Nous tenons à remercier Jürgen Soll pour des discussions utiles et Chris Carrie pour la lecture critique du manuscrit. Ce projet a été financé par la DFG et le Fonds der chemischen Industrie (nombre de subventions SFB 1035, projet A04 SS et faire 187/22 de RS).

Une. Transformation de BiFC Construit en Agrobacteria <ol><li> Le clonage de constructions BiFC <ol><li> Amplifier le gène d&#39;intérêt à partir d&#39;un modèle approprié, en utilisant des oligonucleotides contenant des sites attB encadrant. Effectuez une PCR en utilisant une polymérase de relecture. Adapter la longueur de l&#39;étape de recuit de la combinaison d&#39;amorces conçues et la durée de l&#39;étape d&#39;élongation en fonction de la taille des fragments. Vérifier le produit de PCR par électrophorèse sur gel d&#39;agarose et le purifier en utilisant une PCR Clean-up Kit. </li><li> Effectuer la réaction BP avec le fragment obtenu et le vecteur d&#39;entrée en utilisant une recombinase BP. Mélanger de 15 à 150 ng du produit attB-PCR avec 150 ng du vecteur d&#39;entrée, ajouter 2 ul de la recombinase BP et remplir avec du tampon TE jusqu&#39;à un volume total de 8 ul. Incuber le mélange réactionnel pendant 1 heure à température ambiante et arrêter la réaction en ajoutant 2 ul de proteinase K pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Transformer la totalité de la réaction dans E. compétente coli DH5a; Cellules et écran des colonies obtenues par PCR sur colonie pour l&#39;insertion correcte du fragment d&#39;ADN dans le vecteur. Le séquençage d&#39;ADN des plasmides positifs est effectué pour vérifier l&#39;absence de mutations. </li><li> Utiliser l&#39;entrée clone obtenu pour la recombinaison LR avec le vecteur de destination appropriée en utilisant une recombinase de LR. Mélanger 50-150 ng du vecteur d&#39;entrée avec 150 ng du vecteur de destination, ajouter 1 pl LR recombinase et remplir avec du tampon TE à un volume total de 5 pi. Incuber le mélange réactionnel pendant 1 heure à température ambiante et arrêter la réaction en ajoutant 1 ul de proteinase K pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Transformer la totalité de la réaction dans des cellules de E. coli DH5a compétentes et écran colonies obtenues par PCR sur colonie pour l&#39;insertion correcte du fragment d&#39;ADN dans le vecteur. séquençage de l&#39;ADN n&#39;est pas nécessaire à cette étape. </li><li> Isoler l&#39;ADN plasmidique avec un kit plasmide Mini pour assurer un haut degré de pureté. </li></ol></li><li> Préparation d&#39;agrobactéries compétentes chimiquement (souche AGL1, la rifampicine et la résistance Carbénicilline) <ol><li> Streak sur agrobactéries d&#39;une culture de valeurs et se développent pendant 24 heures à 28 ° C. </li><li> Inoculer 5 ml de milieu LB avec une colonie unique et incuber pendant une nuit à 28 ° C. </li><li> Inoculer 50 ml de milieu LB avec 2 ml de la culture d&#39;une nuit et croître pendant environ 4 heures à 28 ° C jusqu&#39;à une DO 600 de 1,0. </li><li> Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 15 min à 4 ° C et remettre en suspension le culot dans 1 ml stérilisées glacée CaCl2 (10 mM). Gardez les cellules sur la glace après cette étape. </li><li> Préparer des aliquotes (100 pi) des cellules, geler immédiatement dans de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C. </li></ol></li><li> Transformation des agrobactéries chimiquement compétente <ol><li> Décongeler une aliquote de cellules AGL1 compétentes sur la glace. Ajouter 1-2 ug d&#39;ADN de plasmide dans les cellules. Incuber pendant 5 min sur de la glace, 5 min dans de l&#39;azote liquide et 5 min à 37 ° C. Ajouter 600 ul de milieu LB pour les cellules et les smerlu à 650 tours par minute pendant 4 heures à 28 ° C. