Lavoro in laboratorio che coinvolge la coltura di neuroni Aplysia è finanziato dalla lista NIH R01 e NIH R21MH077921.

Preparazione (vedi sezione soluzioni alla fine del protocollo per la composizione delle soluzioni) <ol><li> Preparare i piatti della cultura. Cappotto di vetro e di Mattek con fondo di vetro piatto cultura con poli-L-lisina (made in borato di sodio). Aggiungi sufficiente a coprire completamente il vetro bene e lasciare per&gt; 1 ora (può essere lasciato tutta la notte). Rimuovere accuratamente la poli-L-lisina dal risciacquo in acqua di mare artificiale (ASW) 4-5 volte. Dopo aver rimosso l&#39;ultimo risciacquo, aggiungere 2 ml di 50% L15 (integrato con sali e contenente L-glutammina ad una concentrazione finale di 2 mm) / 50% emolinfa. Questo terreno di coltura deve essere piatto per almeno un&#39;ora prima di cellule placcatura in modo che i cappotti emolinfa il piatto. </li><li> Pulire gli strumenti e piatti Sylgard con etanolo, li lavare a fondo con DDH 2 0 e poi li posto per&gt; 1 ora sotto una luce UV nel cappuccio cultura. </li><li> Preparare elettrodi forte per microdissezione dei neuroni. Con un estrattore microelettrodo (ad esempio Sutter Flaming Brown P-97), tirare elettrodi pipetta di vetro da 1,5 mm di diametro esterno, 0,86-1,12 mm di diametro interno e 100 mm di lunghezza (per esempio AM catalogo di sistema # 628000; Strumenti di precisione mondiale TW150-4, 1.55 / 1.12). Utilizzare i parametri che producono un elettrodo con una punta lunga e wispy multa di tale resistenza che non ci sia l&#39;assunzione capillare di liquido, quando sono immessi in soluzione. La presenza di un menisco liquido significa che la punta dell&#39;elettrodo si danno dei neuroni durante l&#39;isolamento. Il libro di cucina elettrodo Sutter fornisce le linee guida eccellente per la creazione di programmi di elettrodi. Usiamo un filamento scatola, e un one-step tirare elettrodi per generare cultura. </li><li> Preparare la soluzione anestetica (MgCl2 0,35 m), terreno di coltura (L15 integrato con sali e emolinfa), e la soluzione di proteasi (1% della proteasi tipo IX, Sigma, 1 unità / mg, per una concentrazione finale di 10 unità / ml). </li><li> Animali: utilizzare adulti 80-100 g Aplysia per l&#39;isolamento dei neuroni sensoriali e di LFS motoneuroni. Usa giovanile 1-4 g Aplysia per l&#39;isolamento di L7 motoneuroni. Togliere delicatamente gli animali dalle vasche di acqua di mare, e mantenere in acqua di mare (in coppa, secchio o sacchetto di plastica) per non più di 30 minuti prima di iniziare l&#39;anestesia e la procedura di cultura. </li></ol> Cultura procedura A. coltura neuroni pleurico sensoriali provenienti da 80-100 g Aplysia <ol><li> Anestetizzare gli animali per la rimozione dei gangli: Iniettare 0,35 M MgCl 2 in adulti Aplysia (80-100 g) utilizzando una siringa da 60 ml con un calibro 18 ago 1,5 pollici. Inserisci il piede dell&#39;animale con un angolo di circa 35 gradi, e non entrare troppo in profondità. L&#39;obiettivo è quello di iniettare nel hemocoel dell&#39;animale senza penetrare gli organi interni. L&#39;animale dovrebbe diventare molto disteso e rilassato. </li><li> Sezionare i gangli: Pin anestetizzato l&#39;animale su un piatto da dissezione, con un perno (18-gauge aghi funzionano bene per gli animali 80-100 g) in testa e la coda, e il piede verso l&#39;alto. Tenere il piede con una pinza dentata e tagliare la pelle ed il tessuto connettivo sottostante l&#39;intera lunghezza del piede (dalla testa alla coda) con un paio di forbici chirurgiche. Pin i due lati verso il basso. Utilizzando una pinza e forbici, tagliare l&#39;esofago e tirare a lato per esporre i gangli. Utilizzando una pinza fine