Induction de lésions alcalines cornéennes et limbiques à l’aide d’une technique de poinçonnage-tréphine dans un modèle murin

Résumé

Ce protocole décrit une méthode permettant d’induire une lésion alcaline cornéenne et limbique précise et reproductible dans un modèle murin. Le protocole est avantageux car il permet une lésion uniformément répartie sur la cornée et le limbe de la souris, très incurvés.

Résumé

La cornée est essentielle à la vision, et la cicatrisation de la cornée après un traumatisme est fondamentale pour maintenir sa transparence et sa fonction. Grâce à l’étude de modèles de lésions cornéennes, les chercheurs visent à améliorer leur compréhension de la façon dont la cornée guérit et à développer des stratégies pour prévenir et gérer les opacités cornéennes. La lésion chimique est l’un des modèles de blessures les plus populaires qui a fait l’objet d’études approfondies sur des souris. La plupart des chercheurs précédents ont utilisé un papier plat imbibé d’hydroxyde de sodium pour induire des lésions cornéennes. Cependant, l’induction de lésions cornéennes et limbiques à l’aide d’un papier filtre plat n’est pas fiable, car la cornée de la souris est très courbée. Nous présentons ici un nouvel instrument, un poinçon de biopsie modifié, qui permet aux chercheurs de créer une lésion alcaline bien circonscrite, localisée et uniformément répartie sur la cornée et le limbe murins. Cette méthode de poinçonnage-tréphine permet aux chercheurs d’induire une brûlure chimique précise et reproductible sur l’ensemble de la cornée et du limbe murins tout en laissant d’autres structures, telles que les paupières, non affectées par le produit chimique. De plus, cette étude introduit une technique d’énucléation qui préserve la caroncule médiale comme point de repère pour l’identification de la face nasale du globe. La conjonctive bulbaire et palpébrale et la glande lacrymale sont également maintenues intactes grâce à cette technique. Des examens ophtalmologiques ont été effectués à l’aide d’un biomicroscope à lampe à fente et d’une coloration à la fluorescéine aux jours 0, 1, 2, 6, 8 et 14 après la blessure. Les résultats cliniques, histologiques et immunohistochimiques ont confirmé une déficience en cellules souches limbiques et un échec de la régénération de la surface oculaire chez toutes les souris expérimentales. Le modèle de lésion cornéenne alcaline présenté est idéal pour étudier le déficit en cellules souches limbiques, l’inflammation cornéenne et la fibrose. Cette méthode convient également à l’étude de l’efficacité préclinique et clinique des médicaments ophtalmologiques topiques sur la surface cornéenne murine.

Introduction

La cornée est essentielle à la vision et présente des caractéristiques uniques, notamment la transparence, qui est une condition préalable à une vision claire. En plus de jouer un rôle protecteur majeur, la cornée représente les 2/3 de la puissance réfractive de l’œil¹. En raison de leur rôle important dans la vision, les lésions cornéennes et l’opacité entraînent un déclin visuel important et sont responsables de la deuxième cause de cécité évitable dans le monde ^2,3. Dans les lésions cornéennes avec dysfonctionnement limbique sévère, la fonction barrière du limbe diminue, ce qui entraîne la migration des cellules conjonctivales vers la surface cornéenne et la conjonctivalisation cornéenne ^4,5, ce qui compromet considérablement la vision. Des stratégies préventives et thérapeutiques efficaces sont donc nécessaires pour s’attaquer au fardeau mondial de la cécité cornéenne et de l’invalidité associée.

La compréhension actuelle du processus de cicatrisation des plaies cornéennes humaines est basée sur des études antérieures qui ont étudié les réponses cornéennes à diverses blessures. Plusieurs techniques et modèles animaux ont été utilisés pour induire diverses lésions cornéennes chimiques ou mécaniques 6,7,8,9 et pour étudier divers aspects du processus de cicatrisation des plaies cornéennes.

Le modèle de brûlure alcaline est un modèle de blessure bien établi qui est réalisé en appliquant de l’hydroxyde de sodium (NaOH) sur la surface cornéenne directement ou en utilisant du papier filtre plat¹⁰. Une lésion alcaline entraîne la libération de médiateurs pro-inflammatoires et l’infiltration de cellules polymorphonucléaires non seulement dans la cornée et la chambre antérieure de l’œil, mais aussi dans la rétine. Cela induit une apoptose involontaire des cellules ganglionnaires de la rétine et une activation des cellules CD45^{+ 11}. Par conséquent, il est essentiel de localiser précisément le site de la blessure pour éviter des blessures involontaires excessives à l’aide d’un modèle de lésion alcaline.

