Les auteurs remercient les membres du groupe de Sharon pour leur examen critique, et pour leur contribution au manuscrit. Nous sommes reconnaissants de l&#39;appui des programmes et des Morasha Bikura, l&#39;Israel Science Foundation (Grant 378/08 et n ° 1823-1807), Josef Cohn Minerva Centre de recherche biomembrane, la famille Chais Fellows Program pour les nouveaux chercheurs, l&#39;Abraham et Sonia Rochlin Fondation Trust Wolfson famille de bienfaisance, le Helen et Milton A. Kimmelman Center for Structure biomoléculaire et de l&#39;Assemblée; la succession de Shlomo et Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, et Karen Siem, Royaume-Uni.

<ol>
	<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility-mass+spectrometry+analysis+of+large+proteincomplexes.">Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes.</a> Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).</li><li>Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+wave+ion+mobility+mass+spectrometry+studies+of+protein+structure:+biological+significance+and+comparison+with+X-ray+crystallography+and+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+measurements.">Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).</li><li>Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+drift+time+measurements+from+travelling+wave+ion+mobility+spectrometry-mass+spectrometry+studies.">Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies.</a> Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).</li><li>Leary, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+measuring+conformation+of+solvent-disrupted+protein+subunits+using+T-WAVE+ion+mobility+MS:+an+investigation+into+eukaryotic+initiation+factors.">Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+stoichiometry+and+conformational+changes+in+the+first+step+of+the+P22+tail+assembly.">Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly.</a> J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).</li><li>Pukala, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multiprotein+assemblies+determined+using+restraints+from+gas-phase+measurements.">Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements.</a> Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperonin+complexes+monitored+by+ion+mobility+mass+spectrometry.">Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry.</a> J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).</li><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+macromolecular+protein+rings+in+the+absence+of+bulk+water.">Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water.</a> Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).</li><li>Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+native+proteins+are+retained+in+vacuum.">Aspects of native proteins are retained in vacuum.</a> Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).</li><li>Giles, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+travelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide.">Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).</li><li>McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+measurements+of+increased+accuracy+resolve+heterogeneous+populations+of+intact+ribosomes.">Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes.</a> J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).</li><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility-mass+spectrometry+reveals+long-lived,+unfolded+intermediates+in+the+dissociation+of+protein+complexes.">Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+660+peptide+ion+cross+sections:+use+of+intrinsic+size+parameters+for+bona+fide+predictions+of+cross+sections.">A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).</li><li>Mesleh, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+information+from+ion+mobility+measurements:+effects+of+the+long-range+potential.">Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential.</a> J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).</li><li>Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exact+hard-spheres+scattering+model+for+the+mobilities+of+polyatomic+ions.">An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions.</a> Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).</li></ol>

Le protocole décrit ici permet de définir la section de collision des protéines ou des complexes de protéines avec une structure en trois dimensions inconnues, dans le but de fournir des informations sur leur forme générale, l&#39;emballage sous-unité et de la topologie. À cette fin, une fois les valeurs de collision section transversale sont représentés, il est nécessaire de convertir ces valeurs pour plus de détails structuraux. Ce processus exige des efforts supplémentaires d&#39;expérimentation ainsi que l&#39;analyse informatique, qui sont brièvement discutées ci-dessous. Pour commencer, il est recommandé d&#39;analyser les protéines ou des complexes de protéines avec des structures connues. Ces mesures peuvent fournir un contrôle de la qualité de la méthodologie utile et permettra évaluation de l&#39;exactitude des paramètres d&#39;acquisition en comparant les valeurs théoriques et mesurées Ω. La théorie Croix zones sectionnelle peut calculer la structure cristalline coordonne utilisant les MOBCAL 15,16 logiciel qui sont une source du logiciel open FORTRAN base permettent édition codes conformément aux besoins conducteur. Pour exécuter ces calculs, il est nécessaire de modifier le programme de telle sorte que le nombre de calculs itératifs effectués par la structure d&#39;entrée est augmentée et que les fichiers contenant de coordonner grand nombre d&#39;atomes sont acceptés 1. Une stratégie de GI-MS pour la définition des arrangements topologique de sous-unités au sein des assemblées multicomposant a été récemment proposé 4,6. La méthode implique la surveillance des voies de dissociation des assemblages de protéines pour de plus petits composants. Cette dissociation est obtenue par un ajustement des conditions contrôlées en phase solution, qui donne lieu à une répartition des sous-complexes reflet de la «building blocks» des assemblées. La mesure simultanée des valeurs de Ω à la fois des complexes intacts et le démontage des produits génère des contraintes structurelles qui sont ensuite utilisés pour calculer les modèles topologiques des complexes protéiques. L&#39;hypothèse de base de cette méthodologie est que le sous-complexes générées conservent leur native-like confirmations, et en effet des études récentes ont démontré que la structure en solution des produits de démontage est maintenue et aucun réarrangement majeur dans les deux phases de solution ou de gaz ont eu lieu 4,6. La dernière étape dans la cession de la structure quaternaire des protéines à des ions en phase gazeuse complexe montage des valeurs de collision section transversale de modèles par ordinateur. Approches de modélisation sont employées dans le but d&#39;explorer les différents arrangements possibles topologique de sous-unités et de leurs valeurs dans Ω silico sont calculés et comparés à ceux expérimentaux. Actuellement, seuls quelques approches de calcul sont utilisées, comme le spheretype grossiers méthode qui se rapproche du diamètre de 1,8 unités. Dans l&#39;ensemble, ce domaine est encore à ses débuts et le développement est nécessaire pour faire de cette approche générique et applicable à un large éventail de complexes.

