Les auteurs remercient Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, et le Stanford petit noyau d&#39;imagerie animale pour l&#39;assistance technique. Les auteurs remercient également AM Bickford, Inc pour le soutien des équipements vétérinaires. Cette recherche a été financée par des subventions de recherche du National Institutes of Health (R01 HL-75 774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), le tabac en Californie Programme connexes Disease Research de l&#39;Université de Californie (15IT-0257 et 1514RT-0169) , et le California Institute for Regenerative Medicine (RS1-00183). NH est soutenu par une bourse de l&#39;American Heart Association.

1. Induction de l&#39;ischémie des membres postérieurs unilatérale <ol><li> Les instruments chirurgicaux nécessaires pour cette opération comprennent: amende pince pointue, une pince pointue, des ciseaux à ressort, ciseaux chirurgicaux, porte-aiguilles, et enrouleur. Nous fabriquons nos propres écarteur à l&#39;aide d&#39;un trombone, car elle est plus petite que enrouleurs disponibles commercialement. Stériliser ces outils avant la chirurgie par un autoclave ou un stérilisateur à chaud perle. Un outil de cautérisation et stérile beaux cotons-tiges souligné seront également nécessaires pour cette opération. Il est recommandé que les outils être re-stérilisés à l&#39;extrémité que nécessaire durant la procédure. </li><li> Lorsque les outils sont prêts, placez la souris dans la chambre de l&#39;induction anesthésique contenant 1-3% d&#39;isoflurane dans 100% d&#39;oxygène à un débit d&#39;1l/min. </li><li> Laisser la souris dans la chambre de l&#39;induction jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit insensible aux stimuli extérieurs. Puis enlever l&#39;animal de la chambre de l&#39;induction. Il est recommandé de rincer l&#39;anesthésie de la boîte avant d&#39;ouvrir le couvercle, pour diminuer l&#39;exposition des opérateurs à l&#39;isoflurane. </li><li> Ensuite, placez l&#39;animal en décubitus dorsal sur la table de pré-exploitation et le connecter à un flux continu de l&#39;isoflurane. Utiliser un rasoir électrique, enlever les poils de la patte postérieure. Appliquez la crème d&#39;épilation pour bien enlever les poils. </li><li> Placez la souris dans la position couchée sur un coussin drapé chauffée sur la table d&#39;opération, et le connecter à un flux continu de l&#39;isoflurane. Etendre et sécuriser les membres postérieurs avec un morceau de ruban adhésif. Une fois que le membre postérieur est sécurisé, essuyer la peau avec trois gommages bétadine et de l&#39;alcool en alternance. Pour le reste de la procédure chirurgicale, l&#39;utilisation d&#39;un microscope de dissection à un grossissement de 10x ou 20x pour obtenir une vue agrandie de la région des membres postérieurs. </li><li> En utilisant des pinces fines et les ciseaux chirurgicaux, faire une incision de la peau, d&#39;environ 1 cm de long, à partir du genou vers la cuisse médial. </li><li> En utilisant un tampon phosphate salin (PBS)-humidifié beaux cotons-tiges pointues, enlevez doucement la voie sous-cutanée des tissus adipeux entourant le muscle de la cuisse. </li><li> Ensuite, appliquer le cautère transversalement pour inciser et disséquer à travers les tissus sous-cutanés graisses pour révéler l&#39;artère fémorale sous-jacente. </li><li> Utiliser un écarteur d&#39;ouvrir la plaie et d&#39;obtenir une meilleure vue de la vascularisation des membres inférieurs. </li><li> En utilisant une pince fine et un coton-tige à pointe fine, délicatement