La longueur axiale du globe oculaire murin est d’environ 3 mm¹². En raison de cette courte distance entre la cornée et la rétine, une courbure cornéenne abrupte existe pour fournir un pouvoir de réfraction élevé afin de concentrer la lumière sur la rétine (Figure 1A). Comme nous l’avons déjà signalé¹³, il est difficile d’induire des lésions chimiques sur cette surface très incurvée à l’aide d’un papier filtre plat, en particulier au niveau du limbe (Figure 1B). Pour provoquer une blessure au limbe, il faut incliner le papier filtre, ce qui peut causer des blessures involontaires au fornix et à la conjonctive adjacente¹⁴. Une autre approche consiste à appliquer directement l’agent chimique sous forme de gouttes sur la surface cornéenne. Cependant, cette méthode manque de contrôle sur le temps d’exposition et il existe un risque potentiel d’induire des lésions de la conjonctive, du fornix et des paupières en raison de la diffusion du liquide dans ces zones.

Pour surmonter ces limitations, cette étude présente une nouvelle méthode de poinçonnage-tréphine pour induire des blessures. Cette technique présente plusieurs avantages, notamment (i) l’induction d’une lésion chimique efficace sur l’ensemble de la surface cornéenne et du limbe dans un modèle murin, (ii) l’induction d’une lésion localisée et bien circonscrite de la cornée, (iii) la possibilité d’appliquer n’importe quel liquide d’intérêt pendant une durée prédéterminée, et (iv) la capacité d’induire différentes tailles de lésions cornéennes en sélectionnant des poinçons de biopsie appropriés. Cette méthode est également réalisable pour les modèles de blessures de rats et de lapins, qui présentent également une surface cornéenne incurvée et sont des modèles animaux couramment utilisés pour étudier la cicatrisation des plaies de la surface oculaire.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au numéro 33420 de l’APLAC de Stanford sur les soins aux animaux de laboratoire, utilisation d’animaux à des fins scientifiques, et à la déclaration ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Au total, 10 souris C57BL/6 mâles et femelles âgées de 8 à 12 semaines ont été généreusement fournies par le laboratoire d’Irving L. Weissman. Les animaux ont été acclimatés à un cycle lumière-obscurité de 12 h et ont reçu de l’eau et de la nourriture ad libitum. Une blessure a été causée à un œil de l’animal.

1. Préparation de l’expérience

1. Préparation des matériaux
   REMARQUE : Tous les réactifs doivent être conservés à température ambiante.
   1. Préparez le poinçon à tréphine : Préparez un poinçon de biopsie d’un diamètre de 3,5 mm et marquez la tige du poinçon à 5 mm de son bord distal. Fixez fermement le poinçon et coupez la partie distale marquée de son arbre à l’aide d’un outil rotatif à deux vitesses. Portez une protection oculaire pendant ce processus. Coupez l’arbre à 3,5 mm de profondeur et laissez le dernier 1,5 mm attaché. Pliez la pointe à 90°, comme illustré à la Figure 1.
   2. Préparer une solution de NaOH à 0,5 M en dissolvant 1 g de NaOH dans 50 mL d’eau distillée.
   3. Préparer 10 mL de cocktail anesthésique en combinant 2 mL de kétamine à 100 mg/mL et 1 mL de xylazine à 20 mg/mL. Avant l’injection, diluer ce mélange avec 7 mL de NaCl à 0,9 % (solution saline normale).
   4. Préparer une solution de fluorescéine sodique à 0,1 % en ajoutant 0,1 mL de liquide fluorescent AK-Fluor à 10 % dans 9,9 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (1x PBS).
   5. Préparez PBS (1x) en dissolvant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ et 0,23 g de NaH₂PO₄dans 900 mL d’eau distillée. Ajustez le pH de la solution à 7,4. Amener la solution à un volume final de 1 L en ajoutant de l’eau distillée.
   6. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pour la fixation. Sous une hotte chimique, dissoudre 2 g de PFA dans 45 mL de PBS. Chauffez le mélange à 65 °C et titrez son pH à 7,4. Une fois le PFA dissous, porter la solution à un volume final de 50 ml.