e forbici, tagliare i gangli pleurico pedale (i neuroni sensoriali sono nei gangli della pleura). Lascia una buona dose di coraggio poiché questo rende più facile da definire i gangli dopo il trattamento della proteasi. </li><li> Digestione della proteasi di gangli: Posizionare i gangli della proteasi in soluzione (10 mg / ml di 1 unità / mg in L15) in un incubatore a 34,5 ° C (34-35 ° C va bene), per 2 ore e 15min. Utilizzando la punta fine pinze per il trasferimento e lavare i gangli in ASW tre volte. Tenere i gangli in L15. Si noti che il tempo di incubazione della proteasi può variare. Lo scopo è quello di permettere il tessuto connettivo di essere facilmente rimossi. Se è troppo difficile desheath gangli senza danneggiare i neuroni, aumentare il tempo di incubazione della proteasi. Se è estremamente facile da desheath i gangli ei neuroni sono &quot;soft&quot;, ridurre il tempo di incubazione della proteasi. </li><li> Desheathing i gangli: Trasferimento alla proteasi digerito gangli ad un 60 mm o 35 millimetri piatto contenente sylgard e L15. Guarda sotto uno stereo-microscopio (con illuminazione alogena esterna), rimuovere il pedale gangli e definire con precisione i gangli della pleura nel piatto Sylgard con l&#39;orientamento corretto utilizzando perni di insetti e una pinza sottile. Con la pinza fine e un paio di forbici chirurgiche Vanna, sollevare con attenzione il tessuto connettivo e tagliarlo per esporre il cluster sensoriale. Fare attenzione a non toccare mai il somata o danni neuronali. Rimuovere qualsiasi tessuto connettivo in eccesso dal piatto e aggiungere altri media, facendo attenzione a non esporre il ganglio desheathed all&#39;aria. Il cluster sensoriale è costituito da circa 200 neuroni cluster di 40-50 micron di diametro. Impostare un pin per fare un &quot;post&quot; a breve distanza dal Ganglione (entro il campo visivo). </li><li> Isolamento dei neuroni: Uso lungo, affilato cultura elettrodo di vetro, estrarre il identificato neuroni uno per uno toccando il corpo cellulare appena fuori del centro (non impalare) e tirando lentamente e costantemente il soma cellulare, insieme con l&#39;assone, lontano dal ganglio. Battere delicatamente contro il perno per sloggiare i neuroni dall&#39;elettrodo. </li><li> Neuroni placcatura: Utilizzare un Pipetman (P10) per trasferire i singoli neuroni dal piatto Sylgard ad un piatto della cultura. Prima di trasferire i, i neuroni terreno di coltura pipetta nella punta in modo che la punta di plastica è rivestita con emolinfa (questo impedisce ai neuroni di attaccarsi alla plastica). Fare molta attenzione per evitare di esporre i neuroni di eventuali bolle d&#39;aria o ad uno qualsiasi forze estreme (cioè molto gentilmente prendere e togliere i neuroni dalla pipetteman). Distribuire i neuroni in modo uniforme in tutto il piatto. Utilizzare un elettrodo appuntito per delicatezza direttamente i processi e li tocca fino in fondo. </li><li> Incubazione: Lasciare i piatti sul palco microscopio a temperatura ambiente per non meno di 3 ore. Noi abitualmente li lasciare per una notte. Assicurarsi che la fase di microscopio è imperturbabile durante questo periodo. Coprire il palco con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Delicatamente il trasferimento ad un 18 ° C incubatore. </li><li> Le culture dovrebbero aderire al piatto in circa 3 ore e la crescita dei neuriti nuovo dovrebbe essere visibile in circa ore 6-12. La crescita dei neuroni sensoriali isolate raggiunge un plateau di DIV 3 o 4. Si noti che isolato i neuroni sensoriali non doe autapses forma o sinapsi chimica tra di loro, anche se lo fanno giunzioni gap elettrico forma. </li></ol> B. Preparazione del