Aplysia 뉴런의 culturing 관련된 실험실에서 작업이 목록에 NIH R01와 NIH에 의해 투자 R21MH077921 있습니다.

준비 (솔루션 구성을위한 프로토콜의 끝에있는 솔루션 섹션을 참조) <ol><li> 문화 요리를 준비합니다. 폴리 - L - 라이신 (나트륨 borate에서 만든)로 Mattek 유리 바닥 문화 요리 잘 코트 유리. 완전히 잘 유리를 커버하고&gt; 1 시간 (야간 왼쪽 수)에 남길만큼 추가합니다. 철저하게 폴리 - L - 라이신은 인공 바닷물에서 (ASW) 4-5 번 rinsing하여 제거합니다. 마지막 헹굼 제거한 후, 2 50% L15의 MLS (소금과 보충과 2mM의 최종 농도에서 L - 글루타민을 포함) / 50 % hemolymph를 추가합니다. 이 문화 매체 전에 도금 세포에 적어도 한 시간 동안 접시에 있어야합니다 수 있도록 hemolymph의 외투 요리. </li><li> 에탄올과 함께 도구와 Sylgard 요리를 청소, ddH 2 0과 철저히 그들을 씻어 후 문화 후드의 자외선 아래에서&gt; 1 시간 그들을 놓으십시오. </li><li> 뉴런의 microdissection에 대한 날카로운 전극을 준비합니다. microelectrode의 풀러 (예 : 브라운 P - 97을 플라밍 서터)는, 1.5 mm 외경, 0.86-1.12 mm 내경 및 100mm의 길이로 유리 피펫의 전극을 당겨 사용 (예 : 시스템 카탈로그 # 628000 AM, 세계 정밀 계측기 TW150 - 4, 1.55 / 1.12). 솔루션에 배치 액체에 대한 모세관 흡입이없는 그러한 높은 저항의 긴 위스피 좋은 팁과 전극을 생산 매개 변수를 사용합니다. 유체의 초승달 모양의 존재는 전극 팁은 고립 동안 신경 세포를 손상된다는 것을 의미합니다. 서터 전극 요리책은 전극 프로그램을 설정하기위한 훌륭한 지침을 제공합니다. 우리는 상자 필라멘트를 사용하고, 한 단계는 문화 전극을 생성 가져옵니다. </li><li> 마취 용액 (0.35M MgCl2), 문화 매체 (L15 소금과 hemolymph와 보충), 그리고 프로 테아제 솔루션 (10 단위 / ML의 최종 농도 1퍼센트 프로 테아제를 입력 IX, 시그마, 1 단위 / MG) 준비. </li><li> 동물 : 감각 뉴런의 고립과 LFS 모터 뉴런의 성인 80~100g Aplysia을 사용합니다. L7 모터 뉴런의 절연을위한 청소년 1-4그램 Aplysia을 사용합니다. 해수 탱크에서 부드럽게 동물을 제거하고, 마취 문화 절차를 시작하기 전에 더 이상 30 분 해수 (비커, 양동이 또는 비닐 봉투)에 유지합니다. </li></ol> 문화 절차 80~100g Aplysia에서 A.의 Culturing 가슴막안 감각 뉴런 <ol><li> 신경의 제거를위한 동물을 마취 : 18 게이지 1.5 인치 바늘로 60 ML의 주사기를 사용하여 성인 Aplysia (80-100g)에 0.35 M MgCl 2를 주사. 약 35 도의 각도로 동물의 발을 입력하고 너무 깊게 입력하지 마십시오. 목표는 내부 장기를 관통하지 않고 동물의 hemocoel에 주입하는 것입니다. 동물은 매우 커지는 편안한 될 것입니다. </li><li> 신경을 해부하다 : 머리와 꼬리에 핀 (18 게이지 바늘이 80-1백g 동물에 대한 잘 작동), 최대 직면하고있는 발, 해부 접시에 anesthetized 동물을 핀. 톱니 집게와 다리를 잡고 수술 가위로 피부와 기본 결합 조직 기슭의 전체 길이 (꼬리 머리부터)를 통해 했네요. 아래의 양면을 핀. 포셉 및 가위를 사용하여 식도를 잘라와 신경을 노출하는쪽으로 당기십시오. 