2. Préparation des animaux

1. Peser la souris pour déterminer le volume approprié de cocktail anesthésique injectable pour injection. Après avoir manipulé et retenu correctement la souris comme décrit dans Machholz et ^al.15, administrer le cocktail anesthésique par voie intrapéritonéale (IP) à une dose de 0,01 mL/g^16,17. Ciblez les quadrants abdominaux inférieurs pour l’injection d’IP afin d’éviter d’endommager les organes.
2. Injecter de la buprénorphine en suspension injectable à libération prolongée (3,25 mg/kg) par voie sous-cutanée pour une analgésie supplémentaire pendant et après la chirurgie, car les lésions alcalines cornéennes sont extrêmement douloureuses.
3. Attendez qu’un plan d’anesthésie profond soit atteint. Vérifiez s’il n’y a pas de réponse au pincement des orteils comme indication d’un plan d’anesthésie profond réussi. Appliquez une pommade oculaire simple pour l’œil controlatéral afin de l’empêcher de se dessécher avant de commencer la chirurgie.
4. Après l’anesthésie, placez la souris sur la table d’opération préparée selon les principes standard de la chirurgie des rongeurs¹⁸. Placez un oreiller de 5 mm de haut sous la tête du rongeur, positionné en position de décubitus latéral. L’oreiller aide à soutenir la tête du rongeur pendant la chirurgie.
5. Administrer des gouttes ophtalmiques de chlorhydrate de tétracaïne (0,5 %) pour une anesthésie supplémentaire. Séchez correctement la surface oculaire à l’aide d’une lance chirurgicale et coupez les cils.

3. Induction d’une lésion alcaline

1. Avant de commencer la chirurgie, organisez la table d’opération selon les principes standard de la chirurgie des rongeurs^18,19 et gardez le champ opératoire stérile pendant la chirurgie. Positionnez le microscope chirurgical pour bien visualiser la souris anesthésiée et réglez la minuterie sur 30 s. Placez une serviette en papier torsadée sur le museau de l’animal pour éviter une aspiration nasale involontaire pendant le processus de rinçage.
2. Déterminez la circonférence de la zone limbique à l’aide du microscope chirurgical tout en vous assurant que les paupières de la souris sont grandes ouvertes à l’aide du pouce et de l’index. Tenez doucement la tréphine de poinçon propre parallèle à l’axe de l’œil, sans appliquer de pression vers le bas. Évitez de faire tournoyer l’instrument et maintenez l’axe de la tréphine perforante parallèle à l’axe du globe.
3. Demandez à l’assistant chirurgical de déposer 3 gouttes de solution de NaOH (soit 40 μL) dans le trou de la tréphine pour remplir l’outil et couvrir la surface cornéenne de manière appropriée. La tension superficielle du liquide empêche toute fuite hors de l’instrument (Figure 1).
   REMARQUE : Nous avons utilisé une seringue de 1 mm avec une aiguille de 27G avec une pointe aplatie inclinée à 50° pour déposer délicatement la solution de NaOH.
4. Après 30 s, rincer immédiatement la cornée et le fornix avec 5 mL de PBS (1x). La vidéo 1 montre la procédure à suivre pour provoquer une lésion chimique.
5. Utilisez un papier indicateur de pH universel pour assurer un pH de 7 à 7,5 sur la surface cornéenne de l’œil blessé. Ensuite, appliquez la pommade ophtalmique triple antibiotique sur la surface oculaire chimiquement endommagée.
   REMARQUE : Le mouvement de la queue pendant la chirurgie est un signe de faible profondeur d’anesthésie. Appliquer un cocktail anesthésique supplémentaire (kétamine + xylazine) en injectant un anesthésique [bolus IP (50% du volume initial)].
6. Après la chirurgie, confirmez que la souris est dans un état stable. Administrer une deuxième buprénorphine si l’animal souffre. Utiliser la même technique de manipulation qu’en 2.2. Commencer l’examen postopératoire pendant que l’animal est sous anesthésie.
7. Après l’intervention, lavez, séchez et désinfectez la tréphine à poinçon et la table d’opération avec 70 % d’éthanol.

