez le pouce de l’interprète sur le point d’acupuncture sélectionné pour effectuer une pression rythmique et un pétrissage, en rapprochant la peau et le tissu sous-cutané dans un mouvement circulaire.
   2. Utilisez des enregistrements de pression des doigts (unités en Newton) pour assurer une intensité et une fréquence constantes de la manipulation. Maintenez l’intensité entre 3 et 5 N et la fréquence à 2 Hz (Figure 4). Appliquez la manipulation une fois par jour pendant 21 jours.

Graphique 2. Position des points d’acupuncture. SP10 est situé à 5 mm au-dessus de l’articulation interne du genou chez le rat. ST34 est situé à 5 mm au-dessus de l’articulation externe du genou chez le rat. EX-LE4 est situé dans la face médiale du ligament du genou chez le rat. ST35 est situé sur la face latérale du ligament du genou chez le rat. BL40 est situé au milieu de la bande poplitée transversale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 3. Manipulation de Tuina appliquée sur des rats. Les rats ont été gardés dans un sac noir avec leurs membres postérieurs exposés. L’interprète tenait la queue du rat avec la main gauche tandis que la main droite effectuait la manipulation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 4. Enregistrements de la pression des doigts. Un appareil qui enregistre la force et la fréquence de la pression des doigts est utilisé pour un retour en temps réel sur l’intensité et la fréquence dans le processus de manipulation du Tuina. (A) Capteur de pression et équipement de transmission. (B) Enregistrements de la pression des doigts. (C) La force enregistrée lors de la manipulation de Tuina. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Tests de comportement à la douleur

1. Testez le comportement de la douleur avant et après la modélisation, et à 1 jour après (J1), 7 jours après (J7), 14 jours après (J14) et 21 jours après (J21) la manipulation de Tuina, y compris les tests de seuil de retrait mécanique et de latence de retrait des pattes.
2. Seuil de retrait mécanique (MWT)
   1. Placez les rats dans une cabine en verre trempé transparent de 20 cm x 10 cm x 20 cm située sur une scène de 40 cm de haut qui est constituée d’un treillis métallique d’une taille de 10 mm x 10 mm d’ouverture. Maintenez la température ambiante entre 23 °C ± 2 °C.
   2. Installer les rats dans le laboratoire comportemental pendant au moins 2 h par jour pendant la phase de test comportemental afin d’éviter toute interférence avec les résultats du test en raison du manque d’adaptation des animaux à l’environnement au début du test formel. Placez les rats dans le laboratoire comportemental pendant 30 minutes avant le début du test formel pour faciliter leur adaptation à l’environnement et réduire les facteurs de distraction.
   3. Utilisez des fibres électroniques de Von Frey pour mesurer le MWT. Stimulez le rat avec la fibre au centre de son pied et retirez la fibre lorsque le rat montre des mouvements évidents tels que lever la patte et éviter. La machine peut enregistrer automatiquement la valeur de pression maximale (N) à ce moment-là.
   4. Commencez la stimulation suivante chez le même rat au moins 15 s après la stimulation en cours. Ne pas dépasser 5 s lors de chaque stimulation pour éviter la sensibilisation aux stimuli tactiles dans les pattes des rats. Répétez le test 5 fois jusqu’à ce que la différence entre les trois mesures consécutives soit insignifiante (à moins de 10 N).
   5. Supprimez les valeurs présentant de grandes différences (les valeurs maximales et minimales) et prenez la moyenne des trois valeurs restantes comme seuil de retrait mécanique.
3. Latence de retrait de la patte (PWL)
   1. Placez les rats dans un petit compartiment en verre trempé transparent d’une taille de 20 cm x 10 cm x 20 cm. Couvrez le haut du compartiment avec un couvercle en verre transparent avec des trous d’aération. Maintenez la température de la plaque de verre transparente à 28-30 °C, sur laquelle le compartiment est placé.
   2. Installez les rats dans cet environnement pendant au moins 30 minutes pour qu’ils s’acclimatent avant le début de chaque test formel. Si les rats urinent ou défèquent dans le compartiment, nettoyez-le à temps avec du papier absorbant pour éviter d’affecter le transfert de chaleur par rayonnement lumineux qui s’ensuit.
   3. Concentrez le projecteur sur le centre de la patte de rat et appuyez sur le bouton Démarrer . Appuyez sur le bouton Stop lorsque le rat montre des comportements évidents tels que la rétraction du pied ou le léchage des pattes et enregistrez l’heure à ce stade. Le temps d’irradiation du projecteur ne doit pas dépasser 20 s pour éviter d’endommager la peau du rat.
   4. Effectuez la prochaine irradiation sur le même rat après au moins 10 minutes pour éviter la sensibilisation. Mesurez 5x sur chaque rat.
   5. Supprimez les valeurs présentant de grandes différences (la valeur maximale et la valeur minimale). Prenez la moyenne des valeurs restantes comme PWL.