neurone sensitivo-motoria co-colture neuroni Neuroni sensoriali forma sinapsi con i neuroni bersaglio motore in cultura. I neuroni motori più comunemente usati sono i motoneuroni LFS e le L7 motoneurone, dal ganglio addominale. I neuroni motori IFL sono isolati da adulti (80-100 g) Aplysia, e ci sono circa 20 i neuroni motori IFL al ganglio addominale. Il motore L7 neurone è isolato dal giovanile (1-4 g) gli animali, e c&#39;è solo un L7 per gangli addominali. LFS motoneuroni sono 40-50 micron di diametro, si alternano tra i neuroni sensoriali LE vicino alla radice del nervo sifone sulla superficie ventrale dei gangli addominali, e sono caratterizzati da un punto sottile pigmento scuro in ogni soma. Il motore L7 neurone è di 100-150 micron di diametro ed è presente sulla superficie dorsale del ganglio, ai margini centro del lato sinistro del ganglio. Mentre è più economico da usare LFS motoneuroni, le grandi dimensioni del motore L7 neurone è vantaggioso per alcuni esperimenti. La L11 del motoneurone, anche sulla superficie dorsale sinistro del ganglio addominale, caudale a L7, è un neurone motore non bersaglio e può essere efficacemente utilizzato come controllo con cui il neurone sensoriale fasciculates ma non forma sinapsi chimiche. <ol><li> Anestetizzare gli animali per la rimozione dei gangli. Per LFS motoneuroni, fare come descritto per pleurico neuroni sensoriali. Per L7 motoneuroni, iniettare 0,35 M MgCl 2 in Aplysia giovanile (1-4 g) con una siringa da 10 ml con un ago da 21 gauge. </li><li> Sezionare i gangli addominali: Pin anestetizzato l&#39;animale su un piatto sezionare come descritto in precedenza (con 21 aghi calibro di animali giovani). Utilizzando una pinza fine e forbici, tagliare i gangli addominali. </li><li> Digestione della proteasi di gangli: Questo è fatto come descritto per pleurico neuroni sensoriali, tranne che il tempo di digestione è ridotto a 1 ora e 45 min per gangli dal giovanile (1-4 g) gli animali. </li><li> Desheathing i gangli: Trasferimento alla proteasi digerito gangli di un piatto di 35 o 60 mm contenente sylgard e L15. Guarda sotto uno stereo-microscopio (con illuminazione alogena esterna), nei gangli giù nel piatto Sylgard con l&#39;orientamento corretto utilizzando perni di insetti e una pinza sottile. Con la pinza fine e un paio di forbici chirurgiche Vanna, sollevare con attenzione il tessuto connettivo e tagliarla a esporre i corpi cellulari neuronali. Per isolare i neuroni motori IFL, perno del ganglio modo che la superficie ventrale è rivolta verso l&#39;alto, e con una pinza tirare la guaina di tessuto connettivo per esporre tutta la metà del ganglio che contiene il motore IFL neuroni (a destra), il desheath parti rimanenti del ganglio, rimuovere qualsiasi tessuto connettivo dal piatto e aggiungere altri L15. Per isolare le L7 L11 o motoneurone, perno del ganglio modo che la superficie dorsale è rivolta verso l&#39;alto, e con una pinza tirare la guaina di tessuto connettivo per esporre la metà del ganglio che contiene sia L7 e L11 (a sinistra). Fare attenzione a non toccare mai il somata o danni neuronali. Posizionare un pin per fare un &quot;post&quot; a breve distanza dal ganglio (entro il campo visivo). </li><li> Isolamento dei neuroni: rimuovere i neuroni con un elettrodo affilato come descritto per i neuroni sensoriali. I neuroni sono LFS differentiated dalla vicina LE neuroni sensoriali sulla base di una piccola macchia pigmento scuro nel loro somata. Il L7 neurone può essere differenziato dal neurone L11 in primo luogo perché la L11 è caudale di L7, L11 perché il corpo cellulare è più di forma oblunga, mentre la L7 corpo cellulare è più rotondo e perché l&#39;assone L11 