4. Évaluation clinique

1. Pour l’examen, anesthésiez la souris comme décrit précédemment à l’étape 2.1.
2. Examinez les yeux (blessés et non blessés) à l’aide d’un biomicroscope à lampe à fente. Utilisez un appareil photo pour prendre des photos (dans cette étude, l’appareil photo d’un téléphone en mode Cinématique a été utilisé).
3. Score d’opacité cornéenne selon le système de classification de Yoeruek²⁰ : 0 = cornée normale et claire ; 1 = opacité légère ; 2 = plus grande opacité, mais l’iris et la pupille sont facilement reconnaissables ; 3 = l’iris et la pupille sont à peine discernables ; 4 = la cornée est complètement opaque avec une pupille invisible.
4. Appliquez des gouttes ophtalmiques à 0,1 % de fluorescéine. Séchez l’excès de liquide fluorescent à l’aide d’un applicateur en coton et évaluez la présence de défauts épithéliaux cornéens à l’aide du filtre bleu cobalt. Prenez des photos.
5. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne suffisamment conscience pour maintenir sa position couchée sternale. Ne réintroduisez pas l’animal auprès d’autres animaux tant qu’il n’est pas complètement rétabli.

5. Énucléation

1. Euthanasier les souris 2 semaines après l’induction d’une lésion chimique par luxation cervicale en 3 à 5 s²¹.
2. Énucléer l’œil tout en préservant la caroncule médiale et la conjonctive palpébrale entière dans l’ordre suivant, comme le montre la vidéo 2.
3. Au microscope chirurgical, disséquez soigneusement la jonction de la caroncule et de la peau. À l’aide d’une pince à dents, rétractez la caroncule et guidez la pointe des ciseaux chirurgicaux sous la conjonctive palpébrale vers sa jonction avec la plaque tarsienne.
4. Coupez la conjonctive le long de la ligne d’adhérence vers le canthus latéral. Ensuite, tournez les ciseaux chirurgicaux jusqu’à la jonction de la conjonctive et de la plaque tarsienne inférieure au niveau du plan sous-conjonctival.
5. Après avoir terminé la dissection conjonctivale, rétractez les paupières supérieures et inférieures du côté nasal avec le pouce et l’index. Tout en vous rétractant, guidez la pointe d’une pince à épiler à pointe incurvée derrière le gland lacrymal saillant vers le nerf optique. Saisissez fermement le nerf optique et extrayez le globe (Figure 2).
6. Rincez le globe avec du PBS (1x) et transférez-le dans la solution de fixation.

6. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et à l’acide périodique (PAS)

1. Fixez les globes dans une solution de formol à 10 % pendant la nuit à température ambiante.
2. Déshydratez les tissus à l’aide d’une série séquentielle d’alcool gradué avec des concentrations de 70 % d’éthanol, 80 % d’éthanol, 90 % d’éthanol et 100 % d’éthanol, chacun pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, plongez les yeux dans le xylène pendant 10 min. Enfin, enveloppez les yeux dans de la paraffine.
3. Sectionnez les blocs de paraffine en tranches de 6 μm d’épaisseur et montez-les sur des lames de microscope en verre pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et à l’acide périodique de Schiff (PAS), comme décrit dans le fichier supplémentaire 1.

7. Imagerie et analyse par immunofluorescence

1. Pour les études d’immunohistochimie (IHC), fixer les yeux dans 1 mL de PBS (1x) contenant 4 % de PFA à 4 °C pendant la nuit. Laver l’échantillon 3 fois dans 1 mL de PBS (1 fois) pendant 5 min chacun.
2. Pour empêcher la formation de cristaux de glace et protéger les structures moléculaires des protéines, effectuez une saturation en série du saccharose avec des concentrations de 10 % de saccharose, 20 % de saccharose et 30 % de saccharose dans le PBS. Intégrer les globes dans une solution de tomographie par cohérence optique (OCT ; Figure 2) et conservez-les à -80 °C.
3. Sectionnez le bloc OCT en tranches de 12 μm d’épaisseur et montez-le sur des lames de microscope en verre pour la coloration IHC.
4. Perméabiliser des coupes de tissus sur des lames de microscope dans 0,1 % de Triton X −100 dans du PBS (1x) pendant 15 min. Ensuite, bloquez les antigènes non spécifiques avec 5 % de BSA dans le PBS (1x) pendant 1 h supplémentaire à température ambiante.
5. Incuber des coupes de tissus sur des lames de microscope à 4 °C pendant une nuit dans le cocktail des anticorps primaires ciblés préparés dans du PBS (1x) contenant 1 % de BSA. Dans cette expérience, les anticorps primaires étaient des anticorps anti-kératine 13 (K13) et anti-kératine 12 (K12) de lapin dilués au format 1 :100 avec des concentrations de 2,24 μg/mL et 1,56 μg/mL, respectivement.
6. Après l’incubation, laver les coupes de tissus sur les lames de microscope 3 fois avec du PBS (1 fois). Par la suite, détecter les anticorps primaires liés avec des anti-IgG d’âne dilués à 1 :500. Incuber avec l’anticorps secondaire à 4 °C pendant 1 h dans l’obscurité. Laver ensuite au PBS (1x) 3x pendant 5 min chacun.
7. Appliquer une goutte de milieu d’enrobage de fluorescence anti-décoloration contenant du DAPI sur les coupes de tissu au microscope et recouvrir d’une lamelle. Laissez les échantillons sécher dans l’obscurité et examinez-les au microscope fluorescent avec le même réglage laser pour les yeux normaux et les yeux blessés.