5. Préparation de l’échantillon

1. Pratiquer l’euthanasie sur la souris comme décrit au point 2.3.2.1.
2. Préparation de la membrane synoviale
   1. Fixez le rat en position couchée sur le dos à l’aide d’une aiguille de seringue sur une planche de mousse avec le membre postérieur droit fléchi lors de l’abduction et de la rotation externe. Pincez la peau autour de l’articulation du genou avec des ciseaux chirurgicaux et exposez les muscles autour de l’articulation du genou des rats en coupant la peau, puis en coupant le fascia sous-cutané.
   2. Prenez le ligament rotulien comme point de repère pour dépouiller les groupes musculaires au-dessus du ligament rotulien. Inciser soigneusement l’extrémité du ligament rotulien (au niveau de la tubérosité tibiale) et trouver la membrane synoviale lorsque le ligament est pincé vers le haut par le bas.
   3. Coupez soigneusement le tissu synovial avec des ciseaux ophtalmiques et rincez le sang et le liquide synovial avec une solution saline pré-refroidie. Fixez la membrane synoviale dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 48 h après avoir absorbé l’eau de la surface du tissu avec une gaze propre.
   4. Préparez l’échantillon comme indiqué aux étapes 2.3.2.5 à 2.3.2.6. Effectuez la notation comme à l’étape 2.3.2.7.
3. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine
   1. Épaffiner dans l’eau avec du xylène pendant 20 min, remplacer par un autre tour de xylène frais pendant 20 min, suivi d’un traitement à l’éthanol anhydre pendant 5 min, remplacer par un autre tour d’éthanol anhydre frais pendant 5 min, puis ajouter 90% d’éthanol en volume pendant 5 min, 80% d’éthanol en volume pendant 5 min, 70% d’éthanol en volume pendant 5 min, et enfin de l’eau distillée pendant 5 min.
   2. Plongez la lame dans une solution de coloration à l’hématoxyline pendant 3 à 8 minutes. Retirez la lame et rincez la tache à l’eau distillée. Déplacez-le dans le liquide de différenciation (alcool acide chlorhydrique à 1 %) pendant près de 30 s, de sorte que la lame s’estompe en bleu pâle. Rincez-le à l’eau distillée et placez-le dans une solution de coloration à l’éosine pendant 1 à 3 minutes.
   3. Déshydrater la lame avec une fraction volumique d’éthanol à 95 % pendant 5 min, la remplacer par une autre série d’éthanol frais à 95 % pendant 5 min, suivie d’éthanol anhydre pendant 5 min, remplacer par une autre série d’éthanol anhydre frais pendant 5 min.
   4. Rendez la lame transparente en ajoutant du xylène pendant 5 min, remplacez-la par un autre rond de xylène frais pendant 5 min, puis scellez-la avec de la résine neutre.
4. Marquage de l’extrémité de l’entaille médiée par la désoxynucléotidyl transférase terminale (TUNEL) sur le cartilage
   1. Déshydrater l’échantillon de cartilage dans de l’éthanol anhydre, de l’éthanol à 90 %, de l’éthanol à 85 % et de l’éthanol à 75 % jusqu’à ce que l’hydratation de déparaffinage soit terminée. Faire tremper dans le PBS pendant 5 min. Ajouter 3% H2 O₂ goutte à goutte pendant 10 min.
   2. Ajouter la protéinase K, solution de travail goutte à goutte et digérer à 37 °C pendant 10 min. Ajouter 20 μL de tampon d’étiquetage par tranche pour le garder humide et secouer l’excès de liquide après avoir préparé la solution de travail. Ajouter 20 μL de solution de travail à chaque lame et incuber pendant 2 h à 37 °C dans une boîte humide.
   3. Ajouter 50 μL de solution de fermeture goutte à goutte et fermer pendant 30 min. Ajouter ensuite 50 μL d’anticorps anti-digoxine biotinylé dilué (dilution 1 :100) goutte à goutte et incuber à 37 °C pendant 2 h dans une boîte humide. Ajouter 10 μL de diluant pour anticorps SABC (dilution 1 :100) goutte à goutte et incuber à 37 °C pendant 2 h dans une boîte humide.
   4. Ajouter la solution de développement de couleurs DAB (50 μL de réactifs A, B et C dans 1000 μL d’eau distillée) goutte à goutte pendant 10 à 15 min. Le développement de la couleur se termine lorsqu’il est granulaire jaune brunâtre.
   5. Recolorer avec de l’hématoxyline pendant 3 s. Après une déshydratation en gradient et un traitement transparent, séchez à température ambiante et scellez soigneusement la lame avec de la gomme neutre. Faites attention à ne pas laisser de bulles et de colle qui déborde.
5. Analyse immunohistochimique de l’IL-1β et du TNF-α
   1. Cépatisser régulièrement les lames dans du xylène et les hydrater dans de l’alcool de gradient. Inactiver la peroxydase endogène dans les coupes avec 3% H 2O₂. Placez le porte-lames dans un tampon de citrate à 95 °C (pH 6,0) et incubez-le au bain-marie à une température supérieure à 95 °C pendant plus de 20 minutes. Sortez la boîte d’incubation et laissez-la à température ambiante pendant au moins 20 min.
   2. Incuber 5 % de sérum de chèvre normal avec du PBS pendant 10 min à 37 °C et secouer l’excès de liquide. Ajouter 150 μL d’anticorps I goutte à goutte et laisser reposer à 37 °C pendant 1 h, puis conserver toute la nuit à 4 °C. Le lendemain, réchauffer à 37 °C pendant 45 min.
   3. Laver 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Recouvrez le tissu de la lame avec 3 % de BSA et fermez-le à 37 °C pendant 30 min. Ajouter 150 μL d’anticorps II goutte à goutte et laisser reposer à température ambiante pendant 1 h. Laver 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacun et ajouter 150 pL de liquide de développement des couleurs DAB goutte à goutte. Observez le degré de coloration au microscope jusqu’à ce que l’échantillon devienne jaune brunâtre, même à l’œil nu.
   4. Rincez immédiatement avec du PBS pendant 10 min. Teindre à nouveau avec de l’hématoxyline, déshydrater dans de l’alcool dégradé, rendre les lames transparentes dans du xylène et sceller avec de la gomme neutre.
6. Analyse statistique
   1. Les coupes colorées immunohistochimiquement avec une expression positive de la protéine associée sont jaunes ou jaune brunâtre. Évaluez l’intensité de l’expression positive par le logiciel Image J pour chaque groupe de coupes immunohistochimiques et utilisez les critères d’évaluation de la densité optique moyenne (AOD), calculée par IOD divisé par la surface.
   2. Utilisez un logiciel d’analyse pour l’analyse statistique. Utilisez le test t si les données sont conformes à la distribution normale et au khi-deux et utilisez le test non paramétrique si elles ne sont pas conformes à la distribution normale. Analysez les données de mesure répétées à l’aide d’équations d’estimation généralisées.

