Забор спинномозговой жидкости и крови из боковой хвостовой вены у крыс во время регистрации ЭЭГ

Резюме

Протокол показывает повторные заборы спинномозговой жидкости и крови у крыс с эпилепсией, проводимые параллельно с непрерывным видео-электроэнцефалограммой (ЭЭГ). Они играют важную роль в изучении возможных связей между изменениями в различных молекулах жидкостей организма и судорожной активностью.

Аннотация

Поскольку состав жидкостей организма отражает многие физиологические и патологические процессы, образцы биологической жидкости обычно получают во многих экспериментальных контекстах для измерения молекул, представляющих интерес, таких как гормоны, факторы роста, белки или небольшие некодирующие РНК. Конкретным примером является отбор проб биологических жидкостей при исследовании биомаркеров эпилепсии. В этих исследованиях желательно сравнивать уровни молекул в спинномозговой жидкости (СМЖ) и в плазме, проводя параллельный забор ликвора и плазмы и учитывая временное расстояние забора проб от судорог и до судорог. Комбинированный забор ликвора и плазмы крови в сочетании с видео-ЭЭГ-мониторингом у животных с эпилепсией является перспективным подходом для валидации предполагаемых диагностических и прогностических биомаркеров. Описана процедура комбинированного забора ликвора из большой цистерны и забора крови из боковой хвостовой вены у крыс с эпилепсией, находящихся под непрерывным видео-ЭЭГ-контролем. Эта процедура имеет значительные преимущества по сравнению с другими широко используемыми методами. Это позволяет быстро взять пробы с минимальной болью или инвазивностью, а также сократить время анестезии. Кроме того, он может быть использован для получения образцов спинномозговой жидкости и плазмы крови крыс, зарегистрированных как на привязной, так и на телеметрической ЭЭГ, и может быть использован многократно в течение нескольких дней эксперимента. Ожидается, что за счет минимизации стресса, связанного с отбором проб за счет сокращения анестезии изофлураном, меры будут более точно отражать истинные уровни исследуемых молекул в биожидкостях. В зависимости от наличия соответствующего аналитического анализа, этот метод может быть использован для измерения уровней нескольких различных молекул при одновременной регистрации ЭЭГ.

Введение

Забор спинномозговой жидкости (ликвора) и крови важен для выявления и валидации биомаркеров эпилепсии как в доклинических, так и в клинических исследованиях ^1,2. В настоящее время диагностика эпилепсии и большинство исследований биомаркеров эпилепсии сосредоточены на ЭЭГ и нейровизуализации ^3,4,5. Однако эти подходы имеют ряд ограничений. Помимо рутинных измерений кожи головы, во многих случаях ЭЭГ требует инвазивных методов, таких как глубинные электроды⁶. Методы визуализации головного мозга имеют низкое временное и пространственное разрешение и являются относительно дорогими и трудоемкими ^7,8. По этой причине идентификация неинвазивных, недорогих биомаркеров на основе биожидкостей была бы очень привлекательной альтернативой. Кроме того, эти биомаркеры биожидкости могут быть объединены с доступными диагностическими подходами для повышения их прогностической способности.

Пациентам с диагнозом эпилепсия обычно проводят ЭЭГ ^9,10 и забор крови 11,12,13,14, а также выводят ликвор для исключения опасных для жизни причин (например, острых инфекций, аутоиммунного энцефалита)¹⁵. Эти образцы крови и спинномозговой жидкости могут быть использованы в клинических исследованиях, направленных на выявление биомаркеров эпилепсии. Например, Хогг и его коллеги обнаружили, что увеличение трех фрагментов тРНК плазмы предшествует возникновению судорог при эпилепсии у^{человека.} Аналогичным образом, уровни интерлейкина-1бета (IL-1β) в ликворе и сыворотке крови человека, выраженные как отношение уровней IL-1β в ликворе к сыворотке крови, могут предсказывать развитие посттравматической эпилепсии после черепно-мозговой травмы¹⁶. Эти исследования подчеркивают важность отбора проб биожидкостей для исследования биомаркеров эпилепсии, но они сталкиваются с многочисленными ограничениями, присущими клиническим испытаниям, например, сопутствующим фактором противоэпилептических препаратов (ПЭП) в крови, частым недостатком этиологической информации, неадекватным контролем, умеренным числом пациентов и др. ^17,18.