Résultats

L’efficacité de la méthode dans l’induction d’une déficience en cellules souches limbiques (LSCD) a été évaluée en évaluant les signes cliniques et histologiques de la LSCD. L’évaluation clinique a été réalisée par microscopie à lampe à fente et par tomographie par cohérence optique du segment antérieur (AS-OCT) (Figure 3 et Figure 4).

La réépithélialisation s’est produite de manière centripète et a été plus rapide au niveau de la partie temporale de la cornée par rapport à sa partie nasale. Les yeux blessés ont développé un voile cornéen 2⁺-3⁺ immédiatement après la lésion chimique (Figure 3). Les cellules épithéliales ont migré de la conjonctive vers la surface cornéenne à la suite d’une lésion limbique. La grande anomalie épithéliale cornéenne a été complètement réépithélialisée aux jours 12 à 14, ce qui a pris plus de temps qu’une lésion épithéliale cornéenne de taille similaire et de membrane basale et de stroma intacts qui guérissaient généralement dans les 5 jours suivant la lésion ^8,9. En raison du LSCD, 50 % des yeux lésés ont développé des anomalies épithéliales persistantes à la fin de la deuxième semaine (Figure 3). L’œdème cornéen était plus important au cours des premiers jours (Figure 3, Figure 4), tandis que la fibrose cornéenne était significative au cours de la deuxième semaine et a entraîné une opacité cornéenne 4⁺ dans 100 % des yeux blessés.

Des signes précoces de néovascularisation (NV) ont été observés cliniquement et histologiquement, 24 h après l’induction de la lésion chimique, comme illustré à la figure 5, ce qui correspond à la chronologie de la NV identifiée par l’étude de Kvanta et al. qui a montré des signes de NV limbique 24 h après la lésion²². Au cours du processus de guérison, de nouveaux vaisseaux ont mûri et au 14e jour après la blessure, NV a traversé le limbe et atteint la cornée centrale. Le limbe, qui définit la limite entre la conjonctive et la cornée, a été détruit.

Des signes histologiques de déficit en cellules souches limbiques et de conjonctivalisation ont été observés par l’apparition de cellules caliciformes PAS+ et de vaisseaux sanguins stromaux 23,24,25,26. Des cellules caliciformes ont été observées dans le présent modèle de lésion et indiquées par la flèche de la figure 6.

Les épithéliums conjonctivales et cornéens expriment principalement des kératines uniques, K13 et K12, respectivement²⁷. Après la lésion limbique, de nouvelles cellules épithéliales provenant de la conjonctive ont recouvert la cornée dénudée, et K12 n’a pas été exprimé sur la surface cornéenne des animaux blessés pendant 2 semaines après la blessure. Ce résultat, cohérent avec d’autres études²⁸, indiquait une LSCD complète et l’absence de cellules épithéliales cornéennes à la surface de la cornée. Cependant, dans l’étude de Park et ^al.29, ils ont détecté l’expression de K12 20 et 32 semaines après la blessure, suggérant une possible trans-différenciation des cellules épithéliales.

Par conséquent, nous avons observé que les lésions chimiques détruisaient le limbe et les cellules souches limbiques, ce qui entraînait la migration des cellules épithéliales conjonctivales vers le centre de la cornée pour recouvrir la surface cornéenne dénudée. Ceci est en outre validé par le marqueur des cellules épithéliales conjonctivales, K13, qui a été exprimé dans l’ensemble des surfaces de la conjonctive et de la cornée, comme le montre la figure 7.

