Prélèvement de liquide céphalorachidien et de sang de la veine caudale latérale chez le rat pendant les enregistrements EEG

Résumé

Le protocole montre des prélèvements répétés de liquide céphalorachidien et de sang de rats épileptiques effectués en parallèle avec une surveillance continue du vidéo-électroencéphalogramme (EEG). Ceux-ci sont essentiels pour explorer les liens possibles entre les changements dans diverses molécules de fluides corporels et l’activité convulsive.

Résumé

Parce que la composition des fluides corporels reflète de nombreuses dynamiques physiologiques et pathologiques, des échantillons de liquides biologiques sont couramment obtenus dans de nombreux contextes expérimentaux pour mesurer des molécules d’intérêt, telles que des hormones, des facteurs de croissance, des protéines ou de petits ARN non codants. Un exemple concret est l’échantillonnage de liquides biologiques dans la recherche de biomarqueurs de l’épilepsie. Dans ces études, il est souhaitable de comparer les niveaux de molécules dans le liquide céphalorachidien (LCR) et dans le plasma, en prélevant le LCR et le plasma en parallèle et en tenant compte de la distance temporelle de l’échantillonnage entre et les crises. La combinaison de l’échantillonnage du LCR et du plasma, couplée à la surveillance vidéo-EEG chez les animaux épileptiques, est une approche prometteuse pour la validation de biomarqueurs diagnostiques et pronostiques putatifs. Ici, une procédure de retrait combiné du LCR de la citerne magna et d’un prélèvement sanguin de la veine latérale de la queue chez des rats épileptiques qui sont surveillés en permanence par vidéo-EEG est décrite. Cette procédure offre des avantages significatifs par rapport à d’autres techniques couramment utilisées. Il permet un prélèvement rapide avec un minimum de douleur ou d’invasivité, et une durée d’anesthésie réduite. De plus, il peut être utilisé pour obtenir des échantillons de LCR et de plasma chez des rats captifs et enregistrés par télémétrie EEG, et il peut être utilisé à plusieurs reprises sur plusieurs jours d’expérience. En minimisant le stress dû à l’échantillonnage en raccourcissant l’anesthésie à l’isoflurane, on s’attend à ce que les mesures reflètent plus précisément les niveaux réels des molécules étudiées dans les biofluides. En fonction de la disponibilité d’un test analytique approprié, cette technique peut être utilisée pour mesurer les niveaux de plusieurs molécules différentes tout en effectuant un enregistrement EEG en même temps.

Introduction

Le liquide céphalorachidien (LCR) et les prélèvements sanguins sont importants pour identifier et valider les biomarqueurs de l’épilepsie, tant dans la recherche préclinique que clinique ^1,2. De nos jours, le diagnostic de l’épilepsie et la plupart des recherches sur les biomarqueurs de l’épilepsie se concentrent sur l’EEG et la neuroimagerie ^3,4,5. Ces approches présentent toutefois plusieurs limites. Outre les mesures de routine du cuir chevelu, dans de nombreux cas, l’EEG nécessite des techniques invasives telles que les électrodes de profondeur⁶. Les méthodes d’imagerie cérébrale ont une faible résolution temporelle et spatiale et sont relativement coûteuses et prennent beaucoup de temps ^7,8. Pour cette raison, l’identification de biomarqueurs non invasifs, peu coûteux et à base de biofluides constituerait une alternative très intéressante. De plus, ces biomarqueurs biofluides pourraient être combinés avec les approches diagnostiques disponibles pour affiner leur prédictivité.

Les patients diagnostiqués avec l’épilepsie sont systématiquement soumis à un EEG ^9,10 et à des prélèvements sanguins 11,12,13,14, et beaucoup d’entre eux sont également soumis à un retrait du LCR pour exclure les causes potentiellement mortelles (c’est-à-dire les infections aiguës, l’encéphalite auto-immune)¹⁵. Ces échantillons de sang et de LCR peuvent être utilisés dans la recherche clinique visant à identifier des biomarqueurs de l’épilepsie. Par exemple, Hogg et ses collègues ont découvert qu’une augmentation de trois fragments d’ARNt plasmatiques précède l’apparition de crises dans l’épilepsie humaine¹⁴. De même, les taux d’interleukine-1bêta (IL-1β) dans le LCR humain et le sérum, exprimés par le rapport des taux d’IL-1β dans le LCR par rapport au sérum, peuvent prédire le développement de l’épilepsie post-traumatique après un traumatisme crânien¹⁶. Ces études soulignent l’importance de l’échantillonnage des biofluides pour la recherche sur les biomarqueurs de l’épilepsie, mais elles se heurtent à de multiples limites intrinsèques aux essais cliniques, par exemple, le facteur cofondateur des médicaments antiépileptiques (DEA) dans le sang, le manque fréquent d’informations sur l’étiologie, les contrôles inadéquats, le nombre modeste de patients, etc^{. 17,18}.