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 1 min à 8000 xg et jeter le surnageant. Reprendre le culot dans 50 ul de milieu LB et restant plaque sur des plaques LB contenant les antibiotiques appropriés. Sceller les plaques et incuber pendant 2 jours à 28 ° C. colonies d&#39;écran pour la présence du plasmide par PCR sur colonie. </li><li> Inoculer une colonie positive dans 5 ml de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés et incuber à 28 ° C pendant une nuit. Mélanger 500 ul de la culture d&#39;une nuit avec 500 ul de glycerol à 50% stérile et congeler à -80 ° C. </li><li> Inoculer les agrobactéries en milieu LB contenant les antibiotiques appropriés directement du stock de glycérol pour la transformation transitoire de feuilles de tabac. </li></ol></li></ol> 2. Transformation transitoire de feuilles de tabac <ol><li> Agrobacteria croissance <ol><li> Préparer les solutions mères suivantes: Acétosyringone (150 mM, dissoudre dans 70% EtOH), magasin sous forme d&#39;aliquotes à -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5,7, conserver à 4 ° C (filtre stérile à travers un filtre de 0,2 um pour prévenir la croissance bactérienne pendant plus de stockage), MgCl 2 (1 M) stock, magasin à la température ambiante. </li><li> Inoculer 10 ml de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés avec 50 pl de la AGL1 stock de glycérol culture contenant le plasmide d&#39;intérêt dans un tube de 50 ml stérile et incuber à 28 ° C pendant au moins 24 heures sous agitation à 190 tours par minute jusqu&#39;à une DO 600 de 1,0 -2,0 est atteinte. </li><li> bactéries à centrifuger à 3000 g pendant 15 min. Reprendre le culot dans fraîchement moyen d&#39;infiltration [MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, Acétosyringone (150 M)] et ajuster la suspension à une DO 600 de 1,0. </li><li> Incuber les cellules agrobactéries dans un agitateur de tête pendant 2 heures dans l&#39;obscurité. Les cellules peuvent ensuite être utilisés pour l&#39;infiltration. </li></ol></li><li> L&#39;infiltration des feuilles de tabac <ol><li> Utilisez troissemaine vieux tabac (Nicotiana benthamiana) plantes. Choisissez plusieurs feuilles les plus âgées d&#39;infiltration. </li><li> Mélanger des volumes égaux des agrobactéries portant les constructions d&#39;intérêt (3 ml chacun). Prendre une seringue de 5 ml sans aiguille pour l&#39;infiltration. Infiltrer la suspension de cellules avec précaution dans les feuilles de tabac en appuyant sur la seringue sur la face inférieure des feuilles à plusieurs endroits. </li><li> Arrosez les plantes et les laisser dans l&#39;obscurité pendant deux jours. </li></ol></li></ol> 3. Préparation de protoplastes Préparation de protoplastes de feuilles de tabac a été adapté à partir de Koop et al. 16 et légèrement modifié. <ol><li> préparation de tampon <ol><li> Préparer milieu F-PCN: Macro-sels [KNO 3 (1012 pg / ml), CaCl 2 • 2H 2 O (440 pg / ml), MgSO 4 7H 2 O • (370 pg / ml), KH 2 PO 4 ( 170 pg / ml), NH 4-succinate [(20 mM; préparer un 2 m stock solution (succinate (236 ug / ml) et NH 4 Cl (106 ug / ml), ajuster le pH à 5,8 pour dissoudre)], les micro-sels [EDTA-Fe (III) x sel de Na (40 ug / ml), KJ (0,75 ug / ml), H 3 BO 3 (3 pg / ml), MnSO 4 • H 2 O (10 pg / ml), ZnSO 4 • 7H 2 O (2 pg / ml), Na 2 MoO 4 • 7H 2 O (0,25 ug / ml), CuSO 4 • 5H 2 O (0,025 pg / ml), CoCl 2 • 6H 2 O (0,025 g / ml)], MES (390 ug / ml), du glucose (environ 80 pg / ml) osmolarité de 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Magasin à -20 ° C. </li><li> Préparer le milieu F-PIN: tous les ingrédients du F-PCN, mais au lieu d&#39;utiliser le glucose du saccharose (environ 110 pg / ml), l&#39;osmolarité de 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Magasin à -20 ° C. </li><li> Préparer milieu W5: NaCl 150 mM, 125 mM CaCl 2, 5 mM de KCl, 2 mM MES, osmolarité 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Conserver à 4 °; C (filtre stérile à travers un filtre de 0,2 um à prévenir la croissance bactérienne pendant plus de stockage). </li><li> Préparer une solution fraîche d&#39;enzymes pour l&#39;isolement de protoplastes (0,1 g de cellulase, 0,03 g dans 10 ml macerozym F-PIN). Incuber la solution à 55 