tende ad espandersi in due vicino alla cella corpo. </li><li> Neuroni placcatura: Utilizzare un Pipetman (P10) per trasferire i singoli neuroni dal piatto Sylgard ad un piatto della cultura come descritto per i neuroni sensoriali. </li><li> Abbinamento con i neuroni sensoriali: Lasciate che i neuroni motori aderire al piatto cultura per almeno 1 ora. Quindi aggiungere i neuroni sensoriali isolati con una Pipetman, offrendo ogni neurone sensoriale adiacente ad un neurone motore placcato. Utilizzando un elettrodo di vetro tagliente attentamente raddrizzare l&#39;assone dei neuroni sensoriali, coassiale e il corpo delle cellule sensoriali ad una posizione vicino al neurone motore, ad una distanza uguale o leggermente inferiore alla lunghezza degli assoni delle cellule sensoriali. Utilizzando l&#39;elettrodo di vetro, coassiale l&#39;assone sensoriali per entrare in contatto con il neurone motore, molto delicatamente con il lato della elettrodo affusolato di avere finalmente l&#39;assone sensoriale fisicamente contattare l&#39;assone del neurone motore. Non sollevare il piatto di cultura, ma piuttosto dolcemente scivolare il piatto lungo il palco microscopio. </li><li> Lasciare i piatti sul palco microscopio a temperatura ambiente per non meno di 3 ore e il trasferimento ad un 18 ° C incubatore come descritto per i neuroni sensoriali. </li><li> Le culture dovrebbero aderire al piatto in circa 3 ore e la crescita dei neuriti nuovo dovrebbe essere visibile in circa ore 6-12. Neuroni sensoriali formano sinapsi glutammatergica con i neuroni motori molto rapidamente - non appena le cellule aderenti sono sufficienti per effettuare la registrazione tagliente elettrodo (3-5 ore), un post-sinaptica eccitatoria potenziale può essere registrato. Connettività sinaptica continua ad aumentare fino DIV 3, ed è poi stabile fino DIV7. I neuroni dovrebbe mostrare escrescenza elaborare dei neuriti durante i primi 1-3 giorni di coltura. </li></ol> Preparazione C. emolinfa Emolinfa viene utilizzato come un fattore di crescita nella cultura Aplysia (analogo per l&#39;utilizzo del siero di vitello fetale in colture cellulari di mammifero). Si sono raccolti da grande (500 g-1 kg) gli animali, e il momento migliore per raccogliere emolinfa (aneddoticamente) è durante la primavera (metà marzo a giugno). Fasciare l&#39;animale in un underpad usa e getta in modo che solo una piccola parte dell&#39;animale è esposto, pulita quella porzione di pelle con l&#39;etanolo, e poi tenerlo premuto mentre un&#39;altra persona usa una lama di rasoio sterile di fare un&#39;incisione sulla superficie esposta. Spremere l&#39;animale in modo che l&#39;emolinfa schizza in un bicchiere pulito, facendo attenzione che non si sporca contatto con la pelle dell&#39;animale. L&#39;emolinfa riempie la hemocoel dell&#39;animale (cioè, l&#39;animale è fondamentalmente un sacco di emolinfa). Rewrap l&#39;animale una o due volte, fare una nuova incisione e spremere difficile raccogliere emolinfa il più possibile (raccogliere in un bicchiere nuovo in modo che se diventa contaminati, la prima collezione è ancora utilizzabile). Emolinfa di ciascun animale deve essere tenuto separatamente (cioè non emolinfa piscina da diversi animali). Gira la emolinfa a 2000 xg per 10 minuti per rimuovere le cellule del sangue. Aliquota del surnatante in aliquote da 10 ml, etichetta con animali e conservare a -80 ° C. Si noti che emolinfa conservati a -20 ° C costituisce un precipitato in mezzo. Una nuova aliquota di emolinfa deve essere utilizzato ogni volta terreno di coltura è preparato, e l&#39;aliquota dovrebbe essere scongelati solo prima di preparare il mezzo. Non ricongelare dopo lo scongelamento.