La recherche préclinique offre d’autres possibilités d’étudier les molécules dans les biofluides en tant que biomarqueurs potentiels de l’épilepsie. En fait, il est possible de prélever du plasma et/ou du LCR sur des animaux lors d’enregistrements EEG. De plus, l’échantillonnage peut être effectué à plusieurs reprises sur plusieurs jours de l’expérience, et un certain nombre de témoins appariés en fonction de l’âge, du sexe et de l’agression épileptique peuvent être utilisés pour améliorer la robustesse de l’étude. Ici, une technique flexible pour obtenir du LCR à partir de la citerne magna avec retrait parallèle de plasma de la veine caudale chez des rats surveillés par EEG est décrite en détail. La technique présentée présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives. En utilisant une approche à l’aiguille papillon, il est possible de prélever plusieurs fois le LCR sans compromettre la fonction des électrodes EEG ou des implants crâniens similaires. Il s’agit d’un raffinement des procédures de retrait des cathéters intrathécaux, qui sont associées à un risque relativement élevé d’infection. De plus, l’approche de chute libre utilisée pour le prélèvement sanguin est supérieure aux autres approches de prélèvement sanguin dans la veine caudale en raison du risque d’hémolyse très réduit, dû au fait que le sang ne passe pas à travers la tubulure et qu’aucune pression de vide n’est appliquée. S’il est effectué dans des conditions strictes exemptes de germes, le risque d’infection est particulièrement faible pour les animaux. De plus, en commençant les prélèvements sanguins à l’extrémité de la queue des animaux, les prélèvements peuvent être répétés plusieurs fois. Ces techniques sont faciles à maîtriser et peuvent être appliquées dans de nombreuses études précliniques sur les troubles du système nerveux central.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Ferrare et par le ministère italien de la Santé (autorisation : D.M. 603/2022-PR) conformément aux lignes directrices énoncées dans la directive du Conseil des Communautés européennes du 24 novembre 1986 (86/609/CEE) relative à la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins scientifiques. Ce protocole est spécifiquement ajusté pour d’autres analyses quantitatives par réaction en chaîne par polymérase (qPCR) de petits acides ribonucléiques non codants (ARNsnc) dans le LCR et le plasma de rat obtenus sous contrôle EEG chez des animaux épileptiques. À sa discrétion, veuillez consulter la vidéo JoVE correspondante pour une meilleure compréhension et des améliorations de la chirurgie 19,20,21.

1. Préparation des animaux pour l’implantation chirurgicale d’électrodes ou de télémètres

REMARQUE : La technique de chirurgie stéréotaxique varie en fonction du système EEG utilisé. La section suivante sur la méthode fournit une description des étapes communes aux deux types de chirurgies.

1. Utilisez des rats Sprague-Dawley (SD) (mâles, âgés de 7 à 8 semaines, pesant 250 à 290 g) maintenus conformément aux lois locales sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Hébergez les animaux dans des conditions standard avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau potable.
2. Procéder à la manipulation des rats pendant quelques jours avant la chirurgie et les procédures du protocole expérimental.
3. Utiliser un appareil stéréotaxique pour l’implantation d’électrodes ou de télémètres. Suivez les normes contemporaines pour les chirurgies aseptiques. Utilisez des électrodes et des transmetteurs stériles et en bon état de fonctionnement.
4. Rasez la tête de l’animal avec le rasoir électrique. Induire l’anesthésie chez l’animal avec le mélange de kétamine (45 mg/kg) et de xylazine (7,5 mg/kg) administré par voie intrapéritonéale (i.p.), puis ajouter l’anesthésie à l’isoflurane (1,4 % dans l’air ; 1,2 mL/min) administrée à travers un masque facial et fixer la tête de l’animal dans l’appareil stéréotaxique.
5. Assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie adéquate en testant le réflexe de retrait de la pédale après le pincement des coussinets plantaires sur les pattes arrière des deux animaux et maintenez l’anesthésie à l’isoflurane jusqu’à la fin de la chirurgie. Vérifiez régulièrement la profondeur de l’anesthésie pendant toute la durée de l’intervention.
6. Appliquez une quantité suffisante de pommade ophtalmique sur les yeux des deux animaux pour prévenir les lésions cornéennes dues à la perte du réflexe de clignement des yeux causée par l’anesthésie.
7. Nettoyez soigneusement le cuir chevelu de l’animal avec un désinfectant liquide et faites une incision longitudinale de 2 cm de long à l’aide d’un scalpel stérilisé. Ouvrez le cuir chevelu et appliquez des clips chirurgicaux sur les lambeaux de peau pour le maintenir ouvert.
8. Délicatement, détachez le périoste pour exposer le bregma et la zone du crâne à travers laquelle l’électrode enregistreuse sera insérée.