Доклинические исследования предлагают другие возможности для изучения молекул в биожидкостях в качестве потенциальных биомаркеров эпилепсии. На самом деле, во время регистрации ЭЭГ у животных можно изъять плазму и/или ликвор. Кроме того, отбор проб может проводиться многократно в течение нескольких дней эксперимента, и для повышения надежности исследования может быть использован ряд контрольных групп по возрасту, полу и эпилептическому расстройству. Подробно описана гибкая методика получения ликвора из cisterna magna с параллельным забором плазмы из хвостовой вены у крыс с ЭЭГ-мониторингом. Представленная методика имеет ряд преимуществ перед альтернативными методами. Используя метод иглы-бабочки, можно собирать ликвор несколько раз без ущерба для функции электродов ЭЭГ или аналогичных головных имплантатов. Это представляет собой усовершенствование процедур удаления интратекального катетера, которые связаны с относительно высоким риском инфекции. Кроме того, метод свободного падения, используемый для забора крови, превосходит другие методы забора крови из хвостовых вен из-за значительно сниженного риска гемолиза из-за того, что кровь не проходит через трубку и не применяется вакуумное давление. При выполнении в строгих условиях, свободных от микробов, риск заражения животных особенно низок. Кроме того, начав забор крови на самом конце хвоста животного, забор крови можно повторить несколько раз. Такие методики просты в освоении и могут применяться во многих доклинических исследованиях заболеваний центральной нервной системы.

протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Феррары и Министерством здравоохранения Италии (разрешение: D.M. 603/2022-PR) в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Директиве Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC) о защите животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Этот протокол специально адаптирован для дальнейшего количественного анализа полимеразной цепной реакции (кПЦР) малых некодирующих рибонуклеиновых кислот (sncRNAs) в ликворе и плазме крыс, полученных под контролем ЭЭГ, у животных с эпилепсией. По желанию, пожалуйста, посмотрите соответствующее видео JoVE для лучшего понимания и улучшения операции 19,20,21.

1. Подготовка животных к хирургической имплантации электродов или телеметров

ПРИМЕЧАНИЕ: Техника стереотаксической хирургии варьируется в зависимости от используемой системы ЭЭГ. В следующем разделе метода приведено описание этапов, общих для этих двух типов операций.

1. Используйте крыс Sprague-Dawley (SD) (самцы, 7-8 недель, массой 250-290 г), содержащихся в соответствии с местными законами об уходе и использовании лабораторных животных. Содержать животных в стандартных условиях со свободным доступом к корму и питьевой воде.
2. Продолжайте работать с крысами в течение нескольких дней до операции и процедур экспериментального протокола.
3. Используйте стереотаксический аппарат для имплантации электродов или телеметров. Соблюдайте современные стандарты проведения асептических операций. Используйте стерильные и исправные электроды и передатчики.
4. Побрейте голову животного электробритвой. Индуцируют анестезию животного смесью кетамина (45 мг/кг) и ксилазина (7,5 мг/кг), вводимой внутрибрюшинно (в/в), затем добавляют изофлурановую анестезию (1,4% в воздухе; 1,2 мл/мин), вводимую через лицевую маску, и фиксируют голову животного в стереотаксическом аппарате.
5. Обеспечьте достаточную глубину анестезии, проверив рефлекс отведения педали после защемления подушечки лапы на задних лапах обоих животных, и поддерживайте анестезию изофлураном до конца операции. Регулярно проверяйте глубину анестезии на протяжении всей процедуры.
6. Нанесите достаточное количество глазной мази на глаза обоим животным, чтобы предотвратить повреждение роговицы из-за потери рефлекса моргания, вызванной анестезией.
7. Тщательно очистите кожу головы животного жидким дезинфицирующим средством и сделайте продольный надрез длиной 2 см стерилизованным скальпелем. Откройте кожу головы и наложите хирургические зажимы на кожные лоскуты, чтобы они оставались открытыми.
8. Осторожно отсоедините надкостницу, чтобы обнажить брегму и область черепа, через которую будет введен регистрирующий электрод.