<ol>
	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialogue+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+vitro:+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization.">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li><li>Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).</li><li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro.">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li><li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific,+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses:+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage.">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li><li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure.">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li></ol>

La preparazione di successo di Aplysia senso-motorie culture ha una curva di apprendimento un po &#39;lento, in quanto comporta lo sviluppo di abilità motorie associate a microdissezione e la manipolazione di singoli neuroni visto attraverso uno stereo-microscopio. Nella nostra esperienza, ci vogliono circa 1-3 settimane di pratica per ottenere sano neuroni sensoriali isolate nella cultura e settimane supplementari 1-3 per imparare a coppia neuroni sensoriali con i neuroni motori. Noi abitualmente preparare le...

Soluzioni necessarie per la cultura <ol><li> 0,35 M MgCl 2, conservato a temperatura ambiente, utilizzato per l&#39;anestesia. </li><li> Poli-L-lisina soluzione, Sigma: P-1524, PM&gt; 300.000, made in sodio borato 0.1M pH8.2 a 0.5mg/ml soluzione. Vortex bene e sterilizzare filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron, conservarlo a ° 4C. Non gelo-disgelo. </li><li> L-15 Media in polvere (Leibovitz) (Sigma: L4386) integrata con i sali, come di seguito per fare 1 litro <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> L-15 in polvere </td><td> 13.8g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 15,4 g </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> 6,24 g </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 0 </td><td> 6.45g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 170 mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 5,49 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 1.43g </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53g </td></tr></table> Aggiungi ddH20 a 1 litro. Il pH dovrebbe essere di circa 7,4-7,5, aggiungere 10 ml di 100X Pen / Strep soluzione e filtro-sterilizzare attraverso un filtro di m 0,22. Conservare a 4C0 per non più di 1 mese. </li><li> Digestione soluzione proteasi: 1% della proteasi IX (1unit/mg) è realizzato in L15 (integrato con sali come sopra) o in ASW immediatamente prima dell&#39;uso, sterilizzata per filtrazione attraverso un m 0,22 Millipore. 5mls dovrebbe essere sufficiente per i gangli da due animali (assicurarsi che i gangli sono completamente immersi in una proteasi). Sigma ha riferito che interromperà la vendita delle proteasi IX. Una proteasi sostituto è: dispasi II (Roche Applied Science catalogo # 04942078001). </li><li> Terreno di coltura. Immediatamente prima di culture preparazione, disgelo un&#39;aliquota di 10 ml di emolinfa e di mescolarlo con 10 ml di L15 (integrata con sali come sopra) per fare media 20mls cultura. Aggiungere 200 ml di 200mm L-Glutammina, mescolare bene e utilizzare per la preparazione di culture. Questo mezzo deve essere preparata fresca ogni volta le culture sono fatti. </li><li> L&#39;acqua di mare artificiale può essere fatto da Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) o come segue: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl 2 (6H 2 O), 20 mM MgSO 4, 10 mM CaCl 2 (2H 2 O), 10 mM HEPES, con pH regolato a 7,4. </li></ol>

preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures

Il sistema nervoso del mollusco marino Aplysia californica è relativamente semplice, costituita da circa 20.000 neuroni. I neuroni sono di grandi dimensioni (fino a 1 mm di diametro) e identificabili, con dimensioni diverse, forme, posizioni e pigmentazioni, ed i corpi cellulari sono esposti esternamente in cinque gangli coppie distribuite in tutto il corpo dell&#39;animale. Queste proprietà hanno permesso agli investigatori di delineare il circuito sottostante comportamenti specifici nell&#39;animale 1. Il collegamento monosinaptico tra i neuroni sensoriali e motori è una componente centrale della branchia-ritiro riflesso nell&#39;animale, un semplice riflesso difensivo, in cui l&#39;animale ritira la sua branchia in risposta alla stimolazione tattile del sifone. Questo riflesso subisce forme di apprendimento non associativo e associative, tra cui la sensibilizzazione, assuefazione e condizionamento classico. Di particolare beneficio per lo studio della plasticità sinaptica, il senso-motorie sinapsi possono essere ricostituita nella cultura, dove ben caratterizzato stimoli suscitare forme di plasticità che si correla direttamente nel comportamento dell&#39;animale 2,3. In particolare, l&#39;applicazione di serotonina produce un potenziamento sinaptico che, a seconda del protocollo di applicazione, durata di minuti (a breve termine facilitazione), ore (medio termine facilitazione) o giorni (a lungo termine facilitazione). Al contrario, l&#39;applicazione della FMRFamide trasmettitore peptide produce un indebolimento sinaptico o depressione che, a seconda del protocollo di applicazione, può durare da minuti a giorni (depressione a lungo termine). Le grandi dimensioni dei neuroni permette di ripetere la registrazione elettrodo affilato di forza sinaptica per periodi di giorni insieme con la microiniezione di vettori di espressione, siRNA e altri composti a target specifici cascate di segnalazione e le molecole e quindi identificare i passi molecolare e cellulare biologici che sono alla base delle modifiche di efficacia sinaptica. Un ulteriore vantaggio del sistema cultura Aplysia deriva dal fatto che i neuroni dimostrare sinapsi-specificità nella cultura 4,5. Così, i neuroni sensoriali non formano sinapsi con se stessi (autapses) o con altri neuroni sensoriali, né si formano sinapsi con i neuroni motori bersaglio individuato nella cultura. La varicosità, siti di contatto sinaptico tra neuroni sensoriali e motori, sono abbastanza grandi (2-7 micron di diametro) per permettere la formazione delle sinapsi (così come i cambiamenti nella morfologia sinaptica) con i neuroni motori obiettivo da studiare a livello microscopico luce. In questo video, dimostriamo ogni fase della preparazione senso-motorio culture neurone, tra adulti e anestetizzare Aplysia giovanile, sezionare i loro gangli, la digestione dei gangli della proteasi, la rimozione del tessuto connettivo di microdissezione, l&#39;identificazione di entrambi i neuroni motori e sensoriali e la rimozione di ogni tipo di cellula di microdissezione, placcatura del neurone motore, l&#39;aggiunta del neurone sensoriale e la manipolazione dei neuriti sensoriali per formare il contatto con la cultura del motoneurone.