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir à température ambiante. Ajouter 100 ul de 10% de SAB à 10 ml de solution. </li></ol></li><li> Isolement de protoplastes <ol><li> Placez une feuille infiltré dans une boîte de Pétri et ajouter la solution d&#39;enzyme fraîche. Utilisez une nouvelle lame de rasoir pour couper la feuille en environ 0,5 cm 2 morceaux. Transférer les feuilles-pièces avec la solution d&#39;enzyme dans un flacon sous vide et l&#39;infiltration sous vide s&#39;infiltrer pendant environ 20 secondes jusqu&#39;à ce que des bulles d&#39;air se dégagent à partir des feuilles (aspirateur de libération très attentivement). </li><li> Agiter le flacon pendant 90 min à 40 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Relâchez protoplastes par agitation pendant 1 min à 90 min. Filtrer la solution à travers de la gaze (100 pM) dans un tube à centrifugation de 15 ml (à fond rond). </li&gt; <li> Superposer la solution de protoplastes avec 2 ml de tampon F-PCN et centrifuger pendant 10 min à 70 xg (accélération et de décélération lente) à température ambiante. </li><li> Protoplastes intacts s&#39;accumulent à l&#39;interface de la solution d&#39;enzyme et de F-PCN. Prenez un large orifice 1 pointe ml de pipette pour transférer les protoplastes intacts dans un tube de centrifugeuse frais et remplir avec du tampon W5. Centrifuger pendant 2 min à 100 xg (accélération et décélération lente) pour sédimenter les protoplastes. </li><li> Retirer le surnageant avec précaution à l&#39;aide d&#39;une pipette et remettre en suspension le culot dans environ 200 ul de tampon de W5, en fonction de la quantité de protoplastes. </li><li> Toujours utiliser des embouts d&#39;orifice large pour éviter la rupture de protoplastes intacts. </li></ol></li></ol> 4. Balayage laser <ol><li> Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Coller deux petites bandes de mastic autour d&#39;une lame de microscope (2 cm d&#39;intervalle). Placer 20 ul de la solution de protoplastes entre les bandes et placer soigneusement un couvercle en verresur le dessus. Les bandes d&#39;étanchéité assurez-vous que les protoplastes ne sont pas écrasés par le couvercle en verre. </li><li> Pour les échantillons de feuilles découpées au total un morceau de 1 cm de la feuille et le placer sur une lame de microscope avec le côté inférieur de la feuille tournée vers le haut. Ajouter environ 30 pi H 2 O, placer un couvercle en verre sur le dessus et le fixer solidement avec du ruban adhésif sur les deux côtés. </li></ol></li><li> Paramètres d&#39;imagerie et microscope confocal <ol><li> L&#39;imagerie est réalisée avec un microscope confocal à balayage laser microscope de Leica, Type: TCS SP5. Pour grossissement utiliser un objectif (HCX PL APO CS) d&#39;une magnitude de 63X avec le glycérol comme moyen d&#39;imagerie. Réglez l&#39;ouverture numérique de 1.3. Utilisez le logiciel Leica Application Suite / avancée de fluorescence pour l&#39;évaluation (voir données supplémentaires S1). </li><li> Réglez le laser argon à 30% et la puissance du laser à 488 nm à une intensité de 18% pour surveiller le signal BiFC reconstitué à 515 nm et définir un débit d&#39;émission de détecteur de PMT 495-550. </li&gt; <li> Pour surveiller la chlorophylle autofluorescence mis une seconde bande passante d&#39;émission de détecteur de PMT 650-705. </li><li> Pour surveiller le signal mCherry utiliser le laser HeNe 561, régler l&#39;intensité de laser de 561 à 18% et la largeur de bande d&#39;émission d&#39;un troisième détecteur de PMT 587-610. </li><li> Assurez-vous que les photos de tous les canaux de détection PMT sont prises avec les mêmes réglages de gain (gain doit être compris entre 800-900 à exclure les signaux de fond). </li><li> Prenez des photos dans un format largeur / hauteur de 1024 x 1024 pixels avec une vitesse de balayage de 100 Hz. </li><li> Pour Z-empilements utilisent une distance maximale de 0,5 um entre chaque pile. </li></ol></li></ol>

