Fabrication de nanocomposites antibactériens d’oxyde de graphène et de cuivre

Résumé

Dans cet article, nous présentons les nanocomposites d’oxyde de graphène/cuivre (GO/Cu) en tant que nanomatériau antibactérien. L’efficacité antibactérienne des nanocomposites GO/Cu a été évaluée contre des bactéries à Gram positif et à Gram négatif résistantes aux antibiotiques.

Résumé

Les antibiotiques sont actuellement le traitement antibactérien le plus utilisé pour tuer les bactéries. Cependant, les bactéries développent une résistance lorsqu’elles sont continuellement surexposées aux antibiotiques. Il est essentiel de mettre au point des agents antimicrobiens capables de remplacer les antibiotiques existants, car les bactéries résistantes aux antibiotiques ont des mécanismes de résistance à tous les antibiotiques actuels et peuvent favoriser les infections nosocomiales. Pour relever ce défi, dans cette étude, nous proposons des nanocomposites d’oxyde de graphène/cuivre (GO/Cu) comme matériaux antibactériens pouvant remplacer les antibiotiques existants. Les nanocomposites GO/Cu sont caractérisés par la microscopie électronique à transmission et la microscopie électronique à balayage. Ils montrent que les nanoparticules de cuivre (Cu) sont bien développées sur les feuilles d’oxyde de graphène. De plus, une méthode de bouillon de microdilution est utilisée pour confirmer l’efficacité de la substance antimicrobienne contre le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) et Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), qui sont fréquemment impliqués dans les infections nosocomiales. Plus précisément, 99,8 % du SARM et 84,7 % de P. aeruginosa sont éliminés par 500 μg/mL de nanocomposites GO/Cu. Les nanocomposites métalliques peuvent éradiquer les bactéries résistantes aux antibiotiques en libérant des ions, en formant des espèces réactives de l’oxygène et en endommageant physiquement les bactéries. Cette étude démontre le potentiel des nanocomposites antibactériens GO/Cu dans l’éradication des bactéries résistantes aux antibiotiques.

Introduction

Les infections bactériennes ont un impact significatif sur la santé publique. Les bactéries pathogènes, en particulier, peuvent échapper aux mécanismes de protection de l’organisme et provoquer des maladies¹. Les antibiotiques sont largement utilisés pour traiter les infections bactériennes. Cependant, l’utilisation inappropriée des antibiotiques a précipité l’émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques. Actuellement, les infections nosocomiales attribuables à des bactéries résistantes aux antibiotiques ont provoqué des complications notables dans les établissements de santé². Malheureusement, les bactéries ont des mécanismes de résistance pour tous les antibiotiques actuels³. Par conséquent, le développement de nouveaux antibiotiques est essentiel, bien qu’il existe également une forte probabilité que des mécanismes de résistance apparaissent.

Les nanoparticules métalliques sont devenues des agents prometteurs pour lutter contre les bactéries résistantes aux antibiotiques en raison de leurs propriétés antibactériennes efficaces ^4,5,6. Il est difficile pour les bactéries de développer des mécanismes de résistance contre les nanoparticules métalliques car elles ne se lient à aucun récepteur bactérien spécifique⁷. En particulier, les nanoparticules d’argent, de cuivre et d’oxyde de zinc font l’objet de recherches approfondies en raison de leur efficacité antibactérienne remarquable 8,9,10,11,12,13. La toxicité des nanoparticules métalliques envers les bactéries est attribuée à trois mécanismes principaux : 1) la libération d’ions métalliques, 2) la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), telles que •OH et •O₂−, et 3) l’interaction physique et ^{l’attachement 4,14}.