2. Implantation chirurgicale d’électrodes attachées

NOTA : Avant d’établir la procédure de ponction du LCR de ce protocole (voir l’étape 9 pour plus de détails), des prélèvements répétés du LCR à l’aide d’une canule guide chez quelques rats non anesthésiés se déplaçant librement ont été effectués. Des animaux canulés implantés avec des électrodes attachées ont été utilisés afin d’évaluer l’impact des implants à double tête sur l’enregistrement EEG à long terme couplé à de multiples prélèvements de LCR. Dans ces expériences spécifiques, des rats ont été implantés avec une canule guide factice placée dans la citerne magna, dont l’extrémité y a été insérée de 7 mm de manière stéréotaxique, selon des protocoles précédemment publiés²². Les approches de chirurgie à double implant étaient similaires à celles adoptées par certains travailleurs dans le passé pour l’implantation de canules guides de microdialyse et d’électrodes attachantes^23,24.

1. Utilisez un bras du cadre stéréotaxique, montez le porte-électrode dessus et placez l’électrode à la verticale dans le support. Déplacez la pointe de l’électrode exactement au-dessus du bregma. Notez les coordonnées antéropostérieures et médiolatérales du bregma et traduisez-les aux coordonnées souhaitées.
2. Abaissez l’électrode jusqu’à ce que sa pointe touche presque le crâne. Marquez l’endroit du perçage et percez le crâne sur l’endroit marqué. Veillez à ne pas endommager le cerveau et les méninges.
3. Faites quatre trous ou plus pour les vis d’ancrage et vissez-les dans le crâne. Faites attention à la taille de l’électrode lorsque vous faites les trous pour les vis d’ancrage. La taille de l’électrode ne doit pas interférer avec les vis d’ancrage positionnées.
4. Abaissez lentement le bras stéréotaxique portant l’électrode sur l’axe dorso-ventral, entrez dans le tissu cérébral et arrêtez-vous à la position souhaitée. Fixez le fil de terre de l’électrode autour de l’une des vis vissées dans le crâne.
5. Placez le ciment méthacrylique sur l’électrode et les vis couvrant environ la moitié de la hauteur du piédestal de l’électrode. Laissez la moitié supérieure de l’électrode, qui correspond à l’extrémité du fil d’attache, nue.
6. Libérez l’électrode du support et soulevez le bras stéréotaxique. Libérez l’animal de l’appareil stéréotaxique et donnez-lui des soins postopératoires.
7. Placez l’animal dans une cage de récupération séparée et observez-le toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’il soit éveillé et ambulatoire. Ne remettez l’animal dans sa cage d’hébergement standard et dans une autre compagnie d’animaux non anesthésiés qu’après s’être complètement rétabli.

3. Implantation chirurgicale des télémètres

REMARQUE : N’utilisez que des télémètres stériles. Si les télémètres sont réutilisés, nettoyez-les et stérilisez-les avant la chirurgie selon les instructions du fabricant. Dans ce protocole, un télémètre de science des données International (DSI) pour l’enregistrement EEG a été utilisé.

1. Allumez l’émetteur de télémétrie à l’aide d’un aimant et testez le signal avec une radio de fréquence AM. Vérifiez s’il y a un signal fort et clair avant la chirurgie. Si nécessaire, jetez les télémètres qui fonctionnent mal.
2. Préparez les fils du télémètre en les raccourcissant à des longueurs optimales pour les rats adultes. Décollez le revêtement en silicone sur deux fils (négatif et positif), exposant environ 5 mm du fil d’acier hélicoïdal. Créez une poignée bouclée d’environ 2 mm de longueur et 1 mm de largeur à l’extrémité des laisses.
3. Rasez le flanc de l’animal sous et derrière l’épaule gauche. Désinfecter la zone de chirurgie avec un désinfectant à base de peroxydes stabilisés et d’activité d’ammonium quaternaire. Laissez agir le désinfectant pendant 15 min.
4. Faites une incision latérale d’environ 2 cm juste derrière l’épaule de l’animal et faites une poche sous-cutanée d’environ 5 cm³ d’espace pour la mise en place de l’émetteur. Placez l’émetteur parallèlement à l’axe long du corps, avec les fils dirigés vers la direction rostrale.
5. Fixez l’émetteur à la paroi interne de la poche sous-cutanée avec une suture en coton 3-0. À l’aide de ciseaux à bout émoussé, créez le tunnel sous-cutané (d’environ 2,5 cm de longueur) à travers le flanc et le cou de l’animal, reliant ainsi la poche de l’émetteur à l’incision médiane pratiquée sur le cuir chevelu de l’animal à l’étape 1.6.
6. Prenez les deux fils de télémètres avec une pince et tirez-les vers le haut à travers le tunnel, de sorte qu’ils dépassent de la sortie de l’incision du cuir chevelu. Maintenez les fils hors de l’incision du cuir chevelu avec des pinces à plaie.
7. Utilisez le cadre stéréotaxique pour identifier les coordonnées souhaitées pour la dérivation positive (rouge) et percez le trou dans le crâne pour la pointe de dérivation positive (similaire à l’étape 2.1.). Faites un autre trou pour ancrer la vis vers le haut au rostre et vissez-la dans le crâne.
8. Insérez l’extrémité de la sonde positive sous la scutellaire et la dure-mère et posez-la sur la surface du cerveau. Accrochez la pointe bouclée du fil négatif (blanc) sur la vis. Mettez une petite quantité de ciment méthacrylique autour de la sortie du plomb positif et du plomb négatif pour les immobiliser sur le crâne.
9. Fixez les sondes à la paroi interne de la peau du crâne avec une suture en coton 3-0. Assurez-vous que les sondes fixes et la suture de fixation n’interféreront pas avec le site de retrait du LCR (c’est-à-dire une surface dépressible avec l’apparence d’un losange entre la protubérance occipitale et la colonne vertébrale de l’atlas).
10. Fermez l’incision du cuir chevelu et l’incision du flanc à l’aide d’une suture en coton 3-0. Appliquez des désinfectants sur les plaies. Ce n’est qu’une fois celles-ci sèches qu’il faut appliquer une crème antibiotique sur les plaies suturées.

