Fabricação de Nanocompósitos Antibacterianos de Óxido de Grafeno/Cobre

Resumo

Aqui, introduzimos nanocompósitos de óxido de grafeno / cobre (GO /) como um nanomaterial antibacteriano. A eficácia antibacteriana dos nanocompósitos GO/foi avaliada contra bactérias gram-positivas e gram-negativas resistentes a antibióticos.

Resumo

Os antibióticos são atualmente o tratamento antibacteriano mais utilizado para matar bactérias. No entanto, as bactérias desenvolvem resistência quando continuamente superexpostas a antibióticos. O desenvolvimento de agentes antimicrobianos que possam substituir os antibióticos existentes é essencial porque as bactérias resistentes a antibióticos têm mecanismos de resistência a todos os antibióticos atuais e podem promover infecções nosocomiais. Para enfrentar esse desafio, neste estudo, propomos nanocompósitos de óxido de grafeno/cobre (GO/) como materiais antibacterianos que podem substituir os antibióticos existentes. Os nanocompósitos GO/são caracterizados por microscopia eletrônica de transmissão e microscopia eletrônica de varredura. Eles mostram que as nanopartículas de cobre () são bem cultivadas nas folhas de óxido de grafeno. Além disso, um método de caldo de microdiluição é usado para confirmar a eficácia da substância antimicrobiana contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) e Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), que são frequentemente implicados em infecções nosocomiais. Especificamente, 99,8% do MRSA e 84,7% do P. aeruginosa são eliminados por 500 μg/mL de nanocompósitos GO/. Os nanocompósitos metálicos podem erradicar bactérias resistentes a antibióticos liberando íons, formando espécies reativas de oxigênio e danificando fisicamente as bactérias. Este estudo demonstra o potencial dos nanocompósitos antibacterianos GO/na erradicação de bactérias resistentes a antibióticos.

Introdução

As infecções bacterianas têm um impacto significativo na saúde pública. As bactérias patogênicas, em particular, podem escapar dos mecanismos de proteção do corpo e causar doenças¹. Os antibióticos são amplamente utilizados para tratar infecções bacterianas. No entanto, o uso inadequado de antibióticos precipitou o surgimento de bactérias resistentes a antibióticos. Atualmente, infecções hospitalares atribuíveis a bactérias resistentes a antibióticos têm causado complicações notáveis em estabelecimentos de saúde². Infelizmente, as bactérias têm mecanismos de resistência para todos os antibióticos atuais³. Portanto, o desenvolvimento de novos antibióticos é essencial, embora também haja uma alta probabilidade de que surjam mecanismos de resistência.

As nanopartículas metálicas surgiram como agentes promissores para combater bactérias resistentes a antibióticos devido às suas propriedades antibacterianas eficazes ^4,5,6. É difícil para as bactérias desenvolverem mecanismos de resistência contra nanopartículas metálicas porque elas não se ligam a nenhum receptor bacteriano específico⁷. Em particular, as nanopartículas de óxido de prata, cobre e zinco são o foco de extensas pesquisas devido à sua notável eficácia antibacteriana 8,9,10,11,12,13. A toxicidade das nanopartículas metálicas para as bactérias é atribuída a três mecanismos primários: 1) a liberação de íons metálicos, 2) a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), como •OH e •O₂⁻, e 3) interação física e fixação ^4,14.

Neste estudo, nanocompósitos de óxido de grafeno/cobre (GO/) foram desenvolvidos como um agente antimicrobiano. O cobre () mata eficientemente os patógenos que encontram sua superfície e interfere na replicação do gene bacteriano. No entanto, é um microelemento essencial no corpo humano e é menos tóxico para as células de mamíferos, pois possui mecanismos homeostáticos que regulam as concentrações de no interior das células⁴. Quando as nanopartículas de são oxidadas, elas geram íons, que têm uma afinidade relativamente alta por bactérias carregadas negativamente^15,16. Os íons se ligam às estruturas celulares (por exemplo, proteínas, membranas e DNA), interrompendo as funções celulares¹⁷. Ao sintetizar nanopartículas de na superfície do óxido de grafeno (GO), a taxa de liberação de íons metálicos pode ser controlada 18,19,20. O GO também apresenta efeito antibacteriano ao impedir a adesão bacteriana com uma superfície áspera por meio do estresse oxidativo ou pela formação de ROS^21,22. Além disso, os nanocompósitos GO/liberam mais ROS do que GO através da ação química do²⁺, que danifica as proteínas bacterianas e o DNA, levando à morte de bactérias^23,24.

Este artigo descreve o protocolo para sintetizar nanocompósitos GO/e apresenta uma abordagem de teste antimicrobiano contra bactérias clínicas MRSA e P. aeruginosa, as cepas de bactérias multirresistentes mais comuns que causam infecções nosocomiais²⁵. Este protocolo visa introduzir um método de redução química fácil para sintetizar nanocompósitos GO/que podem impedir o crescimento de bactérias resistentes a antibióticos. Usamos cloreto de cobre (II) (CuCl₂) e borohidreto de sódio (NaBH₄) como precursor e agente redutor, respectivamente. O protocolo também descreve as especificidades da aplicação desses nanocompósitos a bactérias usando o método de caldo de microdiluição. Para excluir erros devido à interferência de absorção de nanopartículas metálicas e fazer avaliações precisas, a capacidade antibacteriana é avaliada usando o método de contagem de colônias.