Dans cette étude, des nanocomposites d’oxyde de graphène/cuivre (GO/Cu) ont été développés en tant qu’agent antimicrobien. Le cuivre (Cu) tue efficacement les agents pathogènes qui rencontrent sa surface et interfère avec la réplication des gènes bactériens. Cependant, il s’agit d’un micro-élément essentiel dans le corps humain, et il est moins toxique pour les cellules de mammifères car il possède des mécanismes homéostatiques qui régulent les concentrations de Cu à l’intérieur des cellules⁴. Lorsque les nanoparticules de Cu sont oxydées, elles génèrent des ions Cu, qui ont une affinité relativement élevée pour les bactéries chargées négativement^15,16. Les ions Cu se lient aux structures cellulaires (par exemple, les protéines, les membranes et l’ADN), perturbant les fonctions cellulaires¹⁷. En synthétisant des nanoparticules de Cu à la surface de l’oxyde de graphène (GO), le taux de libération d’ions métalliques peut être contrôlé 18,19,20. GO montre également un effet antibactérien en empêchant l’adhésion bactérienne avec une surface rugueuse par stress oxydatif ou en formant des ROS^21,22. De plus, les nanocomposites GO/Cu libèrent plus de ROS que GO par l’action chimique du Cu²⁺, ce qui endommage les protéines bactériennes et l’ADN, entraînant la mort des bactéries^23,24.

Cet article décrit le protocole de synthèse des nanocomposites GO/Cu et présente une approche de test antimicrobien contre les bactéries cliniques SARM et P. aeruginosa, les souches bactériennes multirésistantes les plus courantes qui causent des infections nosocomiales²⁵. Ce protocole vise à introduire une méthode de réduction chimique facile pour synthétiser les nanocomposites GO/Cu qui peuvent entraver la croissance des bactéries résistantes aux antibiotiques. Nous utilisons respectivement du chlorure de cuivre(II) (CuCl₂) et du borohydrure de sodium (NaBH₄) comme précurseur et agent réducteur. Le protocole décrit également les spécificités de l’application de ces nanocomposites aux bactéries à l’aide de la méthode du bouillon de microdilution. Afin d’exclure les erreurs dues à l’interférence d’absorption des nanoparticules métalliques et d’effectuer des évaluations précises, la capacité antibactérienne est évaluée à l’aide de la méthode de comptage des colonies.

Protocole

1. Préparation des nanocomposites GO/Cu

REMARQUE : La taille et la morphologie des nanoparticules de Cu qui se développent sur les nanofeuillets GO sont déterminées par le degré d’oxydation du GO, la concentration du précurseur du Cu et la concentration de l’agent réducteur²⁶.

1. Préparez 10 mL de suspension GO à 1 mg/mL dans une bouteille en verre. Soniquer la suspension de GO pendant 1 h jusqu’à ce que le GO soit bien dispersé dans de l’eau distillée (DI).
2. Préparez une solution de 20 mM de CuCl₂ dans un flacon en verre. Sonicer la solution de CuCl₂ jusqu’à ce que le CuCl₂ soit bien dispersé dans l’eau DI.
3. Ajouter 10 mL de la solution CuCl₂ de 20 mM à la solution GO et soniser le mélange à 70 °C pendant 1 h.
4. Préparez une solution de NaBH₄ de 20 mM.
   ATTENTION : Cette procédure doit être effectuée dans une hotte chimique. Une réaction d’oxydoréduction se produit dès que l’agent réducteur NaBH₄ est introduit dans l’eau. Préparez la solution de NaBH₄ immédiatement avant l’expérience.
5. Préparation du mélange de NaBH₄, GO et CuCl₂
   1. Ajouter 20 mL de la solution de NaBH₄ de 20 mM au mélange de GO et de CuCl₂ en agitant avec une barre magnétique à 200 tr/min. Après avoir ajouté la solution de NaBH₄ , remuez continuellement pendant 30 min.
      ATTENTION : Cette procédure doit être effectuée dans une hotte chimique.
6. Centrifugation du mélange
   1. Transférez le mélange de l’étape 1.5.1 dans un tube à centrifuger. Centrifuger la solution à 23 000 × g pendant 10 min à température ambiante. Jetez le surnageant.
      ATTENTION : Lors de l’utilisation de la centrifugeuse, maintenez toujours l’équilibre en plaçant des tubes de poids égal.
7. Remettez en suspension le mélange nanocomposite GO/Cu avec 10 mL d’eau DI et sonisez-les pour permettre au précipité de se disperser uniformément dans toute la solution.
8. Centrifuger la solution à 23 000 × g pendant 10 min à température ambiante ; Retirez ensuite le surnageant.
9. Répétez les étapes 1.7-1.8 une fois de plus pour éliminer les produits chimiques n’ayant pas réagi.
10. Ajoutez 1 mL d’eau distillée aux nanocomposites GO/Cu et sonicez le mélange pour disperser uniformément les sédiments tout au long de la phase liquide.
    REMARQUE : Rassemblez toutes les solutions nanocomposites GO/Cu dans un tube conique.
11. Lyophiliser la solution à −60 °C sous vide pendant une nuit jusqu’à ce que les nanocomposites GO/Cu soient complètement secs et obtenir de la poudre de nanocomposites GO/Cu.
12. Conservez la poudre de nanocomposite GO/Cu à -20 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.