4. Soins postopératoires

1. Surveillez les animaux pendant environ 1 h après l’opération jusqu’à ce qu’ils se tiennent debout et se déplacent dans la cage. Gardez-les sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Administrer aux animaux un antibiotique systémique pour prévenir l’infection et un analgésique systémique pour prévenir la douleur post-chirurgicale pendant 2 à 3 jours.
2. Laissez les rats récupérer pendant au moins 7 jours après les interventions chirurgicales. Surveillez les animaux au moins une fois par jour pendant 3 jours pour détecter tout signe de douleur ou de détresse.

5. Induction de l’état de mal épileptique chez le rat

REMARQUE : Pour un protocole détaillé d’induction de l’état de mal épileptique (SE) nécessaire à la reproduction de l’épilepsie mésiale du lobe temporal (mTLE) chez le rat, se référer à Guarino et ^al.25.

1. Après une semaine de récupération post-chirurgicale, répartissez les animaux au hasard dans des groupes : (i) les animaux témoins recevant le véhicule et (ii) les animaux épileptiques qui recevront de la pilocarpine. Utilisez un nombre proportionnellement plus élevé d’animaux pour le groupe épileptique, car tous les rats à qui l’on a administré de la pilocarpine ne survivront pas ou ne développeront pas d’ES.
2. La veille de l’induction de l’ES, administrer aux animaux une dose unique de 127 mg/kg de chlorure de lithium dissous dans une solution saline à 0,9 % (3M) à raison de 1 mL/kg par gavage gastrique. Administrer le lithium de l’animal, qui augmente l’efficacité de la pilocarpine²⁶, environ 14 h avant l’induction de l’ES afin de réduire la variabilité dans le temps jusqu’à l’apparition de l’ES.
3. Environ 14 h après l’administration de lithium, administrer aux rats une seule injection de méthylscopolamine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée).
4. Exactement 30 minutes après l’administration de méthylscopolamine, administrer aux rats une seule injection de pilocarpine (50 mg/kg, i.p.) pour induire l’ES. Donner de la méthylscopolamine et du véhicule (solution de NaCl à 0,9 %) pour contrôler les rats.
   1. L’injection de pilocarpine induit un comportement typique chez l’animal : crises partielles précoces (mouvements des vibrisses et hochements de tête dans les 5 minutes suivant l’administration de pilocarpine) évoluant vers des convulsions généralisées récurrentes (SE) dans les 25 à 30 minutes. Pour les rats qui ne développent pas d’ES dans les 30 minutes, administrer une dose supplémentaire de pilocarpine (25 mg/kg, i.p.), et s’ils ne développent toujours pas d’ES, les exclure de l’étude (non-répondeurs à l’ES).
5. Observez et notez le comportement épileptique chez le rat toutes les 5 minutes en commençant immédiatement après l’injection de pilocarpine. Utilisez l’échelle de Racine pour obtenir^{une note de 27}.
6. Interrompre l’ES 2h après le début par l’administration i.p. d’un cocktail de médicaments : diazépam (10 mg/kg), phénobarbital (25 mg/kg) et scopolamine (1 mg/kg).
7. Donnez à nouveau ce cocktail aux rats après 4 h. Enfin, après encore 4 h, donnez aux rats le dernier mélange de médicaments (diazépam 10 mg/kg plus scopolamine 1 mg/kg) afin d’arrêter complètement l’activité convulsive.
8. Injecter i.p. aux animaux avec une solution saline (1 mL de solution de NaCl à 0,9 %, pH ajusté à 7,0) et les nourrir avec une solution de saccharose à 10 % pendant 2 à 3 jours après l’ES pour favoriser la récupération de la perte de poids corporel qui suit l’ES.
9. Assigner au hasard les animaux survivants post-SE à différents groupes expérimentaux selon les exigences du protocole expérimental spécifique. Utiliser les critères d’inclusion/exclusion suivants pour d’autres expériences chez des rats épileptiques : développement d’une SE convulsive dans l’heure suivant l’administration de pilocarpine, prise de poids au cours de la première semaine après l’ES et positionnement correct de l’électrode dans la zone cérébrale d’intérêt pour les enregistrements EEG²⁵.