2. Хирургическая имплантация привязных электродов

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением процедуры пункционного изъятия ликвора по данному протоколу (см. шаг 9 для получения подробной информации) были проведены повторные заборы ликвора с помощью направляющей канюли у нескольких свободно движущихся неанестезируемых крыс. Для оценки влияния имплантатов с двойной головкой на долгосрочную регистрацию ЭЭГ в сочетании с множественным отбором проб ликвора использовали животных, которым имплантировали канюлированные электроды. В этих специфических экспериментах крысам имплантировали фиктивную направляющую канюлю, помещенную в большую цистерну, кончик которой вводился в нее стереотаксически на 7 мм, согласно ранее опубликованным протоколам²². Подходы к хирургии с использованием двойных имплантатов были аналогичны тем, которые применялись некоторыми работниками в прошлом для микродиализных канюль и имплантации привязанных электродов^23,24.

1. Используйте один рычаг стереотаксической рамки, установите на него держатель электрода и поместите электрод вертикально в держатель. Переместите наконечник электрода точно над брегмой. Запишите переднезаднюю и медиолатеральную координаты брегмы и переведите их в нужные координаты.
2. Опускайте электрод до тех пор, пока его кончик почти не коснется черепа. Отметьте место сверления и просверлите череп на отмеченном месте. Будьте осторожны, чтобы не повредить мозг и мозговые оболочки.
3. Сделайте четыре или более отверстий для анкерных шурупов и вкрутите их в череп. Обратите внимание на размер электрода при проделывании отверстий для анкеровочных винтов. Размер электрода не должен мешать расположению анкерных винтов.
4. Медленно опустите стереотаксическую руку, несущую электрод, на дорсовентральную ось, войдите в ткань мозга и остановитесь в нужном положении. Закрепите провод заземления электрода вокруг одного из винтов, ввинченных в череп.
5. Нанесите метакриловый цемент на электрод и винты, покрывающие примерно половину высоты пьедестала электрода. Оставьте верхнюю половину электрода, которая подходит к концу провода привязки, голой.
6. Извлеките электрод из держателя и поднимите стереотаксический кронштейн. Освободите животное от стереотаксического аппарата и обеспечьте ему послеоперационный уход.
7. Поместите животное в отдельную клетку для восстановления и наблюдайте за ним каждые 10 минут до тех пор, пока оно не придет в себя и не начнет ходить. Возвращайте животное в стандартную клетку и в другую компанию без анестезии только после полного выздоровления.

3. Хирургическая имплантация телеметров

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только стерильные телеметры. Если телеметры используются повторно, очистите и простерилизуйте их перед операцией в соответствии с инструкциями производителя. В этом протоколе для регистрации ЭЭГ использовались телеметры Data Science International (DSI).

1. Включите телеметрический передатчик с помощью магнита и проверьте сигнал с помощью радиоприемника AM-частоты. Перед операцией проверьте наличие сильного и четкого сигнала. При необходимости откажитесь от плохо работающих телеметров.
2. Подготовьте провода телеметра, укоротив их до оптимальной длины для взрослых крыс. Отклейте силиконовое покрытие на двух выводах (отрицательном и положительном), обнажив примерно 5 мм винтового стального вывода. Создайте петлевую ручку длиной около 2 мм и шириной 1 мм на кончиках поводков.
3. Сбрейте бок животного под левым плечом и за ним. Продезинфицируйте область операции дезинфицирующим средством на основе стабилизированных пероксидов и четвертичной аммонийной активности. Дайте дезинфицирующему средству подействовать в течение 15 минут.
4. Сделайте боковой разрез длиной около 2 см сразу за плечом животного и сделайте подкожный карман площадью около 5^см3 для размещения передатчика. Расположите передатчик параллельно длинной оси корпуса так, чтобы провода были направлены в ростральном направлении.
5. Прикрепите передатчик к внутренней стенке подкожного кармана хлопчатобумажным швом 3-0. С помощью ножниц с тупым концом создайте подкожный туннель (примерно 2,5 см в длину) через бок и шею животного, соединив таким образом карман передатчика со срединным разрезом, сделанным на волосистой части головы животного на шаге 1,6.
6. Возьмите оба телеметра с помощью щипцов и протяните их вверх через туннель так, чтобы они выступали из отверстия разреза кожи головы. Выньте проводники из разреза волосистой части головы с помощью зажимов для раны.
7. Используйте стереотаксическую рамку, чтобы определить желаемые координаты для положительного (красного) провода и просверлите отверстие в черепе для положительного наконечника свинца (аналогично шагу 2.1.). Сделайте еще одно отверстие для крепления винта вверх к роструму и вкрутите его в череп.
8. Вставьте наконечник положительного свинца под тюбетейку и твердую мозговую оболочку и положите его на поверхность мозга. Зацепите петлеобразный наконечник отрицательного (белого) свинца на винт. Нанесите небольшое количество метакрилового цемента вокруг положительного свинцового выходного отверстия и отрицательного свинца, чтобы обездвижить их на черепе.
9. Зафиксируйте провода к внутренней стенке кожи черепа хлопчатобумажным швом 3-0. Убедитесь, что несъемные отводы и фиксирующий шов не будут мешать месту отведения ликвора (т.е. вдавленной поверхности с появлением ромба между затылочным выступом и позвоночником атланта).
10. Закройте разрез волосистой части головы и боковой разрез с помощью хлопчатобумажного шва 3-0. Нанесите дезинфицирующие средства на раны. Только после того, как они высохнут, нанесите крем с антибиотиком на зашитые раны.