percer la gaine membraneuse fémorale pour exposer le paquet vasculo-nerveux. </li><li> Puis, en utilisant un ensemble propre de pinces fines et d&#39;un coton-tige, disséquer et séparer l&#39;artère fémorale de la veine fémorale et du nerf à l&#39;endroit proximale près de l&#39;aine. Après la dissection, passer un brin de 7-0 suture de soie au-dessous de l&#39;extrémité proximale de l&#39;artère fémorale. Occlusion de l&#39;artère fémorale à l&#39;aide de doubles noeuds. Placez le lien sur le navire comme proximale dans la plaie que possible afin de laisser la longueur pour le deuxième lien et un segment intermédiaire qui sera sectionné. </li><li> Séparée de l&#39;artère fémorale de la veine fémorale à l&#39;endroit distale près du genou. Passez un brin de suture au-dessous de 7-0 de l&#39;extrémité distale de l&#39;artère fémorale proximale de l&#39;artère poplitée. Occlure le vaisseau à l&#39;aide de doubles noeuds. </li><li> Occlusion de l&#39;artère fémorale avec une deuxième série de doubles noeuds juste en amont de la première série de noeuds. Cette deuxième série de points de suture seront utilisés pour la préhension de l&#39;artère pendant la procédure de transaction. </li><li> De même, à des fins de préhension, une occlusion de l&#39;artère fémorale avec une deuxième série de doubles noeuds juste en aval de la première série de noeuds. </li><li> Transect le segment de l&#39;artère fémorale entre les noeuds distale et proximale avec un coton tige fine et a une paire de ciseaux à ressort. Soyez prudent de ne pas percer la paroi de la veine fémorale. </li><li> Retirer l&#39;écarteur et fermer l&#39;incision à l&#39;aide des sutures Vicryl 5-0. Ces sutures n&#39;ont pas besoin d&#39;être retiré à un moment plus tard, comme ils se dissolvent. </li><li> Une fois l&#39;incision est fermée, placer l&#39;animal sur le dessus d&#39;un coussin chauffant drapé dans la cage de récupération et de surveiller en continu jusqu&#39;à éveillé. </li><li> Après animal a récupéré pendant 1 heure, passez à l&#39;étape laser Doppler perfusion sanguine afin de confirmer l&#39;induction d&#39;ischémie. </li></ol> 2. Perfusion Laser Doppler sanguin <ol><li> Pour commencer l&#39;étape par laser Doppler perfusion, placez la souris dans la chambre de l&#39;induction anesthésique contenant 1-3% d&#39;isoflurane dans 100% d&#39;oxygène à un débit d&#39;1l/min. </li><li> Laisser la souris dans la chambre de l&#39;induction jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit insensible aux stimuli extérieurs. Puis enlever l&#39;animal de la chambre de l&#39;induction. Il est recommandé de rincer l&#39;anesthésie de la boîte avant d&#39;ouvrir le couvercle, pour diminuer l&#39;exposition des opérateurs à l&#39;isoflurane. </li><li> Placez l&#39;animal sur la table de pré-exploitation liés à l&#39;écoulement continu de l&#39;isoflurane. Puis enlever les poils de la patte arrière en utilisant un rasoir électrique suivi par la crème d&#39;épilation, si nécessaire. </li><li> Après avoir enlevé les cheveux,placer l&#39;animal sur une surface de 37 ° C chauffée pendant 5 minutes sous flux continu de l&#39;isoflurane. Surveiller la température du noyau afin d&#39;assurer euthermia, comme les changements de température sera nettement affecter la perfusion. </li><li> Après 5 minutes, placer l&#39;animal dans la position couchée sur un non-réfléchissant absorbant la lumière de surface comme un chiffon de couleur verte, reliées à un flux continu de l&#39;isoflurane. Étendre les membres postérieurs. </li><li> Ensuite, tournez