2. Préparation des bactéries pour le test antibactérien

ATTENTION : Cette procédure doit être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique avec une lampe à alcool. Les déchets bactériens doivent être lavés à l’autoclave avant d’être éliminés. Lors de la manipulation de bactéries résistantes aux antibiotiques, des gants, des blouses et des masques doivent être portés, et les mains doivent être lavées avec du savon ou un désinfectant pour les mains après l’expérience. Désinfectez toujours soigneusement ; En cas de contamination dans la zone expérimentale, désinfectez-la immédiatement avec de l’éthanol à 70 %.

1. Préparation des milieux de culture bactérienne
   1. Mélangez 20 g de gélose tryptique de soja et 500 ml d’eau distillée dans une fiole. Stérilisez le mélange dans un autoclave à 121 °C pendant 15 min.
   2. Préparez la plaque de gélose en versant 15 ml de la solution de gélose dans une boîte de Pétri avant que la gélose ne durcisse. Conservez la plaque de gélose à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Cela doit être fait rapidement avant que la solution de gélose ne durcisse. Pour éviter toute contamination, stérilisez la plaque de gélose avec des UV pendant 15 min pendant le durcissement.
   3. Mélangez 15 g de bouillon de soja tryptique (BST) et 500 ml d’eau distillée dans une fiole. Stérilisez le mélange dans un autoclave à 121 °C pendant 15 min.
   4. Aliquote de 40 à 50 ml de la solution de bouillon dans un tube conique de 50 mL. Conservez le bouillon à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Pour éviter toute contamination, stérilisez le bouillon aliquote avec des UV pendant 15 min.
2. Culture bactérienne
   1. Inoculer la solution mère de MSRA ou de P. aeruginosa sur la plaque de gélose à l’aide d’une boucle. Incuber la plaque de gélose à 37 °C à l’aide d’un incubateur agitateur pendant 24 h.
   2. Inoculer une colonie de bactéries dans 10 mL de bouillon à l’aide d’une boucle. Incuber le bouillon à 37 °C à l’aide d’un incubateur à agitation à 200 tr/min pendant 24 h.
   3. Répétez les étapes 2.2.1-2.2.2 une fois de plus pour obtenir des bactéries ayant les mêmes caractéristiques.
   4. Après 24 h, diluez en série la solution bactérienne dix fois avec de l’eau distillée stérile. Inocutionnez 100 μL de la suspension bactérienne diluée sur la plaque de gélose et étalez-la à l’aide d’un épandeur. Incuber la plaque de gélose à 37 °C à l’aide d’un incubateur agitateur pendant 24 h.
      REMARQUE : Le niveau de dilution dépend des bactéries. Essayez de préparer moins de 100 colonies dans une plaque de gélose.
   5. Compter les colonies bactériennes après l’incubation de 24 heures pour déterminer l’unité formant colonies (UFC) à l’aide de l’équation (1).
      (1)
   6. Répétez les étapes 2.2.4 et 2.2.5 au moins 3 fois pour confirmer si l’UFC de la bactérie est relativement constante.