4. Послеоперационный уход

1. Наблюдайте за животными в течение примерно 1 часа после операции до тех пор, пока они не встанут в вертикальное положение и не начнут перемещаться по клетке. Держите их на грелке, чтобы не допустить переохлаждения. Вводите животным системный антибиотик для предотвращения инфекции и системный анальгетик для предотвращения послеоперационной боли в течение 2-3 дней.
2. Дайте крысам восстановиться в течение не менее 7 дней после хирургических процедур. Наблюдайте за животными не реже одного раза в день в течение 3 дней на предмет признаков боли или стресса.

5. Индукция эпилептического статуса у крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол индукции эпилептического статуса (СЭ), необходимый для воспроизведения мезиальной височной эпилепсии (mTLE) у крыс, см. в Guarino et ^al.25.

1. После недели послеоперационного восстановления распределите животных случайным образом по группам: (i) контрольные животные, получающие транспортное средство, и (ii) животные с эпилепсией, которые будут получать пилокарпин. Используйте пропорционально большее количество животных для группы эпилептиков, так как не все крысы, получавшие пилокарпин, выживут или разовьют СЭ.
2. За сутки до индукции СЭ животным дают разовую дозу 127 мг/кг хлорида лития, растворенного в 0,9% физиологическом растворе (3М) в объеме 1 мл/кг через желудочный зонд. Вводят животному литий, который повышает эффективность пилокарпина²⁶, примерно за 14 ч до индукции СЭ, чтобы уменьшить вариабельность во времени до начала СЭ.
3. Примерно через 14 ч после введения лития крысам делают однократную инъекцию метилскополамина (1 мг/кг, подкожно).
4. Ровно через 30 мин после введения метилскополамина крысам делают однократную инъекцию пилокарпина (50 мг/кг, в/м) для индуцирования СЭ. Дают метилскополамин и носитель (0,9% раствор NaCl) для контроля крыс.
   1. Инъекция пилокарпина вызывает типичное поведение у животных: ранние парциальные судороги (движения вибриссы и кивки головы в течение 5 мин после введения пилокарпина), переходящие в рецидивирующие генерализованные судороги (СЭ) в течение 25-30 мин. Крысам, у которых СЭ не развивается в течение 30 мин, вводят дополнительную дозу пилокарпина (25 мг/кг, в/м), и если у них по-прежнему не развивается СЭ, исключают их из исследования (СЭ, не отвечающие на СЭ).
5. Наблюдайте и оценивайте судорожное поведение у крыс каждые 5 минут, начиная сразу после инъекции пилокарпина. Используйте шкалу Расина, чтобы набрать²⁷ баллов.
6. Прерывают СЭ через 2 ч после начала в/в введением коктейля препаратов: диазепама (10 мг/кг), фенобарбитала (25 мг/кг) и скополамина (1 мг/кг).
7. Дайте крысам этот коктейль снова через 4 ч. Наконец, еще через 4 ч дают крысам в/в последнюю смесь препаратов (диазепам 10 мг/кг плюс скополамин 1 мг/кг), чтобы полностью прекратить судорожную активность.
8. Животным внутривенно вводят физиологический раствор (1 мл 0,9% раствора NaCl, рН доведен до 7,0) и кормят их 10% раствором сахарозы в течение 2-3 дней после СЭ для восстановления после потери массы тела, которая следует за СЭ.
9. Распределить выживших после СЭ животных случайным образом в разные экспериментальные группы в соответствии с требованиями конкретного экспериментального протокола. Для дальнейших экспериментов на крысах с эпилепсией используют следующие критерии включения/исключения: развитие судорожного СЭ в течение 1 ч после введения пилокарпина, увеличение массы тела в первую неделю после СЭ и правильное расположение электрода в интересующей области мозга для регистрации ЭЭГ²⁵.