좋은 포셉, 고급 가위를 사용하여 흉막 페달 신경을 (감각 뉴런은 흉막 신경에) 도려. 이 쉽게 단백 분해 효소 치료 후 신경을 핀 수 있습니다 이후 신경의 공정한 금액을 둡니다. </li><li> 신경의 테아제 소화 : 프로 테아제 플레이스 솔루션에 신경 (10 L15 1 단위 / MG의 MG / ML) 34.5에서 보육 세트 ° C (34-35 ° C 괜찮아요) 2 시간 및 15하십시오. 멋진 팁을 사용하면 세 번 전송 ASW에 신경을 씻어 포셉. L15에 신경 보관하십시오. 프로 테아제의 배양 시간이 다를 수 있습니다. 목적은 결합 조직을 쉽게 제거할 수 있도록하는 것입니다. 그것이 신경을 손상하지 않고 desheath 신경을 너무 어려운 경우, 프로 테아제의 배양 시간을 향상시킬 수 있습니다. 그것이 desheath 매우 쉬운 경우에는 신경 및 신경이 &quot;소프트&quot;프로 테아제의 배양 시간을 줄일 수 있습니다. </li><li> 신경을 Desheathing : 60 mm 또는 sylgard 및 L15을 포함 35mm 요리로 프로 테아제 - 소화 신경을 전송합니다. 스테레오 현미경 (외부 할로겐 조명과 함께) 아래보기, 제거 신경을 페달과 곤충 핀 및 벌금 집게를 사용하여 적절한 방향 Sylgard 접시에 흉막 신경을 핀. 좋은 포셉와 바나 외과 가위로 조심스럽게 결합 조직을 채취해서 그것이 감각 클러스터를 노출 그만 하죠. 절대 만지거나 somata의 연결을 손상하지 않도록주의하십시오. 접시에서 초과 결합 조직을 제거하고 공기에 desheathed 신경을 노출하지 않도록해야하고, 더 많은 매체를 추가하십시오. 감각 클러스터는 40-50 마이크론 직경의 약 200 클러스터된 뉴런으로 구성되어 있습니다. gangl에서 가까운 거리에서 &quot;게시&quot;를 만들기 위해 핀 설정이온 (보기의 필드 이내). </li><li> 뉴런의 절연 : 길고 날카로운 유리 문화 전극을 사용하면, 멀리에서 축삭과 함께 확인 뉴런 단지 중심에서 셀 몸을 만지 (찌르려고하지 않음) 천천히 그리고 꾸준히 세포 소마를 당기는하여 하나씩 꺼내 신경절. 부드럽게 전극에서 뉴런을 이동시키다하는 핀을 반대 누릅니다. </li><li> 도금 뉴런이 : 문화 접시에 Sylgard 요리에서 개별 뉴런을 전송 pipetman (P10)을 사용합니다. 플라스틱 팁이 hemolymph로 코팅되어 있도록 팁에 뉴런, pipet 문화 미디어를 전송하기 전에 (이것은 플라스틱으로 고집에서 뉴런을 방지). 모든 기포 또는 어떤 극단적인 세력 (즉, 아주 부드럽게 차지하고 pipetteman에서 뉴런을 제거)에 신경을 노출 방지에 큰 관심을 가지고. 골고루 음식을 통해 뉴런를 배포합니다. 똑바로 프로세스 부드럽게하기 위해 날카로운 전극을 사용하고 아래로 그들을 누릅니다. </li><li> 부화 : 3 시간 이하 이하 실온에서 현미경 무대에서 요리를 둡니다. 우리는 일상적으로 하룻밤을 두십시오. 현미경 스테이지가이 기간 동안 교란되지 않은 있는지 확인합니다. 빛과 보호하기 위해 알루미늄 호일로 무대를 커버. 부드럽게 18 ° C 배양기로 전송할 수 있습니다. </li><li> 문화는 대략 3 시간 이내에 접시를 준수해야하고 새로운 neurite 성장은 약 6-12 시간 이내에 표시되어야합니다. 격리된 감각 뉴런의 성장 DIV 3 또는 4의 고원에 도달합니다. 격리된 감각 뉴런도 아닌 형태 autapses 또는 서로 화학 시냅스, 그들은 양식 전기 갑 분기점을 비록합니다. </li></ol> 감각 뉴런 - 모터 뉴런 cocultures의 B. 