sur l&#39;imageur laser à effet Doppler et le logiciel d&#39;acquisition et d&#39;initialiser le logiciel. Indiquez la taille du champ de vue et la résolution. Il est préférable de garder le champ de vision et de la densité de pixels cohérents entre les animaux afin de faire une analyse ultérieure plus facile. </li><li> Ouvrez un nouveau fichier. Appuyez sur start pour commencer à acquérir les données d&#39;image. Généralement, l&#39;imageur détecte automatiquement la distance de la souris, mais si vous êtes invité, spécifiez la distance de l&#39;animal à l&#39;imageur. Le laser va montrer les frontières du champ de vue et ensuite commencer à acquérir des données. </li><li> Après l&#39;acquisition est terminée, l&#39;image va commencer à montrer une gamme de couleurs qui sont une indication du niveau de la perfusion sanguine dans les jambes. Les couleurs peuvent être réglés à une gamme de perfusion spécifiques afin de mieux comparer les données entre les animaux. </li><li> Lorsque l&#39;acquisition de données est terminée, enregistrez le fichier. </li><li> Puis retour à l&#39;animal de la cage de récupération et de surveiller l&#39;animal continue jusqu&#39;à éveillé. </li><li> Pour analyser les données, utilisez le réglage de seuil dans le logiciel d&#39;analyse de soustraire le bruit de fond. Un seuil de 0,2 est généralement une valeur raisonnable. Sélectionnez deux régions d&#39;intérêt, ou ROI, qui couvrent chaque zone membre postérieur. Une variété de points de repère peuvent être utilisés pour normaliser le ROI entre les membres et les animaux. Puis déterminer la perfusion moyenne et la variabilité dans le retour sur investissement. La différence de perfusion et le ratio entre la perfusion ischémique des membres et des membres de commande peut alors être facilement déterminée. </li><li> Cette procédure peut être répétée pour suivre l&#39;évolution de la perfusion des membres postérieurs au fil du temps. A un point de temps désiré, l&#39;animal peut être euthanasiés pour l&#39;évaluation de la fonction des tissus et la comparaison aux données de l&#39;image de perfusion. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: L&#39;anatomie de la vascularisation des membres postérieurs est montré dans la figure 1 2. Un diagramme représentant du membre postérieur après explantation artère fémorale est montré dans la figure 2. Pour confirmer l&#39;induction d&#39;une ischémie de la patte postérieure, le laser Doppler d&#39;analyse d&#39;images de perfusion démontre une réduction spectaculaire de la circulation sanguine dans le membre ischémique, par rapport à la branche de contrôle, comme le montre la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_26_9/figure1_1035.png" alt="Figure 1" width="600" height="406" /> Figure 1. Anatomie de la vascularisation des membres postérieurs. Les astérisques indiquent les endroits de la ligature de l&#39;induction d&#39;une ischémie des membres postérieurs. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_7/Niiyama_HLI_Fig2.png" alt="Image 2" width="600" height="450" /> Figure 2. Schéma représentant montrant l&#39;anatomie du membre postérieur après la ligature de l&#39;artère fémorale au niveau des sites proximales et distales après le retrait de l&#39;artère fémorale. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_8/Niiyama_HLI_Fig3.png" alt="Figure 3" width="600" height="256" /> Figure 3. Laser Doppler montrant des images du flux sanguin avant et après l&#39;induction d&#39;une ischémie de la patte postérieure gauche (indiqué par la flèche).

