L’objectif global de cette expérience, notre modèle d’ischémie postérieur est d’éclairer l’expérience une base pour une évaluation complète des effets fonctionnels, histologiques et moléculaires des agents angiogéniques putatifs. Ce protocole permet d’obtenir une norme pour l’essai de thérapies angiogéniques possibles dans un modèle de petit animal avec le potentiel d’applications futures dans le contexte clinique. Comme la revascularisation n’est pas appropriée dans vingt à trente pour cent des patients critiques ischémie angiogenèse thérapeutique a émergé comme une nouvelle stratégie pour améliorer la profusion de sang au site ischémique.
Ce protocole expérimental pourrait fournir une compréhension complète des mécanismes par lesquels les thérapies angiogéniques exercent leurs effets dans la mesure de leur efficacité à chacun de leurs résultats. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris noire de six femelles C57 de 22 semaines, rasez les cheveux de l’arrière-plan droit et fixez l’animal dans la position dorsale à cubitus sur un coussin chauffant. Placez l’animal sous un microscope disséquant.
Et utilisez une lame de scalpel chirurgicale numéro onze pour faire une incision cutanée d’un centimètre sur la cuisse de l’arrière droit. Blunt disséquer la graisse sous-cutanée pour exposer le faisceau neurovasculaire. Et utilisez des forceps pointus, des ciseaux à ressort et un porte-aiguilles ophtalmique pour ouvrir la gaine iléofémorale membranaire pour exposer les vaisseaux iliaques et fœmoraux externes distals.
Après avoir disséqué et séparé l’artère et la veine du nerf, utilisez sept sutures de polypropylène nonabsorbable o pour ligate l’artère et la veine fœmorales distales et l’artère et la veine iliaques externes distales. L’identification de l’artère iliaque externe distale et la ligature et l’excision de l’artère et des veines iliaques et fémorales externes distales sont critiques pour le succès de la procédure. Utilisez les ciseaux à ressort pour transecter le segment de l’artère iliofemorale et les veines entre les nœuds distal et proximal.
Et fermez l’incision avec une suture absorbable. Ensuite, inter-péritonéally fournir une solution antisedative dans l’animal et retourner la souris dans sa cage d’origine avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Pour récolter les muscles gastrocnemius, retirez la peau des deux limites postérieures.
Et utilisez l’écouvillon de coton pour séparer la peau des muscles. Tenant le tendon d’Achille, utilisez les ciseaux à ressort pour séparer le muscle du tibia et du péroné jusqu’à l’articulation du genou. Et séparer les biceps femoris du muscle gastrocnemius.
Utilisez les ciseaux à ressort pour couper les insertions du muscle gastrocnemius au niveau des articulations du genou. Et utilisez 10% trigasanth pour positionner les muscles récoltés dans une orientation transversale sur un petit disque de liège. Ensuite, casser congeler les spécimens dans l’isopentane refroidi à l’azote liquide pour moins 80 degrés Celsius de stockage.
Pour la capture au laser de microdissection capillaire, après avoir obtenu 12 sections de micromètres des spécimens musculaires, fixer les tissus aux toboggans en 50 millilitres d’acétone pur refroidi pendant cinq minutes à moins vingt degrés Celsius. Après séchage à l’air et encercler chaque spécimen avec un stylo hydrophobe. Et réhydrater les échantillons avec deux chlorure de sodium molaire dans PBS à quatre degrés Celsius.
À la fin de la réhydratation, étiquetez les échantillons avec l’anticorps primaire approprié d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Suivi de deux lavages de trois minutes dans deux chlorures de sodium molaire frais en PBS par lavage. Après le deuxième lavage, étiquetez les sections avec un anticorps secondaire approprié pendant trente minutes à quatre degrés Celsius suivi de deux lavages dans le chlorure de sodium dans PBS comme démontré.
Ensuite, étiquetez les échantillons avec avidin conjugué complexe de peroxydase pendant trente minutes à quatre degrés Celsius. Suivi d’un lavage et de cinq minutes d’étiquetage avec substrat de peroxydée DAB. À la fin de l’incubation, déshydrater les tissus dans la glace séquentielle froide 90% éthanol et 100% emersions d’éthanol.
Ensuite, utilisez un système de microdissection ultérieure, équipé d’un laser à l’état solide de 355 nanomètres pour disséquer 10 000 capillaires par souris et catapulter les capillaires disséqués dans un bouchon adhésif à tube de microfuge. Comme illustré, une perte complète de perfusion de limite postérieur est observée immédiatement après l’induction d’ischémie d’arrière-point. L’évaluation quantitative du flux sanguin, exprimée en tant que rapport de l’ISC au membre de NISC, a démontré la perfusion significativement améliorée de sang de membre chez les souris exposées au stimulus pro-angiogenic aux jours 15 et 45 post-HLI.
La quantification des capillaires positifs CD31 dans les sections histologiques des sections de tissu musculaire gastrocnemius montre que la densité capillaire est plus grande dans le membre ischémique par rapport au membre non ischémique. Comme prévu. Mais cet effet est encore amplifié après traitement avec l’agent pro-angiogénique.
La densité collatérale du vaisseau augmente également constamment dans le membre ischémique et cette augmentation est significativement plus élevée après exposition avec le stimulus pro-angiogénique. L’analyse inverse de réaction en chaîne de polymésase de transcriptase de l’expression pro-angiogenic de gène dans les cellules endothéliales positives de CD31 démontre une variation claire dans l’expression de gène entre les souris exposées ou non à l’agent pro-angiogenic. Il est important d’utiliser une aiguille ophtalmique plus ancienne pour ouvrir la gaine iliofemorale membranaire pour éviter la déchirure de l’artère et de la veine pendant la dissection du vaisseau.
Le vaisseau réagit à l’ischémie postérieure dans les mesures de perfusion basées sur le doppler laser et la quantification histologique de la densité capillaire du vaisseau nous permet d’évaluer l’angiogenèse.