Protocolo

1. Preparação dos nanocompósitos GO/

NOTA: O tamanho e a morfologia das nanopartículas de que crescem nas nanofolhas de GO são determinados pelo grau de oxidação de GO, a concentração do precursor de e a concentração do agente redutor²⁶.

1. Prepare 10 mL de suspensão de GO de 1 mg / mL em um frasco de vidro. Sonicar a suspensão de GO durante 1 h até que o GO esteja bem disperso em água destilada (DI).
2. Prepare uma solução de CuCl₂₀ mM 2 num frasco para injetáveis de vidro. Sonicar a solução de CuCl₂ até que o CuCl₂ esteja bem disperso em água DI.
3. Adicionar 10 ml da solução de CuCl₂ 20 mM à solução de GO e sonicar a mistura a 70 °C durante 1 h.
4. Prepare uma solução de NaBH₂₀ mM 4.
   CUIDADO: Este procedimento deve ser realizado em uma capela de exaustão química. Uma reação redox ocorre assim que o agente redutor NaBH₄ é introduzido na água. Preparar a solução de NaBH₄ imediatamente antes da experiência.
5. Preparando a mistura de NaBH₄, GO e CuCl₂
   1. Adicione 20 mL da solução 20 mM de NaBH₄ à mistura de GO e CuCl₂ , mexendo com uma barra magnética a 200 rpm. Após adicionar a solução de NaBH₄ , mexa continuamente por 30 min.
      CUIDADO: Este procedimento deve ser realizado em uma capela de exaustão química.
6. Centrifugação da mistura
   1. Transferir a mistura do passo 1.5.1 para um tubo de centrifugação. Centrifugue a solução a 23.000 × g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
      CUIDADO: Ao operar a centrífuga, sempre mantenha o equilíbrio colocando tubos de igual peso.
7. Ressuspenda a mistura de nanocompósitos GO/com 10 mL de água DI e sonice-os para permitir que o precipitado se disperse uniformemente por toda a solução.
8. Centrifugue a solução a 23.000 × g por 10 min em temperatura ambiente; Em seguida, remova o sobrenadante.
9. Repita as etapas 1.7-1.8 mais uma vez para remover os produtos químicos que não reagiram.
10. Adicione 1 mL de água destilada aos nanocompósitos GO/e sonice a mistura para dispersar o sedimento uniformemente por toda a fase líquida.
    NOTA: Colete todas as soluções de nanocompósitos GO/em um tubo cônico.
11. Liofilizar a solução a -60 °C sob vácuo durante a noite até que os nanocompósitos GO/estejam completamente secos e obtenham o pó nanocompósito GO/.
12. Armazene o pó nanocompósito GO/a -20 °C até o uso.

2. Preparação de bactérias para o teste antibacteriano

CUIDADO: Este procedimento deve ser realizado em uma cabine de segurança biológica com uma lâmpada de álcool. Os resíduos bacterianos devem ser autoclavados antes do descarte. Ao manusear bactérias resistentes a antibióticos, luvas, aventais e máscaras devem ser usados, e as mãos devem ser lavadas com sabão ou desinfetante para as mãos após o experimento. Sempre desinfete completamente; Se ocorrer contaminação na área experimental, desinfete-a imediatamente com etanol 70%.

1. Preparação de meios de cultura bacterianos
   1. Misture 20 g de ágar tríptico de soja e 500 mL de água destilada em um frasco. Esterilize a mistura em autoclave a 121 °C por 15 min.
   2. Prepare a placa de ágar despejando 15 mL da solução de ágar em uma placa de Petri antes que o ágar endureça. Conservar a placa de ágar-ágar a 4 °C até à utilização.
      NOTA: Isso deve ser feito rapidamente antes que a solução de ágar endureça. Para evitar contaminação, esterilize a placa de ágar com UV por 15 min durante o endurecimento.
   3. Misture 15 g de caldo tríptico de soja (TSB) e 500 mL de água destilada em um frasco. Esterilize a mistura em autoclave a 121 °C por 15 min.
   4. Alíquota 40-50 mL da solução de caldo em um tubo cônico de 50 mL. Conservar o caldo a 4 °C até à utilização.
      NOTA: Para evitar contaminação, esterilize o caldo aliquotado com UV por 15 min.
2. Cultura bacteriana
   1. Inocular a solução-mãe MSRA ou P. aeruginosa na placa de ágar usando uma alça. Incubar a placa de ágar-ágar a 37 °C com uma incubadora agitada durante 24 h.
   2. Inocule uma colônia da bactéria em 10 mL do caldo usando um laço. Incubar o caldo a 37 °C com uma incubadora agitada a 200 rpm durante 24 h.
   3. Repita as etapas 2.2.1-2.2.2 mais uma vez para obter bactérias com as mesmas características.
   4. Após 24 h, diluir em série a solução bacteriana dez vezes com água destilada estéril. Inocular 100 μl da suspensão bacteriana diluída na placa de ágar e espalhar com um espalhador. Incubar a placa de ágar-ágar a 37 °C com uma incubadora agitada durante 24 h.
      NOTA: O nível de diluição depende das bactérias. Procure preparar menos de 100 colônias em uma placa de ágar.
   5. Contar as colónias bacterianas após 24 h de incubação para determinar a unidade formadora de colónias (UFC) utilizando a equação (1).
      Características (1)
   6. Repita as etapas 2.2.4-2.2.5 pelo menos 3x para confirmar se a UFC da bactéria é relativamente constante.