<ol>
	<li>Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+non-invasive+tracking+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+treatment+of+hindlimb+ischemia.">Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The anatomy of the laboratory mouse. , (1976).</li><li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization.">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li><li>Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li></ol>

Il ya quelques sources de variabilité à considérer lors de la planification et l&#39;exécution des modèles d&#39;ischémie des membres postérieurs. Premièrement, le niveau de l&#39;ischémie peuvent varier selon l&#39;emplacement de la ligature par rapport à celle des branches latérales. Par conséquent, pour la cohérence du modèle, les animaux doivent subir le même niveau de la ligature des artères. Une autre source de variabilité dans la récupération ischémique est lié à l&#39;âge des animaux, avec des animaux jeunes (6-8 semaines) ayant les taux de récupération plus rapide et plus complète que celle des animaux plus âgés (8-10 mois), tel qu&#39;évalué par hémodynamique (ie laser Doppler perfusion) ou fonctionnelle (test sur tapis roulant par exemple) des mesures. Pour les études dans lesquelles on est d&#39;évaluer un agent angiogénique, il peut être préférable d&#39;utiliser des animaux plus âgés, car une plus grande différence entre les groupes peut être observé avec une intervention thérapeutique. Inversement, pour des études dans lesquelles on est d&#39;évaluer un facteur anti-angiogénique, il peut être préférable d&#39;utiliser des animaux plus jeunes afin de maximiser la taille 3 effet. Si exécuté correctement, il devrait y avoir un minimum de complications comme le saignement, une infection ou de mortalité. En cas de saignement par la rupture accidentelle de la veine fémorale ou autres navires, une pression modérée avec un coton-tige stérile, ou de la gaze doit être appliquée sur le site de l&#39;hémorragie jusqu&#39;à ce que le saignement cesse. Les animaux présentant des signes d&#39;infection doit être traitée avec des anti-infectieux. Animaux présentant une gangrène significative peut être nécessaire de beeuthanized. Cette complication est plus fréquente chez les animaux plus âgés, et dans certaines souches, comme BALB c souris 4. En outre, le modèle d&#39;ischémie des membres postérieurs peuvent provoquer des douleurs légères à modérées. Par conséquent, les analgésiques tels que la buprénorphine ou carprofène doit être administré au besoin pour le traitement de la douleur, conformément aux recommandations de l&#39;IACUC. En conclusion, nous avons démontré une méthode simple et reproductible pour étudier PAD dans un modèle murin d&#39;ischémie des membres postérieurs. Le modèle d&#39;ischémie des membres postérieurs avec le laser Doppler analyse est un excellent système pour étudier les pathologies vasculaires et d&#39;évaluation des candidats thérapeutiques.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Constix Cotton Swabs</td>
<td>Tool</td>
<td>Contec</td>
<td>SC-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Betadine (Povidone-iodine)</td>
<td>Reagent</td>
<td>PDI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Kendall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>7-0 silk suture</td>
<td>Tool</td>
<td>Genzyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-0 vicryl suture</td>
<td>Tool</td>
<td>Ethicon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electric shaver</td>
<td>Tool</td>
<td>GE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cautery</td>
<td>Tool</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System</td>
<td>Equipment</td>
<td>Perimed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

murine model of hindlimb ischemia 

Aux États-Unis, la maladie artérielle périphérique (MAP) affecte environ 10 millions d&#39;individus, et est aussi dans le monde entier répandue. Les thérapies médicales pour le soulagement symptomatique sont limitées. Les interventions chirurgicales ou endovasculaires sont utiles pour certaines personnes, mais à long terme les résultats sont souvent décevants. En conséquence, il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies pour traiter la MAP. La préparation des membres postérieurs murin d&#39;ischémie est un modèle de la PAD, et est utile pour tester de nouvelles thérapies. Lorsqu&#39;on les compare à d&#39;autres modèles d&#39;ischémie tissulaire comme la ligature des artères coronaires ou cérébrales, la ligature artère fémorale prévoit un modèle plus simple des tissus ischémiques. D&#39;autres avantages de ce modèle sont la facilité d&#39;accès à l&#39;artère fémorale et faible taux de mortalité. Dans cette vidéo, nous démontrons la méthodologie utilisée pour le modèle murin d&#39;ischémie hindimb unilatérale. Les matériaux et les procédures spécifiques pour la création et l&#39;évaluation du modèle seront décrites, y compris l&#39;évaluation de la perfusion de membre par laser Doppler. Ce protocole peut également être utilisé pour la transplantation et le suivi non invasif des cellules, ce qui est démontré par Huang et al. 1.