6. Vidéo-EEG captif chez le rat épileptique et analyses de l’activité convulsive

NOTA : Cette section décrit la procédure expérimentale d’enregistrement des signaux EEG chez des rats logés et se déplaçant librement dans des conditions normales. La cage ne doit pas contenir d’objets où l’animal ou le câble d’enregistrement peuvent se coincer. En fonction de la question scientifique à aborder, plusieurs paramètres peuvent être analysés. Dans le cas de la recherche sur l’épilepsie, les traces EEG sont examinées pour reconnaître les crises électriques et motrices. Les paramètres les plus couramment utilisés pour identifier une crise sont l’amplitude, la fréquence et la durée de l’activité électrique paroxystique.

1. Placez l’animal dans une cage propre dans la salle d’enregistrement pour permettre l’accoutumance et réduire le stress induit par le nouvel environnement. Placez la cage de l’animal dans une cage de Faraday pour éviter la contamination du signal EGG par le champ électromagnétique environnemental.
2. Connectez une extrémité du câble d’enregistrement à l’appareil d’enregistrement. Utilisez un voltmètre pour mesurer le potentiel électrique et différencier les électrodes de masse des électrodes de référence.
3. Connectez l’autre extrémité du câble d’enregistrement à l’électrode fixée sur la tête du rat. Pour ce faire, tenez le couvercle en ciment sur la tête de l’animal lors de l’insertion de la fiche du câble dans le connecteur de l’électrode et évitez d’appliquer une pression sur la tête du rat.
4. Contrebalancez le poids du câble d’enregistrement pour permettre la libre circulation de l’animal tout en évitant le risque de torsion du câble. Pour ce faire, utilisez un bras d’équilibrage ou des collecteurs. Même si le câble d’enregistrement est contrebalancé, placez la nourriture à l’intérieur de la cage plutôt que dans un support d’alimentation, dans lequel les animaux doivent se lever pour atteindre la nourriture.
5. Avant de commencer l’enregistrement, vérifiez tous les paramètres utilisés pour acquérir et traiter les données de l’EEG.
   REMARQUE : Ce protocole ne fournit pas d’introduction à l’appareil requis pour effectuer l’enregistrement EEG, cependant, des taux de filtrage et d’échantillonnage adéquats doivent être appliqués pour éviter les artefacts et le bruit dans les signaux EEG.
   1. Pour une expérience de routine, réglez la fréquence d’échantillonnage à 500 Hz et le gain d’amplification à 5000x. Filtrez le signal à l’aide d’un filtre de 0,005 Hz en plus d’un filtre coupe-bande pour éliminer l’activité électrique environnante dans la bande de 50 Hz (spécifique aux pays européens).
6. Démarrez les enregistrements vidéo et EEG et assurez-vous que les traces correspondent à un signal EEG attendu en vérifiant la puissance dans des bandes de fréquences spécifiques au fil du temps. Enregistrez une période de référence avant de commencer les interventions chez les animaux.
7. Vérifiez périodiquement les traces des animaux et de l’EEG. Il n’est pas rare qu’un câble d’enregistrement se détache du connecteur de l’électrode dans la tête du rat. Si cela se produit, reconnectez à nouveau l’électrode de la tête de rat à un câble d’enregistrement et vérifiez si le signal EEG est clair.
8. Analysez le signal EEG manuellement ou automatiquement à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce. En cas d’analyse manuelle, passez au crible l’enregistrement EEG pour identifier les activités semblables à des crises. Si un logiciel doit être utilisé, configurez les paramètres clés d’un événement de crise, tels que l’amplitude, la fréquence et la durée de l’activité électrique.
   NOTA : Une seule crise peut être caractérisée par une activité électrique d’une amplitude 3 fois supérieure à la ligne de base, d’une fréquence égale ou supérieure à 5 Hz et d’une durée d’au moins 5 s²².
9. Quelle que soit la méthode utilisée, confirmez les crises convulsives potentielles en vérifiant l’enregistrement vidéo synchronisé recueilli simultanément avec l’EEG.