준비 감각 뉴런은 문화 대상 모터 뉴런과 버렸네를 형성하고 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 모터 뉴런은 복부 신경절에서 LFS 모터 뉴런과 L7 모터 신경 세포입니다. LFS 모터 뉴런은 성인 (80~1백그램) Aplysia에서 고립, 그리고 복부 신경절 당 약 20 LFS 모터 뉴런이 있습니다. L7 모터 신경 세포는 청소년 (1-4 G) 동물로부터 격리하고, 복부 신경마다 하나의 L7가입니다. LFS 모터 뉴런은 직경 40-50 미크론있는 복부 신경의 복부 표면에 사이펀 신경의 루트에 가까운 르 감각 뉴런 사이에 interspersed이며, 각 소마의 미묘한 어두운 안료 명소 특징으로하고 있습니다. L7 모터 신경 세포의 직경은 100-150 마이크론이며 신경절의 왼쪽 중앙 가장자리에있는 신경절의 등의 표면에 존재합니다. 그것이 LFS 운동 뉴런을 사용하는 것이 더 경제적이지만, L7 모터 신경 세포의 대형 어떤 실험 유리한 것입니다. 또한, L7에 꼬리 복부 신경절의 지느러미 왼쪽 표면에 L11 모터 뉴런은, nontarget 모터 뉴런이고 효과적으로 감각 신경 세포가 fasciculates하지만 화학 시냅스를 형성하지 않는가있는 컨트롤로 사용할 수 있습니다. <ol><li> 신경의 제거를위한 동물을 마취. LFS 모터 뉴런에 같은 흉막 감각 뉴런에 설명 않습니다. L7 모터 뉴런 들어, 21 게이지 바늘로 10 ML의 주사기를 사용하여 청소년 Aplysia (1-4 G)에 0.35 M MgCl 2를 주입. </li><li> (청소년 동물에 대한 21 게이지 바늘을 사용하여) 위에 설명된대로 해부 접시에 anesthetized 동물을 핀 : 복부 신경을 해부하다. 좋은 포셉, 고급 가위를 사용하여 복부 신경을 잘라 버릴거야. </li><li> 신경의 단백 분해 효소는 소화가 : 이것은 소화 시간이 소년 (1-4 G) 동물에서 신경에 대한 1 시간 45 분으로 감소 것을 제외하고, 흉막 감각 뉴런에 설명된대로 이루어집니다. </li><li> 신경을 Desheathing : sylgard하고 L15가 포함된 35 또는 60mm 요리로 프로 테아제 - 소화 신경을 전송합니다. 곤충 핀 및 벌금 집게를 사용하여 적절한 방향 Sylgard 접시에있는 신경에​​ 스테레오 현미경 (외부 할로겐 조명 포함) 아래에 내려보기. 좋은 포셉와 바나 외과 가위로 조심스럽게 결합 조직을 채취해서 그것이의 연결을 세포 기관을 폭로 했네요. LFS 모터 뉴런을 분리하려면, 복부 표면가 직면되도록 신경을 핀, 그리고 집게로 LFS 모터 뉴런 (오른쪽으로), desheath을 포함하고있는 신경절의 전체 절반을 노출 다시 결합 조직의 피복을 당겨 신경절의 나머지 부분은 요리의 모든 결합 조직을 제거하고 더 L15를 추가합니다. L7 또는 L11 운동 신경 세포를 분리, 등 부분의 표면가 직면되도록 신경을 핀, 그리고 집게로 L7과 L11 (왼쪽)를 모두 포함하는 신경절의 절반을 폭로 다시 결합 조직의 피복을 가져옵니다. 절대 만지거나 somata의 연결을 손상하지 않도록주의하십시오. 