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	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li><li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay.">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ABCG+transporters,+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids,+dimerize+in+different+combinations.">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li><li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein.">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li><li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li><li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64.">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li><li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis.">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li><li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon.">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Lors de la planification d&#39;une expérience BiFC plusieurs points doivent être considérés. Bien qu&#39;aucune information structurale sur les protéines d&#39;intérêt est requise, la topologie doit être connu lorsque l&#39;on travaille avec des protéines de la membrane couvrant. Les protéines fluorescentes doivent se trouver dans le même compartiment sous-cellulaire ou orientés dans le même côté d&#39;une membrane pour permettre l&#39;interaction. Naturellement, lorsque l&#39;on analyse les protéines qu...

L&#39;étude de la formation de complexes de protéines et de leur localisation dans les cellules végétales in vivo est essentielle pour étudier les réseaux cellulaires, de signalisation et les processus métaboliques. BiFC permet la visualisation des interactions protéine-protéine dans leur environnement naturel directement à l&#39;intérieur de la cellule de plante vivante 1-5. Dans le BiFC approcher la complémentation de deux fragments N-et C-terminaux d&#39;une protéine non fluorescentes plomb fluorescent pour une protéine fluorescente reconstitué. Des fragments de nombreuses protéines fluorescentes différentes ont été utilisées pour détecter les interactions entre protéines, par exemple la protéine fluorescente verte (GFP) de la chromophore qui est chimiquement formée par trois résidus distincts 6. Les protéines fluorescentes peuvent être réduites de moitié dans une boucle ou ß-brin pour donner les deux fragments non fluorescentes qui peuvent être fusionnés aux deux protéines d&#39;intérêt. Le dosage peut être utilisé pour détecter des interactions dans toute compartme subcellulairent dans un organisme ou des cellules en croissance en milieu aérobie qui peut être génétiquement modifiée pour exprimer les protéines de fusion. Si les deux protéines sont en proximité étroite à l&#39;intérieur de la cellule, la fluorescence est reconstitué et peut être surveillée par microscopie sans addition de fluorophores exogènes ou des colorants 3. Le tabac (Nicotiana benthamiana) s&#39;est avéré être un organisme modèle commode pour visualiser l&#39;interaction des protéines de plantes, étant donné que les protéines peuvent facilement être exprimées en utilisant une transformation médiée par Agrobacterium de feuilles de tabac avec les constructions générées. Agrobactéries utilisent un plasmide Ti dite (tumeur induisant) codant pour des enzymes qui interviennent dans la transduction du gène d&#39;intérêt dans des cellules végétales. BiFC est bien applicable pour solubles ainsi que pour les protéines de la membrane au sein de tous les compartiments cellulaires et a été utilisé avec succès au cours des dernières années pour identifier des protéines qui interagissent in vivo, ainsi que pour analyser les sites d&#39;interactiondans les protéines 7-9. Lors de l&#39;expression des gènes introduits, l&#39;interaction des protéines fluorescentes peuvent être visualisées directement en feuille, qui est approprié pour des structures cellulaires plus gros, tels que le reticulum endoplasmique (ER), la membrane plasmatique ou les chloroplastes. Toutefois, pour contrôler la localisation dans des structures plus fines, par exemple, l&#39;enveloppe des chloroplastes, il est souhaitable de visualiser la fluorescence dans des protoplastes isolés à partir de feuilles de tabac transformées. Un ensemble de vecteurs BiFC contenant soit un C-terminal ou un marqueur fluorescent N-terminale doit être utilisée pour l&#39;approche BiFC dans des plantes 10. Le protocole décrit de la suite a été utilisé pour étudier l&#39;interaction de cytosolique protéine de choc thermique 90 (HSP90) avec la répétition de tetratricopeptide (TPR) de domaine contenant des protéines d&#39;amarrage Toc64 et AtTPR7 résidant dans l&#39;enveloppe extérieure du chloroplaste et le réticulum endoplasmique, respectivement 11-13. A cet effet, HSP90 a été fusionné à la Ctpartie de erminal SCFP (SCFP C). La balise était N-terminale fusionnée à la protéine chaperon pour assurer l&#39;accessibilité du motif C-terminal MEEVD liaison de HSP90 pour serrer de type domaines TPR. En parallèle, la partie N-terminale de Vénus (Venus N) a été fusionné aux domaines cytosoliques du domaine TPR contenant des protéines d&#39;amarrage Toc64 et AtTPR7, respectivement. Comme témoin négatif nous avons cloné la partie C-terminale soluble SCFP C uniquement qui réside dans le cytosol et est donc un contrôle approprié. Les marqueurs fluorescents de protéines étudiées doivent faire face à la même compartiment cellulaire pour permettre proximité et ainsi la reconstitution du signal fluorescent. Pour déterminer la localisation du signal fluorescent reconstitué une protéine marqueur fusionnée à une étiquette fluorescente différente peut être co-transformée à démontrer la localisation subcellulaire de l&#39;interaction. Une protéine servant de marqueur ER fusionnée à mCherrry a été transformé simultanément à l&#39;cas de l&#39;ER situé AtTPR7 14. L&#39;auto-fluorescence de la chlorophylle a servi de marqueur chloroplaste en cas de Toc64. Par cela, non seulement l&#39;interaction in vivo de Toc64 AtTPR7 et, respectivement, avec le chaperon HSP90 cytosolique peut être surveillée directement dans les feuilles de tabac, mais aussi la localisation subcellulaire de l&#39;interaction peut être étudiée. BiFC est bien adapté comme une approche complémentaire à d&#39;autres méthodes qui étudient les interactions protéine-protéine. Par rapport aux co-immunoprécipitation ou in vitro des expériences d&#39;excursion basse, par exemple, pas d&#39;anticorps spécifiques doivent être disponibles pour des protéines d&#39;intérêt, et les protéines n&#39;ont pas à être exprimé par recombinaison in vitro, ce qui peut être difficile, en particulier pour les protéines de la membrane. De plus, aussi les interactions transitoires peuvent être surveillés à l&#39;aide BiFC, étant donné que les protéines sont capturées par l&#39;interaction des marqueurs fluorescents fusionnées 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