7. Vidéo-EEG de télémétrie chez le rat épileptique et analyse de l’activité convulsive

NOTA : Cette section décrit la procédure expérimentale d’enregistrement des signaux EEG de radiotélémétrie chez des rats logés et se déplaçant librement dans des conditions normales. Le protocole est basé sur un système de télémétrie disponible dans le commerce. Cependant, plusieurs systèmes de télémétrie diffèrent légèrement dans leurs spécifications fonctionnelles et techniques. Le système doit être choisi en fonction des besoins du laboratoire et des objectifs de recherche.

1. Placez la cage de l’animal au-dessus du récepteur de signal. Connectez le récepteur de signal au système d’acquisition de données et celui-ci à un ordinateur avec le logiciel d’acquisition.
2. Allumez l’implant de télémétrie par radiofréquence en plaçant un aimant à proximité du télémètre inséré dans le flanc du rat. Testez le signal à l’aide d’un appareil radio. Utilisez un appareil radio universel pour tester les télémètres et entendez un bip clair indiquant que le télémètre est activé, tandis qu’un grésillement indique un télémètre inactivé.
   REMARQUE : La durée de vie de la batterie de l’émetteur radiofréquence doit être prise en compte avant de définir la durée des enregistrements.
3. Configurez le logiciel d’acquisition et synchronisez le signal de télémétrie et le système vidéo pour acquérir simultanément des données EEG et vidéo. Attribuez un récepteur de signal à chaque émetteur implanté et définissez les valeurs d’étalonnage de l’émetteur. Réglez la fréquence d’échantillonnage à 1000 Hz, la détection de bruit entre -500 mV et +500 mV et l’intervalle d’intégration à 100 ms. N’utilisez pas de filtres passe-bas et passe-haut.
4. Démarrez les données de télémétrie et les enregistrements vidéo. Effectuez un enregistrement de base à long terme avant d’acquérir l’activité de type épileptique. Analysez le signal EEG comme décrit aux étapes 6.8 et 6.9.

8. Procédure de prélèvement sanguin de la veine caudale

NOTE. Le système de prélèvement sanguin sous vide se compose d’une aiguille papillon (23 G x 3/4 x 12 (0,8 mm x 19 mm x 305 mm). La technique de prélèvement sanguin peut être facilement effectuée par un seul opérateur et la procédure prend environ 5 minutes.

1. Enrober l’aiguille papillon et sa tubulure avec de l’EDTA K₂à 1 % dans de l’eau distillée peu de temps avant les prélèvements, c’est-à-dire aspirer et expulser la solution d’EDTA K₂du système à l’aide de la seringue de 1 mL. Coupez le tube juste derrière l’aiguille afin de recueillir le sang goutte à goutte, sans aspiration (Figure 1A).
2. Placez le rat dans une chambre d’induction et anesthésiez-le avec de l’isoflurane (1,4 % dans l’air ; 1,2 mL/min). Passez au cadre stéréotaxique et maintenez l’anesthésie à l’aide d’un masque facial. Placez le coussin chauffant sous l’animal, en gardant une partie de sa queue en contact direct avec le coussin.
3. Déplacez doucement le dos de l’animal sur le côté de manière à ce que la veine caudale latérale soit maintenue en haut.
4. Trempez la queue dans de l’eau tiède (42 °C) pendant 2 min pour dilater la nervure latérale. Essuyez la queue avec de l’éthanol à 70 % pour rendre la veine plus visible. Mettez une lumière chaude sur la queue à l’aide d’une ampoule à incandescence ordinaire.
5. Insérez l’aiguille papillon 21G dans la veine caudale latérale avec une profondeur de 5 mm et un angle de 20°. Prélever du sang dans un tube de prélèvement sous vide de 500 μL contenant 5 mg d’EDTA K₂comme anticoagulant (Figure 1B,C).
6. Retirez l’aiguille et arrêtez l’écoulement du sang en exerçant une pression sur le site de ponction. Ramenez le rat dans sa cage d’origine.
7. Retournez doucement le tube 10x pour mélanger l’anticoagulant dans le sang. Faites des trous d’environ 1,5 cm de profondeur dans la glace pour accueillir les tubes de collecte. Mettez doucement et verticalement l’échantillon sur de la glace.
8. Centrifuger l’échantillon de sang dans une centrifugeuse réfrigérée (4 °C) à 1300 x g pendant 10 min pour séparer le plasma. Effectuez cette procédure dans un délai de 1 h maximum.
9. Prélevez environ 200 μL de plasma, en évitant la couche de globules rouges et blancs. Placer le plasma prélevé dans le microtube stérile de 0,2 ml. Si nécessaire, conserver à 4 °C jusqu’à 1 h après centrifugation.
10. Mettez de côté 5 μL de l’échantillon pour le contrôle de la qualité. Conserver l’échantillon à -80 °C jusqu’à l’analyse.
    REMARQUE : N’utilisez pas l’aspirateur, même si certains chercheurs le recommandent²⁸, et ne traitez pas la queue pendant les procédures décrites à l’étape 8.5 pour obtenir plus de sang, car cela diminue la qualité de l’échantillon pour les prochaines analyses de quantification de l’ARNsnc (veuillez consulter les résultats représentatifs pour plus de détails). Gardez à l’esprit que chez le rat, la quantité maximale de sang qui peut être prélevée en une seule fois est de <10 % de son volume sanguin total (c’est-à-dire environ 1,6 à 1,9 ml chez un rat de 250 à 300 g) et de <15 % du volume sanguin total (environ 2,64 ml) en 1 mois²⁹. Dans ce protocole, un maximum de 500 μL de sang prélevé en une seule occasion jusqu’à cinq fois chez un seul animal est utilisé^30,31.