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Murine Model of Hindlimb Ischemia

La procédure chirurgicale pour l&#39;induction d&#39;une ischémie unilatérale des membres postérieurs est démontré, avec confirmation d&#39;ischémie par imagerie laser Doppler perfusion.

Modèle murin d&#39;ischémie des membres postérieurs

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

57.1K vues.  Stanford University. La procédure chirurgicale pour l'induction d'une ischémie unilatérale des membres postérieurs est démontré, avec confirmation d'ischémie par imagerie laser Doppler perfusion.

Vidéo: Murine Model of Hindlimb Ischemia

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe and permanent neuropsychological sequelae, including mental retardation, cerebral palsy, and epilepsy. The outcomes of HIE are devastating and permanent, making it critical to identify and develop therapeutic strategies to reduce brain injury in newborns with HIE. To that end, the neonatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury has been developed to model this human condition. The HIE model was first validated by Vannucci et al 1 and has since been extensively used to identify mechanisms of brain injury resulting from perinatal hypoxia-ischemia 2 and to test potential therapeutic interventions 3,4. The HIE model is a two step process and involves the ligation of the left common carotid artery followed by exposure to a hypoxic environment. Cerebral blood flow (CBF) in the hemisphere ipsilateral to the ligated carotid artery does not decrease because of the collateral blood flow via the circle of Willis; however with lower oxygen tension, the CBF in the ipsilateral hemisphere decreases significantly and results in unilateral ischemic injury. The use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to stain and identify ischemic brain tissue was originally developed for adult models of rodent cerebral ischemia 5, and is used to evaluate the extent of cerebral infarctin at early time points up to 72 hours after the ischemic event 6. In this video, we demonstrate the hypoxic-ischemic injury model in postnatal rat brain and the evaluation of the infarct size using TTC staining.

The postnatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury is a well-established model of human neonatal hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). In this article, we describe the model of HIE in post-natal rat pups.

Le modèle encéphalopathie hypoxique ischémique de l&#39;ischémie périnatale

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe ...

Recherche

Biologie

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Les cellules souches embryonnaires des cellules dérivées endothéliales pour traitement de l&#39;ischémie des membres postérieurs

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

DAL-Ligature: un modèle murin d&#39;infarctus du myocarde

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying disuse-atrophy in rodents 4-6. Our study evaluated an alternant method to the gold-standard Morey-Holton HU tail-traction technique in mice. Fifty-four female mice (4-8 mo.) were HU for 14 days (n=34) or 28 days (n=20). Recovery from HU was assessed after 3 days of normal cage ambulation following HU (n=22). Aged matched mice (n=76) served as weight-bearing controls.
Prior to HU a tail ring was formed with a 2-0 sterile surgical steel wire that was passed through the 5th, 6th, or 7th inter-vertebral disc space and shaped into a ring from which the mice were suspended. Vertebral location for the tail-ring was selected to appropriately balance animal body weight without interfering with defecation.
We determined the success of this novel HU technique by assessing body weight before and after HU, degree of soleus atrophy, and adrenal mass following HU. Body weight of the mice prior to HU (24.3 &plusmn; 2.9g) did not significantly decline immediately after 14d of HU (22.7 &plusmn; 1.9g), 28d of HU (21.3 + 2.1g) or after 3 days recovery (24.0 &plusmn; 1.8g). Soleus muscle mass significantly declined (-39.1%, and -46.6%) following HU for 14 days and 28 days respectively (p&lt;0.001). Following 3 days of recovery soleus mass significantly increased to 74% of control values. Adrenal weights of HU mice were not different compared to control mice.
The success of our novel HU method is evidenced by the maintenance of animal body weight, comparable adrenal gland weights, and soleus atrophy following HU, corresponding to expected literature values 2, 7, 8. The primary advantages of this HU method include: 1) ease of tail examination during suspension; 2) decreased likelihood of cyanotic, inflamed, and/or necrotic tails frequently observed with tail-taping and HU; 3) no possibility of mice chewing the traction tape and coming out of the suspension apparatus; and 4) rapid recovery and normal cage activity immediately after HU.