Figure 1 : Œil droit normal de la souris et poinçon-tréphine pour induire des lésions cornéennes et limbiques. (A) Vue latérale montrant un œil de souris avec une cornée très incurvée (les pointes de flèches indiquent le limbe). (B) L’image démontre que même un grand papier filtre est insuffisant pour couvrir adéquatement la zone limbique. Le diamètre limbe à limbe de l’œil de la souris est de près de 4 mm et une biopsie à l’emporte-pièce d’un diamètre externe de 4,5 mm et d’un diamètre interne de 3,5 mm (panneaux D et H) recouvre de manière appropriée la cornée et la surface limbique, comme indiqué dans les panneaux (C) et (E). (F) La tréphine de poinçon est maintenue de manière appropriée au-dessus du globe autour de la zone limbique. (G) Pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuite à travers le bord de la tréphine de poinçonnage, après avoir correctement positionné la tréphine de poinçon dans un axe parallèle au globe, le trou est rempli de bleu de méthylène. Aucune fuite de bleu de méthylène n’est détectée. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Yeux énucléés. (A) Les yeux ont été énucléés tout en préservant la conjonctive bulbaire et palpébrale, la glande lacrymale (pointe de flèche) et le nerf optique (flèche). Les yeux normaux (B) et blessés (C) ont été saturés de saccharose à 30 % pour les protéger contre la formation de cryocristaux. La partie nasale du globe est reconnaissable à la caroncule nasale (étiquetée N). Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Cicatrisation de l’œil gauche. Le processus de cicatrisation de l’œil gauche de la souris pendant 2 semaines après une lésion alcaline cornéenne et limbique dans un modèle de souris est illustré ici (A-F). L’examen de l’œil à la lampe à fente. L’œdème cornéen est plus important aux jours 0 et 2 (A, B), tandis que la fibrose est plus évidente au cours de la deuxième semaine suivant la blessure (E-F). A.f-F.f montre le processus de réépithélialisation d’un même œil. Une anomalie totale de l’épithélium cornéen et limbique immédiatement après l’induction de la lésion est observée chez A.f. L’anomalie épithéliale guérit par migration des cellules épithéliales conjonctivales selon un schéma centripète en 12 à 14 jours (A.f-F.f). Cependant, 50 % des yeux blessés ont développé une anomalie épithéliale persistante à la fin de la deuxième semaine, comme le montre la flèche dans les images F et F.f. Barre d’échelle = 1 mm (panneau C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : OCT du segment antérieur de l’œil de la souris. (A) L’AS-OCT illustre la courbure normale de la cornée et la chambre antérieure. La structure de l’iris est bien définie et reconnaissable. Aucune adhérence iridocornéenne n’est détectable à mi-périphérie de l’iris. (B) Immédiatement après la blessure, l’épaisseur de la cornée augmente en raison de la formation d’un œdème et l’adhérence iridocornéenne se développe à la périphérie médiane de l’iris. (C) Deux semaines après la lésion, la courbure cornéenne a changé et l’adhérence iridocornéenne totale avec destruction de la chambre antérieure est visible. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Néovascularisation cornéenne. Des signes cliniques et histologiques de néovascularisation cornéenne peuvent être observés au cours du processus de cicatrisation de la plaie après une lésion à l’hydroxyde de sodium (NaOH). (A) Les premiers signes de néovascularisation deviennent détectables dès le premier jour après la blessure, caractérisés par une décoloration rougeâtre de la cornée (indiquée par une flèche blanche). Cette décoloration résulte de l’agrégation des globules rouges dans le stroma, comme l’illustre l’image histologique correspondante (D) (indiquée par des pointes de flèches jaunes). (B) Au cours de la première semaine de régénération, de nouveaux vaisseaux augmentent progressivement et se propagent dans toute la cornée. (C) Au bout de 2 semaines, la zone limbique est détruite et les nouveaux vaisseaux continuent d’évoluer. (E) La coupe histologique de la cornée illustre en outre la présence d’une néovascularisation stromale profonde (représentée par des pointes de flèche). Lampe à fente Barre