6. Привязанная видео-ЭЭГ у крыс с эпилепсией и анализ судорожной активности

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается экспериментальная процедура регистрации сигналов ЭЭГ у свободно движущихся крыс, содержащихся в одном доме, в стандартных условиях. В клетке не должно быть предметов, в которых может застрять животное или записывающий кабель. В зависимости от научного вопроса, который необходимо решить, можно проанализировать несколько параметров. В случае исследования эпилепсии трассы ЭЭГ проверяются для распознавания электрических и двигательных припадков. Наиболее распространенными параметрами, используемыми для выявления припадка, являются амплитуда, частота и продолжительность пароксизмальной электрической активности.

1. Поместите животное в чистую клетку в комнате для записи, чтобы обеспечить привыкание и уменьшить стресс, вызванный новой средой. Поместите клетку животного в клетку Фарадея, чтобы избежать загрязнения сигнала EGG электромагнитным полем окружающей среды.
2. Подключите один конец записывающего кабеля к записывающему устройству. Используйте вольтметр для измерения электрического потенциала и различения заземляющих и опорных электродов.
3. Другой конец записывающего кабеля подсоедините к электроду, закрепленному на голове крысы. Для этого удерживайте цементную крышку на голове животного при вставке штекера кабеля в разъем электрода и избегайте давления на голову крысы.
4. Уравновешивайте вес записывающего кабеля, чтобы обеспечить свободное перемещение животного, предотвращая при этом риск перекручивания кабеля. Для этого используют уравновешивающий рычаг или коммутаторы. Даже если записывающий кабель уравновешен, кладите корм внутрь клетки, а не в кормушку, в которой животные должны подниматься, чтобы дотянуться до корма.
5. Перед началом регистрации проверьте все настройки, используемые для получения и обработки данных с ЭЭГ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не содержит ознакомления с аппаратурой, необходимой для регистрации ЭЭГ, однако следует применять адекватную частоту фильтрации и дискретизации, чтобы избежать артефактов и шумов в сигналах ЭЭГ.
   1. Для обычного эксперимента установите частоту дискретизации 500 Гц и усиление усиления на 5000x. Отфильтруйте сигнал с помощью фильтра 0,005 Гц в дополнение к режекторному фильтру, чтобы отбросить окружающую электрическую активность в диапазоне 50 Гц (характерно для европейских стран).
6. Запустите запись видео и ЭЭГ и убедитесь, что трассы соответствуют ожидаемому сигналу ЭЭГ, проверив мощность в определенных частотных диапазонах в течение всего времени. Запишите исходный период перед началом вмешательства на животных.
7. Периодически проверяйте животных и следы ЭЭГ. Нередки случаи, когда записывающий кабель отсоединяется от разъема электрода в голове крысы. В этом случае снова подсоедините электрод в головке крысы к записывающему кабелю и проверьте наличие четкого сигнала ЭЭГ.
8. Анализируйте сигнал ЭЭГ вручную или автоматически с помощью имеющегося в продаже программного обеспечения. При анализе вручную просмотрите запись ЭЭГ, чтобы выявить судорожно-подобную активность. Если предполагается использовать программное обеспечение, настройте ключевые параметры приступа, такие как амплитуда, частота и продолжительность электрической активности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одиночный приступ может характеризоваться электрической активностью с амплитудой в 3 раза выше исходного уровня, частотой, равной или превышающей 5 Гц, и продолжительностью не менее 5 с²².
9. Независимо от используемого метода, подтвердите возможные судорожные припадки, проверив синхронизированную видеозапись, собранную одновременно с ЭЭГ.