신경절에서 가까운 거리 (보기의 필드 이내)에서 &quot;게시&quot;를 만들어 핀을 놓습니다. </li><li> 뉴런의 절연 : 같은 감각 뉴런에 설명된 날카로운 전극과 뉴런을 제거합니다. LFS의 뉴런은 비교 아르자신의 somata의 작은 어두운 안료 명소에 기초하여 이웃 르 감각 뉴런에서 erentiated. L11은 L7에 꼬리 때문에 L7 셀 몸이 둥글게 만드는 동안 L11 셀 몸이 모양에 더 많은 오블롱 때문에 그리고 L11의 축삭은 세포에 두 가까이로 분기하는 경향이 있기 때문에 L7 신경 세포는 먼저 L11 신경 세포에서 차별화된 수 몸. </li><li> 도금 뉴런 :이 감각 뉴런에 설명된대로 문화 접시에 Sylgard 요리에서 개별 뉴런을 전송 pipetman (P10)을 사용합니다. </li><li> 감각 뉴런과 페어링하는 것은 : 모터 뉴런은 적어도 1 시간을위한 문화 접시에 충실하자. 다음 고립된 감각 뉴런은 도금 모터 신경 세포에 인접한 각 감각 신경 세포를 제공, pipetman로 추가합니다. 날카로운 유리를 사용하면 신중하게 동등하거나 감각 세포 축삭의 길이보다 약간 더 적은 거리, 감각 신경 세포의 축삭을 평탄케하고, 모터 신경 옆에 위치로 감각 세포 본문을 동축 케이블 전극. 유리 전극을 사용하여 감각 축삭 결국 감각 축삭 물리적 모터 신경 세포의 축삭에 문의하도록 테이퍼 전극의 측면을 사용하여 매우 부드럽게, 모터 신경 세포와 접촉으로 올 동축 케이블. 문화 요리 리프트, 오히려 부드럽게 현미경 단계 따라 접시를 활강하지 마십시오. </li><li> 로 감각 뉴런에 설명되어 이하 3보다 시간과 18 ° C 배양기로 전송하기 위해 상온에서 현미경 무대에서 요리를 둡니다. </li><li> 문화는 대략 3 시간 이내에 접시를 준수해야하고 새로운 neurite 성장은 약 6-12 시간 이내에 표시되어야합니다. 감각 뉴런은 매우 신속하게 모터 뉴런과 시냅스를 형성 glutamatergic - 세포 날카로운 전극 기록 (3-5 시간), 흥분성의 시냅스 후 전위가 기록될 수를 수행하기에 충분한 자기편 아르 마자. 시냅스 연결 DIV 3 시까지 계속 증가하고 DIV7 때까지 안정됩니다. 뉴런은 문화의 첫 번째 1~3일 동안 정교한 neurite의 파생물을 표시해야합니다. </li></ol> Hemolymph의 C. 준비 Hemolymph는 Aplysia 문화에서 성장 인자 (포유 동물 세포 배양에 소태아 혈청의 사용에 유사)로 사용됩니다. 그것은 대형 (500g - 1kg) 동물에서 수집하고, (anecdotally) hemolymph를 수집하는 가장 좋은 시간은 봄 (6 월 중순 ~ 3 월) 동안입니다. 동물의 단지 작은 부분이 노출되도록 일회용 underpad에서 동물을 배냇저고리, 에탄올과 피부의 부분을 청소하고 다른 사람이 노출된 지역에 절개를 만들기 위해 멸균 면도날을 사용하는 동안 잠깐. 깨끗한 비커로 hemolymph의 squirts, 그건 동물의 더러운 피부를 접​​촉하지 않도록해야 할 수 있도록 동물을 묶어라. hemolymph은 동물의 hemocoel (즉, 동물이 기본적으로 hemolymph의 색입니다) 채워집니다. (이것은 오염되어있다면, 첫 번째 컬렉션 여전히 유용 있도록 새로운 비커에 수집) 새로운 절개를하고 최대한 많은 hemolymph를 수집하기 위해 열심히 짠다, 한두 번 동물을 Rewrap. 각 동물의 Hemolymph는 (즉, 다른 동물의 풀 hemolymph하지 않습니다) 별도로 보관해야합니다. 혈액 세포를 제거하는 10 분 2000 XG에서 hemolymph를 스핀. 10 ML의 aliquots에서 나누어지는 뜨는, -80에서 동물과 가게에 라벨 ° C. -20 ° C에 저장된 hemolymph 중간에 침전물을 형성합니다. hemolymph의 새로운 나누어지는는 때마다 문화 매체가 준비가되어 있습니다 사용해야하고, 나누어지는가 매체를 준비하기 직전 해동해야합니다. 해동 후 refreeze하지 마십시오.