t-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis

De mobilité ionique (IM) est une méthode qui mesure le temps pris pour un ion de voyager à travers une cellule de pression sous l&#39;influence d&#39;un champ électrique faible. La vitesse avec laquelle les ions traversent la région de dérive dépend de leur taille: les gros ions connaîtront un plus grand nombre de collisions avec le gaz inerte de fond (généralement N 2) et donc voyager plus lentement à travers le dispositif de messagerie instantanée que ceux des ions qui composent une petite section transversale. En général, le temps qu&#39;il faut pour les ions de migrer si la phase de gaz dense qui les sépare, selon leur collision section transversale (Ω). Récemment, la spectrométrie de IM a été couplée à la spectrométrie de masse et un voyage-onde (onde T) Synapt mobilité ionique du spectromètre de masse (IM-MS) a été libéré. Intégration spectrométrie de masse avec la mobilité des ions permet une dimension supplémentaire de séparation des échantillons et la définition, ce qui donne un spectre en trois dimensions (masse à temps de charge, l&#39;intensité et la dérive). Cette technique de séparation permet le chevauchement spectral à diminuer, et permet la résolution des complexes hétérogènes avec une masse très semblable, ou masse-charge des ratios, mais les temps de dérive différent. Par ailleurs, les mesures de temps de dérive de fournir une couche importante d&#39;informations structurelles, comme Ω est liée à la forme générale et la topologie de l&#39;ion. La corrélation entre les valeurs mesurées du temps de dérive et Ω est calculée en utilisant une courbe de calibration générée à partir des protéines calibrant avec défini des sections 1. La puissance de l&#39;approche MI-MS réside dans sa capacité à définir l&#39;emballage sous-unité et la forme globale des assemblages de protéines à des concentrations micromolaires, et proche des conditions physiologiques 1. Plusieurs études récentes de messagerie instantanée à la fois des protéines individuelles 2,3 et complexes protéiques non-covalentes 4-9, démontré avec succès que la structure des protéines quaternaires est maintenue dans la phase gazeuse, et a souligné le potentiel de cette approche dans l&#39;étude des assemblages protéiques de géométrie inconnue . Ici, nous fournir une description détaillée de l&#39;IMS-MS analyse des complexes protéiques en utilisant les Synapt (quadripôle-Ion Mobility-Time-of-Flight) instrument de HDMS (Waters Ltd; le seul commerciales IM-MS instruments actuellement disponibles) 10. Nous décrivons les étapes d&#39;optimisation de base, l&#39;étalonnage de la collision des sections, et les méthodes de traitement des données et leur interprétation. L&#39;étape finale du protocole décrit les méthodes de calcul des valeurs théoriques Ω. Globalement, le protocole ne vise pas à couvrir tous les aspects de la GI-MS caractérisation des assemblages protéiques, mais plutôt son objectif est de présenter les aspects pratiques de la méthode à de nouveaux chercheurs dans le domaine.

Watch this Scientific Journal Video about T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis at JoVE.com

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

De mobilité ionique et spectrométrie de masse est une société émergente en phase gazeuse technologie qui sépare les ions, basée sur leur collision section transversale et la masse. La méthode fournit des informations tridimensionnelles sur la topologie et la forme générale de complexes protéiques. Ici, nous présentons une procédure de base pour réglage de l&#39;appareil et l&#39;optimisation, l&#39;étalonnage du temps de dérive, et l&#39;interprétation des données.

L&#39;onde T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour l&#39;analyse de protéines complexes

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

t-wave-ion-mobility-mass-spectrometry-basic-experimental-procedures

Research

JoVE Journal

Biology

24.3K vues.  Weizmann Institute of Science. De mobilité ionique et spectrométrie de masse est une société émergente en phase gazeuse technologie qui sépare les ions, basée sur leur collision section transversale et la masse. La méthode fournit des informations tridimensionnelles sur la topologie et la forme générale de complexes protéiques. Ici, nous présentons une procédure de base pour réglage de l'appareil et l'optimisation, l'étalonnage du temps de dérive, et l'interprétation de...