d’échelle de l’image = 1 mm, barre d’échelle de l’image histologique = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Coloration périodique acide-Schiff et immunohistochimique (IHC) de la cornée. Une coloration périodique acide-Schiff et immunohistochimique de la cornée normale et blessée a été effectuée 2 semaines après la lésion. Épithélium cornéen normal de souris composé de 4 à 5 couches de cellules (A). Une lésion alcaline de la cornée et du limbe a conduit à une conjonctivalisation de la cornée avec l’apparition de cellules caliciformes à la surface de la cornée, comme le montrent les flèches noires en (D). Les cellules épithéliales cornéennes normales expriment K12 (B), qui n’est pas exprimé par les cellules conjonctivales qui recouvrent la cornée lésée (E). K13, un marqueur caractéristique des cellules épithéliales conjonctivales, n’est pas exprimé sur les cellules épithéliales cornéennes normales (C). Cependant, il est présent sur la surface cornéenne lésée par l’hydroxyde de sodium (NaOH), ce qui est un signe de conjonctivalisation cornéenne (F). Barre d’échelle de l’image histologique = 50 μm, barre d’échelle de l’image colorée IHC = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Coloration de l’hématoxyline et de l’éosine et immunohistochimie. L’hématoxyline et l’éosine (H&E) et la coloration immunohistochimique du tissu normal et du limbe lésé ont été effectuées. (A) Le limbe normal marque la zone de transition entre la fin de la sclérotique et le début de la cornée. Cette région est généralement recouverte d’une ou deux couches de cellules épithéliales conjonctivales (indiquées par les flèches). Dans un œil sain, l’expression d’un marqueur épithélial cornéen spécifique appelé K12 commence au limbe et s’étend à la surface de la cornée (illustrée dans l’image B). D’autre part, l’expression d’un marqueur conjonctival connu sous le nom de K13 est limitée au limbe et ne s’étend pas au-delà de celui-ci (indiquée par la flèche blanche dans l’image C). Dans les yeux lésés par l’hydroxyde de sodium (NaOH), les limites du limbe sont perturbées. Cela conduit à la migration des cellules conjonctivales vers la cornée lésée. (D) Les images du limbe lésé par le NaOH montrent la présence d’une néovascularisation à la fois sous la couche épithéliale et dans le tissu stromal. À la suite de la lésion, la surface cornéenne lésée n’a pas la présence de K12 (E), tandis que K13 est abondamment exprimée sur la surface cornéenne (F). Barre d’échelle de l’image histologique = 50 μm, barre d’échelle de l’image colorée IHC = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier complémentaire 1 : Protocole de coloration. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo 1 : Lésions cornéennes et limbiques du NaOH dans un modèle murin avec une tréphine poinçonnée. La vidéo montre la procédure d’induction d’une lésion cornéenne et limbique du NaOH dans un modèle de souris avec un poinçon-tréphine. Il est crucial de tenir la tréphine de poinçon dans un axe parallèle au globe et d’appliquer une pression minimale sur le limbe. Cette technique appropriée est essentielle pour éviter les fuites et obtenir des résultats optimaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Illustration de la technique d’énucléation tout en préservant la conjonctive bulbaire. Pour différencier le côté nasal du globe du côté temporal, la caroncule nasale est conservée avec le globe. L’ensemble de la conjonctive est disséqué à partir de sa jonction jusqu’à la plaque tarsienne. Avec une pression minimale, le contenu orbital dépasse vers l’extérieur. En guidant la pince vers l’arrière du globe, le nerf optique est saisi et le tissu est extrait. Le tissu énucléé comprend le globe, la graisse orbitaire et la glande lacrymale orbitaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Cette étude propose un dispositif innovant, le punch-tréphine, qui peut être utilisé pour induire avec succès une lésion cornéenne et limbique efficace et reproductible dans un modèle murin. Ce modèle de déficience en cellules souches limbiques est idéal pour étudier la dynamique de la cicatrisation des plaies cornéennes et de la conjonctivalisation après une blessure.