Résultats

Tests de comportement à la douleur
Les résultats de la MWT ont montré que la MWT du membre postérieur droit après modélisation était significativement plus faible qu’avant (p<0,05). Par rapport au groupe témoin, le MWT des rats était significativement élevé après Tuina (p<0,05 ; Figure 5 et tableau 2).

Discussion

Cette étude fournit un protocole pour la manipulation du Tuina sur des rats KOA. Grâce à des tests de comportement à la douleur et à des résultats histomorphologiques, il a suggéré qu’une telle série de manipulations de Tuina appliquées à des rats KOA pourrait réduire l’inflammation synoviale et l’apoptose du cartilage, ce qui pourrait être une référence de la manipulation de Tuina sur des modèles animaux de KOA.

Il y a plusieurs procédures critiques au cours du protocol...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
absolute ethanol	Supelco	PHR1070	For making specimen
ALMEMO admeasuring apparatus	ahlborn	2450-1	For Mechanical Withdrawal Threshold test
Anti-Digoxin antibody	Sigma-Aldrich	SAB4200669	For HE stain IHC or TUNEL
Anti-IL-1 beta	abcam	ab283818	For HE stain IHC or TUNEL
DAB Substrate kit	Solarbio	DA1010	For HE stain IHC or TUNEL
Denture base materials	Shanghai New Century	20000356	For model making
eosin	bioswamp	PAB180016	For HE stain IHC or TUNEL
Finger pressure recordings	Suzhou Changxian Optoelectronic Technology	CX1003w	For Tuina manipulation
formic acid solution	Sigma-Aldrich	695076	For decalcification
H2O2	Sigma-Aldrich	386790-M	For HE stain IHC or TUNEL
hematoxylin	bioswamp	PAB180015	For HE stain IHC or TUNEL
Isoflurane	Shanghai Yuyan Scientific Instrument Company	S10010533	For gas anesthesia
neutral resins	bioswamp	PAB180017	For HE stain IHC or TUNEL
Paraformaldehyde Fix Solution	Sigma-Aldrich	100496	For histology
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	For HE stain IHC or TUNEL
Plantar Test Apparatus	IITC Life Science	/	For Paw Withdrawal Latency test
plaster of Paris bandage	WANDE	20150023	For model making
Proteinase K	Sigma-Aldrich	124568	For HE stain IHC or TUNEL
TNF Alpha Monoclonal antibody	Proteintech	60291-1-Ig	For HE stain IHC or TUNEL
TUNEL	Servicebio	GDP1042	For HE stain IHC or TUNEL
Wax	Sigma-Aldrich	327204	For making specimen
xylene	Shanghai Sinopharm Group	100092	For making specimen