3. Test antibactérien utilisant la méthode du bouillon de microdilution

1. Jour 1) Inoculer une colonie de bactéries de la plaque de gélose dans 10 mL de bouillon à l’aide d’une boucle. Incuber le bouillon à 37 °C à l’aide d’un incubateur à agitation à 200 tr/min pendant 24 h.
2. Jour 2) Préparez le mélange nanocomposite GO/Cu dans au moins trois concentrations en utilisant la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS). Soniquer la suspension de nanocomposites GO/Cu jusqu’à ce que les nanocomposites GO/Cu soient bien dispersés dans le DPBS.
   REMARQUE : Dans le cadre de ce protocole, 500, 250, 125 et 62,5 μg/mL du mélange nanocomposite GO/Cu ont été testés.
3. Préparez les solutions de contrôle. Le témoin négatif est le DPBS, et le témoin positif est 1 % d’une solution de pénicilline/streptomycine dans le DPBS qui tuera les bactéries.
4. Ajoutez 100 μL de suspension nanocomposite GO/Cu et les solutions de contrôle dans des plaques à 96 puits. Ajouter tous les échantillons en trois exemplaires.
   REMARQUE : Stérilisez les échantillons avec des UV pendant 15 min avant de les appliquer sur les bactéries.
5. Sur la base de l’UFC après 24 h d’incubation, diluer la suspension bactérienne à l’aide de TSB à 1 × 10⁶ UFC/mL.
   REMARQUE : Les concentrations initiales de SARM et de P. aeruginosa en suspension de culture dans notre étude, selon l’étape 2.2.5, sont de 4,5 ×^{10 9} UFC/mL et de 3 ×^{10 9} UFC/mL, respectivement. Des concentrations bactériennes de 1 × 10 à⁶ UFC/mL sont obtenues en diluant les cultures 4 500 fois et 3 000 fois, respectivement.
6. Inoculer 100 μL de la suspension bactérienne diluée de 1 × 10⁶ UFC/mL dans les puits d’échantillonnage des plaques à 96 puits. Incuber les plaques à 96 puits à 37 °C à l’aide d’un incubateur à agitation à 200 tr/min pendant 24 h.
   REMARQUE : La concentration finale de bactéries est de 5 × 10⁵ UFC/mL après mélange avec 100 μL d’échantillon.
7. Jour 3) Mélangez vigoureusement l’échantillon et les suspensions bactériennes à l’aide d’une pointe de micropipette de 200 μL. Diluez en série le mélange échantillon-bactéries dix fois avec de l’eau distillée stérile.
   REMARQUE : Le niveau de dilution dépend des bactéries. Essayez de préparer moins de 100 colonies dans une plaque de gélose.
8. Inocutionnez 100 μL de la suspension bactérienne diluée sur la plaque de gélose et étalez-la à l’aide d’un épandeur. Incuber la plaque de gélose à 37 °C à l’aide d’un incubateur agitateur pendant 24 h.
9. Jour 4) Compter les colonies bactériennes et déterminer les valeurs UFC pour confirmer l’activité antibactérienne des nanocomposites GO/Cu à l’aide de l’équation (2).
   (2)

Résultats

Des analyses de microscopie électronique à transmission (MET), de microscopie électronique à balayage (MEB) et de spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDS) ont été effectuées pour confirmer la formation de nanocomposites GO/Cu. Les figures 1A, B montrent que des nanoparticules de Cu hétérogènes ont été cultivées sur les feuillets GO. Comme le montre la figure 1C, la cartographie EDS...

Discussion

Dans cet article, nous rapportons une méthode simple et peu coûteuse pour préparer des nanofeuilles de GO déposées avec des nanoparticules de Cu, qui serait une méthode potentiellement efficace pour éradiquer les bactéries résistantes aux antibiotiques. L’étape critique de la synthèse des nanocomposites GO/Cu consiste à disperser soigneusement le GO et le CuCl₂ dans la solution et à maintenir une température élevée tout en les mélangeant. De plus, l’étape...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Clinical MDR bacterial strains	Chung-Ang University Hospital (Seoul, South Korea)
Copper(II) chloride dihydrate	Duksan	10125-13-0
Field Emission Scanning Electron Microscope (FE-SEM)	Carl Zeiss	SIGMA
Graphene oxide	Sigma	796034
Sodium Borohydride	Sigma	71320
Transmission Electron Microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100
Tryptic Soy Agar	BD difco	236950
Tryptic Soy Broth	BD difco	211825