7. Телеметрическая видео-ЭЭГ у крыс с эпилепсией и анализ судорожной активности

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается экспериментальная процедура регистрации радиотелеметрических сигналов ЭЭГ у одиноких, свободно движущихся крыс в стандартных условиях. Протокол основан на коммерчески доступной системе телеметрии. Однако некоторые телеметрические системы незначительно отличаются по своим функциональным и техническим характеристикам. Система должна выбираться в зависимости от требований лаборатории и целей исследования.

1. Поместите домашнюю клетку для животных над приемником сигнала. Подключите приемник сигнала к системе сбора данных, а затем к компьютеру с программным обеспечением для сбора данных.
2. Включите радиочастотный телеметрический имплантат, поместив магнит в непосредственной близости от телеметра, вставленного в бок крысы. Проверьте сигнал с помощью радиоустройства. Используйте универсальное радиоустройство для проверки телеметров и услышите четкий звуковой сигнал, указывающий на то, что телеметр активирован, а шипящий звук указывает на то, что телеметр неактивирован.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Срок службы батареи радиочастотного передатчика следует учитывать перед определением продолжительности записи.
3. Настройте программное обеспечение для сбора данных и синхронизируйте телеметрический сигнал и видеосистему для одновременного сбора данных ЭЭГ и видео. Назначьте по одному приемнику сигнала для каждого имплантированного передатчика и установите значения калибровки передатчика. Установите частоту дискретизации 1000 Гц, обнаружение шума в диапазоне от -500 мВ до +500 мВ и интервал интегрирования 100 мс. Не используйте фильтры низких и высоких частот.
4. Запустите телеметрию и видеозаписи. Выполняйте длительную базовую запись перед приобретением эпилептической активности. Проанализируйте сигнал ЭЭГ, как описано в шагах 6.8 и 6.9.

8. Процедура забора крови из хвостовой вены

ЗАМЕТКА. Вакуумная система забора крови состоит из иглы-бабочки (23 г x 3/4 x 12 (0,8 мм x 19 мм x 305 мм). Техника забора крови может быть легко выполнена одним оператором, а процедура занимает около 5 минут.

1. Смажьте иглу-бабочку и ее трубку 1%-ным_К2ЭДТА в дистиллированной воде незадолго до забора, т.е. втяните и вытесните раствор_К2ЭДТА из системы с помощью шприца объемом 1 мл. Разрежьте трубку сразу за иглой, чтобы собирать кровь капля за каплей, без аспирации (Рисунок 1A).
2. Поместите крысу в индукционную камеру и обезболите изофлураном (1,4% в воздухе; 1,2 мл/мин). Переключитесь на стереотаксическую рамку и поддерживайте анестезию через лицевую маску. Подложите грелку под животное, сохраняя часть его хвоста в непосредственном контакте с подушечкой.
3. Осторожно отведите спину животного в сторону так, чтобы боковая хвостовая вена оставалась вверху.
4. Опустите хвост в теплую воду (42 °C) на 2 минуты, чтобы расширить боковую вену. Протрите хвост 70% этиловым спиртом, чтобы сделать вену более заметной. Поставьте теплый свет на хвост с помощью обычной лампы накаливания.
5. Введите иглу-бабочку 21G в боковую хвостовую вену глубиной 5 мм и углом 20°. Соберите кровь в вакуумную пробирку объемом 500 мкл, содержащую 5 мг_К2ЭДТА в качестве антикоагулянта (рис. 1B, C).
6. Извлеките иглу и остановите поток крови, надавливая на место прокола. Верните крысу в ее домашнюю клетку.
7. Осторожно переверните пробирку 10 раз, чтобы смешать антикоагулянт с кровью. Сделайте отверстия глубиной около 1,5 см во льду для размещения сборных трубок. Аккуратно и вертикально положите образец на лед.
8. Центрифугируют образец крови в охлажденной центрифуге (4 °C) при 1300 x g в течение 10 мин для отделения плазмы. Выполняйте эту процедуру не позднее, чем через 1 час.
9. Возьмите около 200 мкл плазмы, избегая слоя эритроцитов и лейкоцитов. Изъятую плазму помещают в стерильную микропробирку объемом 0,2 мл. При необходимости хранить при температуре 4 °C до 1 ч после центрифугирования.
10. Отложите 5 мкл образца для контроля качества. Храните образец при температуре -80 °C до проведения анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте вакуум, даже если это рекомендовано некоторыми исследователями²⁸ или доить хвост во время процедур, описанных в шаге 8.5, для получения большего количества крови, так как это снижает качество образца для следующего количественного анализа sncRNC (подробности см. в разделе «Репрезентативные результаты»). Имейте в виду, что у крыс максимальное количество крови, которое может быть взято за один раз, составляет <10% от ее общего объема крови (т.е. около 1,6-1,9 мл у крысы весом 250-300 г) и <15% от общего объема крови (около 2,64 мл) за 1 месяц²⁹. В этом протоколе используется максимум 500 мкл крови, взятой за один раз до пяти раз у одного животного^30,31.