Les preuves suggèrent que la niche limbique et la partie centrale de la cornée murine contiennent des cellules souches³⁰. Par conséquent, une lésion cornéenne et limbique efficace est nécessaire pour produire un modèle de déficience en cellules souches, et le modèle de lésion présenté ici permet d’exposer le limbe cornéen incurvé à un agent chimique pendant une période spécifique. Pour déterminer la meilleure concentration et la meilleure durée des lésions de NaOH, des blessures ont été infligées avec différentes concentrations et durées de NaOH. Des concentrations plus élevées de NaOH ou des durées d’exposition plus longues ont entraîné une augmentation des lésions tissulaires et de la fibrose. Par conséquent, les chercheurs peuvent ajuster ces paramètres en fonction des objectifs spécifiques de leur étude et de la gravité souhaitée de la blessure.

Pour reproduire avec succès ce modèle de lésion cornéenne et limbique, plusieurs considérations clés doivent être prises en compte. Tout d’abord, il est impératif de mesurer le diamètre limbique à limbique de l’œil ciblé pour déterminer la taille appropriée du poinçon. Il est recommandé de choisir un poinçon de biopsie dont le diamètre extérieur est supérieur de 0,5 à 1 mm à ce diamètre.

La tension superficielle du liquide utilisé est un facteur important pour éviter les fuites à l’interface entre la surface oculaire et le bord de la tréphine de poinçonnage, comme le montre la figure 1G. Par conséquent, il n’est pas nécessaire d’appliquer une pression sur l’extrémité de la biopsie à l’emporte-pièce.

Pour éviter de causer des dommages mécaniques aux tissus, il est essentiel de tenir la tréphine de poinçon dans un axe parallèle à l’œil et de s’abstenir d’appliquer une pression sur le limbe. Un mauvais réglage de l’axe de la tréphine de poinçon peut augmenter le risque de fuite et entraîner un site de blessure décentré et des résultats inexacts.

Parmi les limites potentielles de cette technique, citons la nécessité de choisir la taille de poinçon appropriée, l’acquisition de compétences dans la tenue de la tréphine de poinçon et le risque potentiel de causer des blessures mécaniques. Cependant, ces limitations peuvent être surmontées par la pratique et en suivant les instructions décrites dans ce protocole. La souche et la tranche d’âge des souris sont d’autres facteurs qui affectent le processus de réépithélialisation et doivent être pris en compte dans l’étude.

De plus, le protocole proposé est avantageux car il détaille une méthode d’énucléation qui préserve la conjonctive bulbaire et palpébrale et permet de déterminer la partie nasale du globe sans l’application de sutures chirurgicales comme marqueur. Des recherches antérieures ont indiqué que la région nasale de l’œil possède l’innervation neurale la plus faible par rapport aux autres zones de la cornée, ce qui la rend plus vulnérable à la néovascularisation et réduit l’efficacité régénératrice^31,32.

En résumé, les signes cliniques du LSCD, tels que l’opacité cornéenne (CO), les défauts épithéliaux persistants et la néovascularisation cornéenne (NV), ainsi que les changements histologiques observés, y compris la métaplasie des cellules caliciformes, l’expression de K13 à la surface de la cornée et l’absence de K12 à la surface de la cornée, confirment la présence de LSCD dans ce modèle. Ces résultats fournissent la preuve que cette nouvelle technique est efficace pour induire le LSCD. Ce modèle de lésion chimique peut être utilisé dans des études précliniques pour étudier de nouveaux médicaments et traitements pharmaceutiques dans le domaine des lésions et de la régénération cornéennes.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-K12 antibody	ABCAM	ab185627
Anti-K13 antibody	ABCAM	ab92551
Bovine serum albumin (BSA)	ThermoFisher Scientific	B14
C57BL/6 mice	Dr Weissman Lab, Stanford University
Curved forceps	Storz	E1885
Disposable 90 degree bent needle
Disposable biopsy punch	Med blades
Donkey anti-rabbit IgG H&L	ABCAM	ab150073
Ethanol	ThermoFisher Scientific	T038181000CS
Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension)	Fidelis Animal Health
Heating pad for mouse
Ketamine hydrochloride	Ambler	ANADA 200-055
OCT	Tissue-Tek 4583
Ophthalmic surgical scissors
pH Indicator Sticks	Whatman
Phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	AM9624
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935
Slit-lamp microscope	NIDEK	SL-450
Sodium fluorescein AK-fluor 10%	Dailymed	NDC17478-253-10
Sterile irrigation solution (BSS)	Alcon	9017036-0119
Sterile syringe, 1 and 5 ml
Straight forceps	Katena K5	4550- Storz E1684
Surgical eye spears	American White 17240 Cross
Surgical microscope	Zeiss S5 microscope
Tetracaine ophthalmic drop	Alcon	NDC0065-0741-14
Timer
Triple antibiotic ophthalmic ointment	Bausch and Lomb
TritonX -100	Fisher Scientific	50-295-34
Two-speed rotary tool	200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit
Xylazine	AnaSed	NADA#139-236