9. Procédure de recouvrement du LCR

NOTE. La technique peut être facilement réalisée par un seul opérateur, et la procédure nécessite environ 2 à 4 minutes. Les matériaux utilisés pour la collecte du LCR sont des aiguilles papillon sous vide à usage unique et peu coûteuses et des tubes d’extraction. Dans ce protocole, un dispositif de perfusion à ailes de papillon relié à une seringue stérile est utilisé afin de créer le vide (Figure 2A).

1. Préparez l’aiguille papillon 23G en coupant son manchon de protection en plastique de manière à ce que l’extrémité de l’aiguille nue soit exposée de 7 mm pour éviter qu’elle ne pénètre à plus de 7 mm de profondeur dans la citerne magna lors du retrait (Figure 2B).
2. Connectez l’aiguille papillon munie d’un tube en polymère à une seringue de 1 ml.
3. Placez le rat dans une chambre d’induction et anesthésiez-le avec de l’isoflurane (1,4 % dans l’air ; 1,2 mL/min). Basculez le flux d’isoflurane vers le cadre stéréotaxique et maintenez l’anesthésie administrée à travers un masque facial. Retirez la fourrure sur l’arrière-plan, la tête et le cou du rat avec un rasoir.
4. Fixez la tête du rat avec des barres auriculaires. Abaissez la tête de l’animal d’environ 45° verticalement, en descendant le long de la barre nasale du cadre stéréotaxique (figure 2C). Inspectez l’arrière de la tête de l’animal et trouvez une surface légèrement déprimée ayant l’aspect d’un losange, entre la protubérance occipitale et l’épine de l’atlas.
5. Frottez cette surface avec de l’éthanol à 70% afin de la rendre plus visible et désinfectez-la.
6. Insérez l’aiguille papillon verticalement au centre de la surface déprimée en forme de losange dans la citerne magna pour la collecte du LCR jusqu’à ce que le mouvement soit bloqué en coupant à la taille de la protection du manchon en plastique de l’aiguille (Figure 2D). Tirez doucement le piston de la seringue de 1 mL vers l’arrière afin de laisser le LCR s’écouler lentement à travers l’aiguille.
7. Recueillir environ 100 μL de LCR dans un tube en polymère (figure 2D). Évitez d’entrer dans le sang ou toute autre contamination visible. Pincez le tube en polymère très près de l’aiguille papillon et coupez le tube à ce stade.
8. Prélever l’échantillon clair (non contaminé) dans la seringue. Jetez l’échantillon contaminé si une contamination visible pénètre dans le tube collecteur.
9. Expulser l’échantillon dans le microtube stérile de 0,2 ml et le conserver sur de la glace jusqu’à 1 h.
10. Désinfectez le site de retrait du LCR sur la tête de l’animal. Retirez le rat du cadre stéréotaxique et remettez-le dans sa cage.
11. Mettez de côté 2 μL de l’échantillon pour le contrôle de la qualité. Conservez le reste de l’échantillon à -80 °C pour une analyse plus approfondie.
    REMARQUE : Chez le rat, si plusieurs prélèvements de LCR sont effectués à plusieurs reprises, le volume recommandé à retirer à chaque prélèvement est de 100 μL³². Dans ce protocole, un maximum de 100 μL de LCR en une seule occasion avec un retrait maximal de 5 fois en 15 jours chez un seul animal a été effectué.

10. Analyse spectrophotométrique de la qualité de l’échantillon

REMARQUE : Après un prélèvement approprié des échantillons de LCR et de plasma, les échantillons sont prêts pour les analyses spectrophotométriques et ne nécessitent aucune manipulation spécifique. Mesurer l’absorbance de l’hémoglobine par spectrophotométrie UV à 414 nm pour évaluer le risque d’hémolyse dans les échantillons. Utiliser une valeur limite d’absorbance de 0,25 dans les échantillons de rats. Le choix de cette limite peut dépendre de l’analyse ultérieure de la qPCR et de ses exigences spécifiques pour la quantification des ARNsnc.