9. Порядок сбора ликвора

ЗАМЕТКА. Техника может быть легко выполнена одним оператором, и процедура занимает около 2-4 минут. Материалы, используемые для сбора ликвора, представляют собой недорогие одноразовые вакуумные иглы-бабочки и экстракционные пробирки. В этом протоколе для создания вакуума используется инфузионный набор в виде крыльев бабочки, подключенный к стерильному шприцу (рис. 2А).

1. Подготовьте иглу-бабочку 23G, обрезав ее пластиковую защиту втулки так, чтобы конец голой иглы был открыт на 7 мм, чтобы предотвратить ее проникновение более чем на 7 мм вглубь цистерны во время извлечения (Рисунок 2B).
2. Подсоедините иглу-бабочку, снабженную полимерной трубкой, к шприцу объемом 1 мл.
3. Поместите крысу в индукционную камеру и обезболите изофлураном (1,4% в воздухе; 1,2 мл/мин). Переключите поток изофлурана на стереотаксическую рамку и поддерживайте анестезию, подаваемую через маску для лица. Удалите шерсть на затылке и шее крысы с помощью бритвы.
4. Зафиксируйте голову крысы ушными планками. Опустите голову животного вниз примерно на 45° по вертикали, двигаясь вниз по носовой планке стереотаксической рамы (рис. 2C). Осмотрите заднюю часть головы животного и найдите слегка вдавленную поверхность в форме ромба между затылочным выступом и отростком атланта.
5. Натрите эту поверхность 70% этиловым спиртом, чтобы сделать ее более заметной и продезинфицировать.
6. Введите иглу-бабочку вертикально в центр ромбовидной вдавленной поверхности в cisterna magna для сбора ликвора до тех пор, пока движение не будет заблокировано путем разрезания по размеру пластиковой гильзы защиты иглы (Рисунок 2D). Осторожно оттяните поршень шприца объемом 1 мл, чтобы спинномозговая жидкость медленно протекала через иглу.
7. Соберите около 100 мкл ликвора в полимерную трубку (рис. 2D). Избегайте попадания крови или любых других видимых загрязнений. Сожмите полимерную трубку очень близко к игле-бабочке и обрежьте трубку в этом месте.
8. Наберите прозрачную (незагрязненную) пробу в шприц. Утилизируйте загрязненный образец, если видимые загрязнения попали в сборную трубку.
9. Извлеките образец в стерильную микропробирку объемом 0,2 мл и храните на льду до 1 ч.
10. Продезинфицируйте место изъятия ликвора на голове животного. Извлеките крысу из стереотаксической рамки и поместите ее обратно в клетку.
11. Отложите 2 мкл образца для контроля качества. Храните остальную часть образца при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: У крыс, если многократное изъятие ликвора выполняется неоднократно, рекомендуемый объем для изъятия при каждом сборе составляет 100 мкл³². В этом протоколе было сделано максимум 100 мкл ликвора за один раз с 5-кратным максимальным выводом в течение 15 дней у одного животного.

10. Спектрофотометрический анализ качества образца

ПРИМЕЧАНИЕ: После надлежащего сбора образцов ликвора и плазмы образцы готовы к анализу спектрофотометром и не требуют какого-либо специального обращения. Измерьте абсорбцию гемоглобина с помощью УФ-спектрофотометрии при длине волны 414 нм, чтобы оценить риск гемолиза в образцах. Используйте предельное значение поглощения 0,25 в образцах крыс. Выбор этого предела может зависеть от последующего анализа кПЦР и его специфических требований к количественному определению мнРНК.