We developed an alternant hindlimb unloading model in mice. The primary advantage of our hindlimb unloading tail-ring method over the conventional Morey-Holton tail-traction technique is a simple straightforward procedure that minimizes stress upon the animal.

Une méthode alternant le modèle traditionnel de la NASA hindlimb déchargement chez la souris

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

Le murin déficients en Choline, additionné d’éthionine (CDE) alimentation modèle d’atteinte hépatique chronique

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

A Murine Model of Vertical Sleeve Gastrectomy

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. Bariatric surgery is currently the most effective long-term treatment for obesity. In addition to weight loss, bariatric surgery produces additional health benefits such as remission of type 2 diabetes, remission of hypertension, and decreased risk of developing certain types of cancer. The mechanisms beyond weight loss for these benefits remain incompletely defined. Therefore, animal models of bariatric surgery are being developed and validated to identify the mechanisms leading to these benefits, with the goal of improving understanding of gastrointestinal physiology and identifying new therapeutic targets. VSG has become the most commonly performed bariatric procedure in the clinic in the United States because it is highly effective at producing weight loss and metabolic improvement, and is simpler to perform than other bariatric procedures. Therefore, we have developed and validated a murine model of VSG. This murine VSG model recapitulates many of the effects of VSG seen in humans, including improved glucose and blood pressure regulation. The method is based on isolation of the stomach, ligation of gastric vessels, and removal of 70% of the stomach by transecting along the greater curvature of the stomach. We have successfully applied this surgical protocol to various genetically modified mouse lines to define the mechanistic contributors to the benefits of VSG. Furthermore, this murine VSG model has been combined with other surgical techniques, to achieve deeper mechanistic insight. Therefore, this is a simple and versatile model for studying gastrointestinal physiology and the health benefits of bariatric surgery.

The following describes the performance of vertical sleeve gastrectomy in mice. This is a type of weight-loss surgery that involves removal of approximately 70% of the stomach.

Un modèle murin de gastrectomie verticale

Bariatric surgery, such as vertical sleeve gastrectomy (VSG), is a surgery of the gastrointestinal tract that is performed for the purpose of weight loss. ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de cenp-A marqué par EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Un modèle murine d’une blessure de brûlure reconstruite avec une greffe de peau allogénique

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most animal laboratories.&#160;Contrary to the conventional approach for double ligation of the femoral artery (DLFA), a smaller incision on the right inguinal region was made to expose the proximal femoral artery (FA) to perform DLFA. Then, using a 7-0 suture, the incision was dragged to the knee region to expose the distal FA. Magnetic resonance imaging (MRI) on bilateral hind limbs was used to detect FA occlusion after the surgery. At 0, 1, 3, 5, and 7 days after the surgery, functional recovery of the hind limbs was visually assessed and graded using the Tarlov scale. Histologic evaluation was performed after euthanizing the animals 7 days after DLFA. The procedures were successfully performed on the right leg in ten ApoE-/- mice, and no mice died during subsequent observation. The incision sizes in all 10 mice were less than 5 mm (4.2 &#177; 0.63 mm). MRI results showed that FA blood flow in the ischemic side was clearly blocked. The Tarlov scale results demonstrated that hind limb function significantly decreased after the procedure and slowly recovered over the following 7 days. Histologic evaluation showed a significant inflammatory response on the ischemic side and reduced microvascular density in the ischemic hind limb. In conclusion, this study introduces a modified technique using a miniature incision to perform hind limb ischemia (HLI) using DLFA.

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

This article demonstrates an efficient surgical approach to establish acute ischemia in mice with a small incision. This approach can be applied by most research groups without any laboratory upgrades.

Un modèle chirurgical modifié de l’ischémie du membre postérieur chez des souris ApoE-/- utilisant une incision miniature

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...