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Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Colture primarie di<em&gt; Aplysia</em&gt; Senso-motorie i neuroni fornire una preparazione del modello per studiare la formazione di sinapsi e la plasticità sinaptica<em&gt; In vitro</em&gt;. Questo video dimostra l&#39;identificazione e la microdissezione dei neuroni sensoriali e motori da<em&gt; Aplysia</em&gt; Gangli così come i metodi per stabilire e mantenere senso-motorio neuroni in coltura.

Preparazione del Aplysia Senso-motorio colture cellulari neuronali

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

15.9K Views.  University of California, Los Angeles. Colture primarie di Aplysia Senso-motorie i neuroni fornire una preparazione del modello per studiare la formazione di sinapsi e la plasticità sinaptica In vitro. Questo video dimostra l'identificazione e la microdissezione dei neuroni sensoriali e motori da Aplysia Gangli così come i metodi per stabilire e mantenere senso-motorio neuroni in coltura.

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ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In general, the differentiation of ES cells follows the concept to first generate immature progenitor cells, which then can be propagated and differentiated into mature cellular phenotypes. This also applies for ES cell-derived neurogenesis, in which the development of neural cells follows two major steps: First, the derivation and expansion of immature neuroepithelial precursors and second, their differentiation into mature neural cells. A common method to produce neural progenitors from ES cells is based on embryoid body (EB) formation, which reveals the differentiation of cells from all germ layers including neuroectoderm. An alternative and more efficient method to induce neuroepithelial cell development uses stromal cell-derived inducing activity (SDIA), which can be achieved by co-culturing ES cells with skull bone marrow-derived stromal cells (1). Both, EB formation and SDIA, reveal the development of rosette-like structures, which are thought to resemble neural tube- and/or neural crest-like progenitors. The neural precursors can be isolated, expanded and further differentiated into specific neurons and glia cells using defined culture conditions. Here, we describe the generation and isolation of such rosettes in co-culture experiments with the stromal cell line MS5 (2-5).

Derivation of neuroepithelial precursors from embryonic stem (ES) cells using stromal cell-derived inducing activity (SDIA).

ES Cell-derivati ​​colture cellulari neuroepiteliale

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

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Biologia

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparazione del dissociato Culture Neuron mouse corticale

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Colture cellulari neuronali da Aplysia per imaging ad alta risoluzione di coni di crescita

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Topo Epidermal cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC) Culture

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Preparazione e manutenzione dei neuroni dei gangli dorsali in Culture Compartmented

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparazione del Aplysia Senso-motorio colture cellulari neuronali

Riepilogo

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Capitoli in questo video

ES Cell-derivati colture cellulari neuroepiteliale

Culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase Drosophila Pupae

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

Preparazione del dissociato Culture Neuron mouse corticale

Colture cellulari neuronali da Aplysia per imaging ad alta risoluzione di coni di crescita

Topo Epidermal cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC) Culture

La preparazione di 2-dGuo-trattati Organ Culture Timo

Preparazione e manutenzione dei neuroni dei gangli dorsali in Culture Compartmented

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia

Preparazione del Aplysia Senso-motorio colture cellulari neuronali

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Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia

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