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	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialogue+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+vitro:+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization.">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li><li>Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).</li><li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro.">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li><li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific,+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses:+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage.">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li><li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure.">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li></ol>

그것은 스테레오 현미경을 통해 볼 개별 뉴런의 microdissection 및 조작과 관련된 미세 모터 기술의 개발과 관련된 이후 Aplysia 감각 모터 문화의 성공적인 준비는 다소 느린 학습 곡선이 있습니다. 우리의 경험에서는 모터 뉴런과 감각 뉴런을 쌍으로하는 방법에 대한 자세한 내용은 문화의 건강한 고립 감각 뉴런과 추가 1~3주를 얻는 연습의 약 1-3주 걸립니다. 그 동안 현미경이 culturing (임의의 ...

솔루션은 문화에 필요한 <ol><li> 0.35 M MgCl 2, 실온에서 보관 마취에 사용. </li><li> 폴리 - L - 라이신 솔루션, 시그마 : 0.1M 나트륨 Borate pH8.2로 0.5mg/ml 솔루션에서 만들어진 P - 1524, MW&gt; 300000. 잘하고 필터 소용돌이 필터 0.22 μm의를 통해 소독, 4C의 °에서 그것을 저장합니다. 동결 - 해동하지 마십시오. </li><li> L - 15 중간 분말 (Leibovitz) (시그마 : L4386)는 1리터를 만들기 위해 아래의 염분과 보충 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> L - 15 분말 </td><td> 13.8g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 15.4 g </td></tr><tr><td> D - 포도당 </td><td> 6.24 g </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 0 </td><td> 6.45g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 350 MG </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 170 MG </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 5.49 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 2 시간 2 O </td><td> 1.43g </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53g </td></tr></table> ddH20 1 리터 추가합니다. 산도는 7.4-7.5에 대한 수 100X 펜 / Strep 솔루션 10ml를 추가하고, 0.22 m 필터를 통해 필터 소독해야합니다. 일개월 이상의 이상에 대한 4C0에 보관하십시오. </li><li> 테아제 소화 솔루션 : 1 % 테아제 IX (1unit/mg)는 L15에서 만든 (위의 같은 소금과 보충) 또는 ASW에 즉시 사용하기 전에, 0.22 m Millipore를 통해 필터 살균입니다. 5mls 두 동물 (신경이 완전히 테아제 용액에 잠겨 있는지 확인)에서 신경 충분해야합니다. 시그마들은 프로 테아제 IX 판매를 중단할 것이라고 보도했다. 대체 프로 테아제입니다 Dispase II (로체 응용 과학 카탈로그 # 04942078001). </li><li> 문화 매체. 사전 준비 문화 즉시, hemolymph의 10 ML의 나누어지는를 해동하고 20mls 배지를 만들기 위해 L15 10 MLS (위의 같은 소금과 보충)로 섞는다. L - 글루타민 200mM 200 μl를 추가, 잘 믹스와 문화를 준비하십시오. 때마다 문화가 만들어진 신선한 해당 매체가 준비되어야합니다. </li><li> 인공 해수는 인스턴트 오션 (수족관 시스템, 멘토, OH) 또는 다음과 같이 만들 수 있습니다 : 450 MM NaCl, 10 MM KCl, 30 MM MgCl 2 (6H 2 O), 20 MM MgSO 4, 10 MM CaCl 2 (2 시간 2 O), 7.4로 조정 산도 10 MM HEPES. </li></ol>

preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures

해양 연체 동물 Aplysia californica의 신경계는 약 20,000 뉴런으로 구성된, 비교적 간단합니다. 뉴런은 별개의 크기, 형태, 위치 및 pigmentations과 함께, 대형 (직경에 1 ㎜)과 식별되며, 세포 기관은 외부 동물의 체내 분산 오 이점의 신경에 노출됩니다. 이러한 속성은 동물 1 특정 동작을 기본 회로를 윤곽을 그리다하기 위해 조사를 허용합니다. 감각과 운동 뉴런 사이의 monosynaptic 연결 동물의 길 - 철수 반사의 중심 구성 요소, 동물이 사이펀의 촉각 자극에 대한 응답으로의 길을 철회하는 간단한 방어 반사합니다. 이 반사는 sensitization, 요법 이니, 그리고 고전적인 컨디셔닝을 포함하는 비 - 연관과 연관 학습의 형태를 겪습. 잘 특징 자극이 동물 2,3의 행동에 직접적으로 상호를 소성의 형태를 이끌어내는 어디 시냅스 소성의 연구에 특히 이익, 감각 모터 버렸네는 문화의 재구성 수 있습니다. 특히 세로토닌의 응용 프로그램은 시냅스, 응용 프로그램 프로토콜에 따라, (단기 촉진) 분 지속 강화, 시간 (중급 단기 촉진) 또는 일 (장기 촉진) 생산하고 있습니다. 대조적으로, 펩티드 송신기 FMRFamide의 응용 프로그램은 응용 프로그램 프로토콜에 따라 일 분 (장기 우울증)에서 지난 수 시냅스 약화이나 우울증을 생산하고 있습니다. 뉴런의 큰 크기는 표현 벡터, siRNAs 및 특정 신호 폭포와 분자를 대상으로하는 다른 화합물의 microinjection 함께 일 기간 동안 시냅스 강도의 반복 sharp 전극 기록을 허용함으로써 변경 사항을 기초 분자 및 세포 생물 학적 단계를 식별 시냅스 효능 인치 Aplysia 문화 시스템의 추가적인 장점은 뉴런 문화 4,5에서 버렸네 - 특이성을 보여주는 사실에서 비롯됩니다. 따라서, 감각 뉴런은 스스로 (autapses) 또는 다른 감각 뉴런과 시냅스를 형성하지 않으며 그들은 문화가 아닌 대상 확인된 모터 뉴런과 시냅스를 형성 않습니다. varicosities, 감각과 운동 뉴런 사이의 시냅스 접촉 사이트, 대상 모터 뉴런과 버렸네 형성은 (뿐만 아니라 시냅스 형태의 변화) 빛의 미세한 수준에서 공부 할 수 있도록 충분한 (직경 2-7 미크론) 큽니다. 이 비디오에서는, 우리는 그들의 신경, 신경의 테아제 소화, microdissection에 의해 결합 조직의 제거, 감각 및 운동 신경 및 제거 모두의 신분을 해부, anesthetizing 성인 및 청소년 Aplysia 포함한 감각 - 운동 신경 세포의 문화를, 준비의 각 단계를 보여주는 microdissection 각 세포 유형의 모터 신경 세포, 감각 neurite의 감각 신경 세포 및 조작의 이외의 도금은 교양 모터 신경 세포와 접촉을 형성합니다.

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Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

의 주요 문화<em&gt; Aplysia</em&gt; 감각 - 모터 뉴런은 버렸네 형성하고 시냅스 소성을 연구를위한 모델 준비를 제공합니다<em&gt; 체외에서</em&gt;. 이 비디오에서 감각 및 운동 신경의 식별 및 microdissection을 보여<em&gt; Aplysia</em&gt; 신경뿐만 아니라 문화의 감각 - 모터 뉴런을 설정하고 관리하기위한 방법.

의 준비 Aplysia 감각 - 모터의 연결을 셀 문화

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

15.9K 조회수.  University of California, Los Angeles. 의 주요 문화 Aplysia 감각 - 모터 뉴런은 버렸네 형성하고 시냅스 소성을 연구를위한 모델 준비를 제공합니다 체외에서. 이 비디오에서 감각 및 운동 신경의 식별 및 microdissection을 보여 Aplysia 신경뿐만 아니라 문화의 감각 - 모터 뉴런을 설정하고 관리하기위한 방법.

비디오: Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In general, the differentiation of ES cells follows the concept to first generate immature progenitor cells, which then can be propagated and differentiated into mature cellular phenotypes. This also applies for ES cell-derived neurogenesis, in which the development of neural cells follows two major steps: First, the derivation and expansion of immature neuroepithelial precursors and second, their differentiation into mature neural cells. A common method to produce neural progenitors from ES cells is based on embryoid body (EB) formation, which reveals the differentiation of cells from all germ layers including neuroectoderm. An alternative and more efficient method to induce neuroepithelial cell development uses stromal cell-derived inducing activity (SDIA), which can be achieved by co-culturing ES cells with skull bone marrow-derived stromal cells (1). Both, EB formation and SDIA, reveal the development of rosette-like structures, which are thought to resemble neural tube- and/or neural crest-like progenitors. The neural precursors can be isolated, expanded and further differentiated into specific neurons and glia cells using defined culture conditions. Here, we describe the generation and isolation of such rosettes in co-culture experiments with the stromal cell line MS5 (2-5).

Derivation of neuroepithelial precursors from embryonic stem (ES) cells using stromal cell-derived inducing activity (SDIA).

ES 세포 - 파생 Neuroepithelial 셀 문화

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

연구

생물학

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

성장 콘스의 고해상도 이미징을위한 Aplysia에서의 연결을 셀 문화

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

마우스 표피 신경 크레스트 줄기 세포 (에피 NCSC) 문화

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Compartmented 문화의 도설 루트 신경의 뉴런의 준비 및 유지 관리

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

신경 세포와 Glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...