1. Включите УФ-спектрофотометр. Выберите метод измерения поглощения на одной длине волны 414 нм для плазмы или ликвора. Нажмите кнопку Далее.
2. Кювету диаметром 1 мм промыть очищенной водой. Нанесите 5 мкл 70% этанола на точку измерения кюветы. Высушите бумажным полотенцем и протрите безворсовой папиросной бумагой. Проверьте, идеально ли он прозрачен.
3. Налейте 1,5 мкл очищенной воды в кювету диаметром 1 мм и закройте ее. Вставьте кювету в измерительную камеру спектрофотометра и измерьте поглощение холостого образца, нажав на кнопку Blank . Убедитесь, что значение поглощения на длине волны 414 нм равно 0,000.
4. Высушите кювету бумажным полотенцем и протрите безворсовой папиросной бумагой. Проверьте, идеально ли он прозрачен.
5. Поместите 1,5 мкл образца в кювету диаметром 1 мм и закройте ее. Вставьте кювету в измерительную камеру спектрофотометра. Измерьте образец, нажав на кнопку Образец . Проверьте абсорбцию образца при длине волны 414 нм и аннотируйте его.
6. Приступайте к количественной оценке абсорбции гемоглобина во всех доступных образцах. Измерьте пустой образец перед любым образцом плазмы или спинномозговой жидкости, нажимая поочередно кнопки «Пустой » и «Образец ».
7. Сохраняйте образцы с длиной волны A414 нм < 0,25 при -80 °C и выбрасывайте образцы, если A414 нм > 0,25.
8. Кювету диаметром 1 мм последовательно промыть очищенной водой с 70% этиловым спиртом. Высушите кювету.
9. Закройте пустую кювету в измерительной камере, чтобы предотвратить ее запыление. Выключите спектрофотометр.

Результаты

Результаты различных процедур ликвора и забора крови, выполненных у 9 контрольных и 18 крыс с хроническим эпилепсией, которым были имплантированы электроды через 1 месяц после СЭ, представлены с точки зрения успешности. После имплантации все крысы проходили видео-ЭЭГ-мониторинг в течени...

Обсуждение

Настоящая работа иллюстрирует простую в освоении технику сбора ликвора и крови у крыс, которая может быть полезна не только для исследований на моделях эпилепсии, но и других неврологических состояний или заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона или рассеянный склероз. В...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok	BD Italy SpA, Milan, Italy	367246	Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E)	BD Italy SpA, Milan, Italy	365975	Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm	Nipro, Osaka, Japan	PSY-23-ET-ICU	Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R	DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England	112000033	Material
Cotton suture 3-0	Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA	7343H	Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam	Dechra Veterinary Products, Torino, Italy	105183014 (AIC)	Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	PNM-VIDEO-008	Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up	EZVIZ Network, Hangzhou, Cina	EZVIZ (V5.3.2)	Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity	Laboratoire Garcin-Bactinyl, France	LB 920111	Solution
Dummy guide cannula 8 mm	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	CXD-8	Material
Electrode 3-channel two-twisted	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Electrode holder for stereotxic surgery	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	1776-P1	Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6137	Equipment
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL	Eppendorf Srl, Milan, Italy	30124332	Material
Eppendorf μCuvette G1.0	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6138	Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo	Zoetis, Rome, Italy	103287025 (AIC)	Solution
Ketamine (Imalgene)	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Lithium chloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	L9650	Material
Microinjection cannula 31G 9 mm	Agn Tho's, Lindigö Sweden	CXMI-9	Material
MP150 modular data acquisition and analysis system	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night	Ursapharm, Milan, Italy	941791927 (AIC)	Material
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	P6503	Material
PTFE Tube with joint	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	JT-10	Material
Saline	0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0		Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S2250	Material
Scopolamine methyl nitrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S1876	Material
Silver sulfadiazine 1% cream	Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy	025561010 (AIC)	Material
Simplex rapid dental methacrylic cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA	Model 963	Equipment
Sucrose solution	10% sucrose in distilled water	Home-made	Solution
Syringe 1 mL	Biosigma, Cona, Venezia, Italy	20,71,26,03,00,350	Material
Telemeters	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	CTA-F40	Material
Telemetry EEG traces analyzer	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	NeuroScore v3-0	Equipment
Telemetry system	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	Hardware plus software Ponemah core 6.51	Equipment
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	X1251	Material