1. Allumez le spectrophotomètre UV. Sélectionnez la méthode de mesure de l’absorbance à une seule longueur d’onde de 414 nm pour le PLASMA ou le LCR. Cliquez sur Suivant.
2. Rincez la cuvette de 1 mm à l’eau purifiée. Mettez 5 μL d’éthanol à 70 % sur le point de mesure de la cuvette. Séchez avec un essuie-tout et frottez avec du papier de soie non pelucheux. Vérifiez s’il est parfaitement transparent.
3. Mettez 1,5 μL d’eau purifiée dans la cuvette de 1 mm et fermez-la. Insérez la cuvette dans la chambre de mesure du spectrophotomètre et mesurez l’absorbance de l’échantillon blanc en cliquant sur le bouton Vide . Vérifiez que la valeur d’absorbance à 414 nm est de 0,000.
4. Séchez la cuvette avec une serviette en papier et nettoyez-la avec du papier de soie non pelucheux. Vérifiez s’il est parfaitement transparent.
5. Mettez 1,5 μL de l’échantillon dans la cuvette de 1 mm et fermez-la. Insérez la cuvette dans la chambre de mesure du spectrophotomètre. Mesurez l’échantillon en cliquant sur le bouton Échantillon . Vérifier l’absorbance de l’échantillon à 414 nm et l’annoter.
6. Procéder à la quantification de l’absorbance de l’hémoglobine dans tous les échantillons disponibles. Mesurez l’échantillon à blanc avant tout échantillon de plasma ou de LCR, en cliquant alternativement sur les boutons Blanc et Échantillon .
7. Conserver les échantillons avec A414 nm < 0,25 à -80 °C et jeter les échantillons si A414 nm > 0,25.
8. Rincez séquentiellement la cuvette de 1 mm avec de l’eau purifiée et de l’éthanol à 70 %. Séchez la cuvette.
9. Fermez la cuvette vide dans la chambre de mesure pour éviter qu’elle ne s’époussète. Éteignez le spectrophotomètre.

Résultats

Le résultat de différentes procédures de LCR et de prélèvement sanguin effectuées chez 9 rats témoins et 18 rats épileptiques chroniques, tous implantés avec des électrodes à 1 mois après l’ES, est rapporté en termes de taux de réussite. Après l’implantation, tous les rats ont fait l’objet d’une vidéo-EEG pendant 1 mois, au cours de laquelle le LCR et le sang ont été prélevés 5 fois tous les 3 jours pendant les deux dernières semaines de l’expérience (c’est-à-dire aux jours 52, 55, 58, ...

Discussion

Le présent travail illustre une technique facile à maîtriser de LCR et de prélèvement sanguin chez le rat, qui peut être utile non seulement pour des études sur des modèles d’épilepsie, mais aussi pour d’autres affections ou maladies neurologiques telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la sclérose en plaques. Dans la recherche sur l’épilepsie, les deux procédures d’échantillonnage couplées à l’EEG vidéo sont idéales lorsqu’une corrélation entre les niveaux de différ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok	BD Italy SpA, Milan, Italy	367246	Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E)	BD Italy SpA, Milan, Italy	365975	Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm	Nipro, Osaka, Japan	PSY-23-ET-ICU	Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R	DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England	112000033	Material
Cotton suture 3-0	Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA	7343H	Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam	Dechra Veterinary Products, Torino, Italy	105183014 (AIC)	Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	PNM-VIDEO-008	Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up	EZVIZ Network, Hangzhou, Cina	EZVIZ (V5.3.2)	Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity	Laboratoire Garcin-Bactinyl, France	LB 920111	Solution
Dummy guide cannula 8 mm	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	CXD-8	Material
Electrode 3-channel two-twisted	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Electrode holder for stereotxic surgery	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	1776-P1	Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6137	Equipment
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL	Eppendorf Srl, Milan, Italy	30124332	Material
Eppendorf μCuvette G1.0	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6138	Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo	Zoetis, Rome, Italy	103287025 (AIC)	Solution
Ketamine (Imalgene)	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Lithium chloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	L9650	Material
Microinjection cannula 31G 9 mm	Agn Tho's, Lindigö Sweden	CXMI-9	Material
MP150 modular data acquisition and analysis system	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night	Ursapharm, Milan, Italy	941791927 (AIC)	Material
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	P6503	Material
PTFE Tube with joint	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	JT-10	Material
Saline	0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0		Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S2250	Material
Scopolamine methyl nitrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S1876	Material
Silver sulfadiazine 1% cream	Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy	025561010 (AIC)	Material
Simplex rapid dental methacrylic cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA	Model 963	Equipment
Sucrose solution	10% sucrose in distilled water	Home-made	Solution
Syringe 1 mL	Biosigma, Cona, Venezia, Italy	20,71,26,03,00,350	Material
Telemeters	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	CTA-F40	Material
Telemetry EEG traces analyzer	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	NeuroScore v3-0	Equipment
Telemetry system	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	Hardware plus software Ponemah core 6.51	Equipment
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	X1251	Material