Campionamento del liquido cerebrospinale e del sangue dalla vena caudale laterale nei ratti durante le registrazioni EEG

Riepilogo

Il protocollo mostra ripetute raccolte di liquido cerebrospinale e sangue da ratti epilettici eseguite in parallelo con il monitoraggio continuo del video-elettroencefalogramma (EEG). Questi sono fondamentali per esplorare i possibili collegamenti tra i cambiamenti in varie molecole del fluido corporeo e l'attività convulsiva.

Abstract

Poiché la composizione dei fluidi corporei riflette molte dinamiche fisiologiche e patologiche, i campioni di liquidi biologici sono comunemente ottenuti in molti contesti sperimentali per misurare molecole di interesse, come ormoni, fattori di crescita, proteine o piccoli RNA non codificanti. Un esempio specifico è il campionamento di liquidi biologici nella ricerca di biomarcatori per l'epilessia. In questi studi, è auspicabile confrontare i livelli di molecole nel liquido cerebrospinale (CSF) e nel plasma, prelevando CSF e plasma in parallelo e considerando la distanza temporale del prelievo da e verso le convulsioni. Il campionamento combinato del liquido cerebrospinale e del plasma, abbinato al monitoraggio video-EEG negli animali epilettici, è un approccio promettente per la convalida di potenziali biomarcatori diagnostici e prognostici. Qui viene descritta una procedura di prelievo combinato di liquido cerebrospinale dalla cisterna magna e prelievo di sangue dalla vena caudale laterale nei ratti epilettici che sono continuamente monitorati tramite video-EEG. Questa procedura offre vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate. Consente un campionamento rapido con dolore o invasività minimi e tempi di anestesia ridotti. Inoltre, può essere utilizzato per ottenere campioni di liquido cerebrospinale e plasma in ratti registrati EEG sia legati che telemetrici e può essere utilizzato ripetutamente per più giorni di esperimento. Riducendo al minimo lo stress dovuto al campionamento accorciando l'anestesia con isoflurano, ci si aspetta che le misure riflettano in modo più accurato i livelli reali delle molecole indagate nei biofluidi. A seconda della disponibilità di un test analitico appropriato, questa tecnica può essere utilizzata per misurare i livelli di molecole multiple e diverse eseguendo contemporaneamente la registrazione EEG.

Introduzione

Il liquido cerebrospinale (CSF) e il prelievo di sangue sono importanti per identificare e convalidare i biomarcatori dell'epilessia, sia nella ricerca preclinica che in quella clinica ^1,2. Al giorno d'oggi, la diagnosi di epilessia e la maggior parte della ricerca sui biomarcatori dell'epilessia si concentrano sull'EEG e sul neuroimaging ^3,4,5. Questi approcci, tuttavia, presentano diverse limitazioni. Oltre alle misurazioni di routine del cuoio capelluto, in molti casi, l'EEG richiede tecniche invasive come gli elet....

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Ferrara e dal Ministero della Salute (autorizzazione: D.M. 603/2022-PR) in conformità alle linee guida delineate nella Direttiva del Consiglio delle Comunità Europee del 24 novembre 1986 (86/609/CEE) sulla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali e ad altri fini scientifici. Questo protocollo è specificamente adattato per ulteriori analisi quantitative della reazione a catena della polimerasi (qPCR) di piccoli acidi ribonucleici non codificanti (sncRNA) nel liquido cerebrospinale e nel plasma di ratto ottenuti sotto contro....

Discussione

Il presente lavoro illustra una tecnica di raccolta del liquido cerebrospinale e del sangue nei ratti, che può essere utile non solo per studi in modelli di epilessia ma anche di altre condizioni o malattie neurologiche come l'Alzheimer, il Parkinson o la sclerosi multipla. Nella ricerca sull'epilessia, entrambe le procedure di campionamento abbinate al video-EEG sono ideali quando viene perseguita una correlazione tra i livelli di diverse molecole solubili e l'attività convulsiva. Per questo specifico motivo, è stata.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok	BD Italy SpA, Milan, Italy	367246	Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E)	BD Italy SpA, Milan, Italy	365975	Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm	Nipro, Osaka, Japan	PSY-23-ET-ICU	Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R	DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England	112000033	Material
Cotton suture 3-0	Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA	7343H	Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam	Dechra Veterinary Products, Torino, Italy	105183014 (AIC)	Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	PNM-VIDEO-008	Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up	EZVIZ Network, Hangzhou, Cina	EZVIZ (V5.3.2)	Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity	Laboratoire Garcin-Bactinyl, France	LB 920111	Solution
Dummy guide cannula 8 mm	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	CXD-8	Material
Electrode 3-channel two-twisted	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Electrode holder for stereotxic surgery	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	1776-P1	Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6137	Equipment
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL	Eppendorf Srl, Milan, Italy	30124332	Material
Eppendorf μCuvette G1.0	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6138	Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo	Zoetis, Rome, Italy	103287025 (AIC)	Solution
Ketamine (Imalgene)	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Lithium chloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	L9650	Material
Microinjection cannula 31G 9 mm	Agn Tho's, Lindigö Sweden	CXMI-9	Material
MP150 modular data acquisition and analysis system	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night	Ursapharm, Milan, Italy	941791927 (AIC)	Material
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	P6503	Material
PTFE Tube with joint	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	JT-10	Material
Saline	0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0		Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S2250	Material
Scopolamine methyl nitrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S1876	Material
Silver sulfadiazine 1% cream	Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy	025561010 (AIC)	Material
Simplex rapid dental methacrylic cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA	Model 963	Equipment
Sucrose solution	10% sucrose in distilled water	Home-made	Solution
Syringe 1 mL	Biosigma, Cona, Venezia, Italy	20,71,26,03,00,350	Material
Telemeters	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	CTA-F40	Material
Telemetry EEG traces analyzer	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	NeuroScore v3-0	Equipment
Telemetry system	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	Hardware plus software Ponemah core 6.51	Equipment
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	X1251	Material