3. Teste antibacteriano usando o método de caldo de microdiluição

1. Dia 1) Inocule uma colônia da bactéria da placa de ágar em 10 mL do caldo usando um laço. Incubar o caldo a 37 °C com uma incubadora agitada a 200 rpm durante 24 h.
2. Dia 2) Prepare a mistura de nanocompósitos GO / em pelo menos três concentrações usando solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco. Sonicar a suspensão de nanocompósitos GO/até que os nanocompósitos GO/estejam bem dispersos em DPBS.
   NOTA: Neste protocolo, foram testados 500, 250, 125 e 62,5 μg/mL da mistura nanocompósita GO/.
3. Prepare as soluções de controle. O controle negativo é a SPBD, e o controle positivo é 1% de uma solução de penicilina/estreptomicina na SPBD que matará a bactéria.
4. Adicione 100 μL da suspensão de nanocompósitos GO/e as soluções de controle em placas de 96 poços. Adicione todas as amostras em triplicado.
   NOTA: Esterilize as amostras com UV por 15 minutos antes de aplicá-las às bactérias.
5. Com base na UFC após 24 h de incubação, diluir a suspensão bacteriana usando TSB a 1 × 10⁶ UFC/mL.
   NOTA: As concentrações iniciais de MRSA e suspensão de cultura de P. aeruginosa em nosso estudo, de acordo com a etapa 2.2.5, são de 4,5 × 10⁹ UFC/mL e 3 × 10⁹ UFC/mL, respectivamente. Concentrações bacterianas de 1 × 10⁶ UFC/mL são obtidas diluindo as culturas em 4.500x e 3.000x, respectivamente.
6. Inocular 100 μL da suspensão bacteriana diluída de 1 ×^{10 6} UFC/ml nos alvéolos de amostra nas placas de 96 poços. Incubar as placas de 96 poços a 37 °C usando uma incubadora agitada a 200 rpm por 24 h.
   NOTA: A concentração final de bactérias é de 5 × 10⁵ UFC/mL após mistura com 100 μL de amostra.
7. Dia 3) Misture vigorosamente a amostra e as suspensões bacterianas com uma ponta de micropipeta de 200 μL. Diluir em série a mistura amostra-bactéria dez vezes com água destilada estéril.
   NOTA: O nível de diluição depende das bactérias. Procure preparar menos de 100 colônias em uma placa de ágar.
8. Inocular 100 μl da suspensão bacteriana diluída na placa de ágar e espalhar com um espalhador. Incubar a placa de ágar-ágar a 37 °C com uma incubadora agitada durante 24 h.
9. Dia 4) Conte as colônias bacterianas e determine os valores de UFC para confirmar a atividade antibacteriana dos nanocompósitos GO/usando a equação (2).
   (2)

Resultados

Análises de microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de raios X por dispersão de energia (EDS) foram realizadas para confirmar a formação de nanocompósitos GO/. A Figura 1A, B mostra que nanopartículas heterogêneas de foram cultivadas nas folhas de GO. Conforme mostrado na Figura 1C, o mapeamento EDS confirmou que as partículas na folha GO...

Discussão

Aqui, relatamos um método simples e de baixo custo para preparar nanofolhas de GO depositadas com nanopartículas de, que seria um método potencialmente eficiente para erradicar bactérias resistentes a antibióticos. A etapa crítica na síntese de nanocompósitos GO/é dispersar completamente GO e CuCl₂ na solução e manter uma temperatura elevada enquanto os mistura. Além disso, a etapa redox deve ser conduzida rapidamente porque o agente redutor causa uma reação de r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
Clinical MDR bacterial strains	Chung-Ang University Hospital (Seoul, South Korea)
Copper(II) chloride dihydrate	Duksan	10125-13-0
Field Emission Scanning Electron Microscope (FE-SEM)	Carl Zeiss	SIGMA
Graphene oxide	Sigma	796034
Sodium Borohydride	Sigma	71320
Transmission Electron Microscopy (TEM)	JEOL	JEM-2100
Tryptic Soy Agar	BD difco	236950
Tryptic Soy Broth	BD difco	211825