De nombreuses protéines interagissent avec d&#39;autres protéines de façon transitoire ou sont intégrés dans des complexes multi-protéiques de remplir leur fonction biologique. Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) est une méthode in vivo de surveiller ces interactions dans les cellules végétales. Dans le protocole présenté les protéines candidates sont fusionnées à l&#39;enquête moitiés complémentaires de protéines fluorescentes et les produits d&#39;assemblage respectifs sont introduits dans des cellules végétales par transformation médiée par Agrobacterium. Par la suite, les protéines sont exprimées de manière transitoire dans les feuilles de tabac et les signaux fluorescents restaurées peuvent être détectés avec un microscope confocal à balayage laser dans les cellules intactes. Ceci permet non seulement la visualisation de l&#39;interaction elle-même, mais aussi la localisation subcellulaire des complexes de protéines peut être déterminée. A cet effet, des gènes marqueurs contenant un marqueur fluorescent peuvent être co-exprimés avec les constructions BiFC, visualisant ainsi des structures cellulaires telles que la til reticulum endoplasmique, les mitochondries, l&#39;appareil de Golgi ou la membrane plasmique. Le signal de fluorescence peut être contrôlée soit directement dans les cellules épidermiques des feuilles ou dans des protoplastes isolés, qui peuvent être facilement isolés à partir des feuilles de tabac transformées. BiFC est idéal pour étudier les interactions protéine-protéine dans leur milieu naturel au sein de la cellule vivante. Cependant, il doit être considéré que l&#39;expression doit être entraînée par des promoteurs forts et que les partenaires d&#39;interaction sont modifiées en raison de la fusion des balises relativement importantes de fluorescence, qui pourraient interférer avec le mécanisme d&#39;interaction. Néanmoins, BiFC est une excellente approche complémentaire à d&#39;autres méthodes couramment appliquées enquête interactions protéine-protéine, comme coimmunoprécipitation, essais in vitro déroulants ou des expériences de levure double hybride.

Dans cet exemple, nous avons utilisé la méthode BiFC pour surveiller l&#39;interaction entre le chaperon moléculaire de HSP90 cytosolique des protéines membranaires amarrage AtTPR7 et Toc64. AtTPR7 fait partie du translocon Sec et interagit avec les chaperons cytosoliques, qui délivrent éventuellement préprotéines sécrétoires pour la translocation post-traductionnelle de la membrane du RE. De même, Toc64 à l&#39;enveloppe extérieure chloroplaste agit dans l&#39;importation post-traductionnelle en recevant H...

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Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d&#39;interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K vues.  Ludwig-Maximilians-Universität, München.  La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines. 

Vidéo: Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Recherche

Biologie

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Électrofusion cellulaire visualisé par microscopie à fluorescence

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imagerie interactions protéine-protéine In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...