Die Autoren danken der Sharon Gruppenmitglieder für die kritische Durchsicht und für ihre Beiträge zu dem Manuskript. Wir sind dankbar für die Unterstützung der Morasha und Bikura Programme, die Israel Science Foundation (Grant Nr. 1823-1807 und 378/08), das Josef Cohn Minerva Center for Biomembrane Research, die Chais Familie Fellows Program für New Scientists, die Abraham und Sonia Rochlin Stiftung, die Familie Wolfson Charitable Trust, die Helen und Milton A. Kimmelman Zentrums für Biomolekulare Struktur und Montage; dem Nachlass von Shlomo und Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, und Karen Siem, UK.

<ol>
	<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility-mass+spectrometry+analysis+of+large+proteincomplexes.">Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes.</a> Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).</li><li>Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+wave+ion+mobility+mass+spectrometry+studies+of+protein+structure:+biological+significance+and+comparison+with+X-ray+crystallography+and+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+measurements.">Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).</li><li>Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+drift+time+measurements+from+travelling+wave+ion+mobility+spectrometry-mass+spectrometry+studies.">Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies.</a> Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).</li><li>Leary, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+measuring+conformation+of+solvent-disrupted+protein+subunits+using+T-WAVE+ion+mobility+MS:+an+investigation+into+eukaryotic+initiation+factors.">Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+stoichiometry+and+conformational+changes+in+the+first+step+of+the+P22+tail+assembly.">Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly.</a> J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).</li><li>Pukala, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multiprotein+assemblies+determined+using+restraints+from+gas-phase+measurements.">Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements.</a> Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperonin+complexes+monitored+by+ion+mobility+mass+spectrometry.">Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry.</a> J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).</li><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+macromolecular+protein+rings+in+the+absence+of+bulk+water.">Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water.</a> Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).</li><li>Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+native+proteins+are+retained+in+vacuum.">Aspects of native proteins are retained in vacuum.</a> Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).</li><li>Giles, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+travelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide.">Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).</li><li>McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+measurements+of+increased+accuracy+resolve+heterogeneous+populations+of+intact+ribosomes.">Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes.</a> J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).</li><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility-mass+spectrometry+reveals+long-lived,+unfolded+intermediates+in+the+dissociation+of+protein+complexes.">Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+660+peptide+ion+cross+sections:+use+of+intrinsic+size+parameters+for+bona+fide+predictions+of+cross+sections.">A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).</li><li>Mesleh, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+information+from+ion+mobility+measurements:+effects+of+the+long-range+potential.">Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential.</a> J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).</li><li>Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exact+hard-spheres+scattering+model+for+the+mobilities+of+polyatomic+ions.">An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions.</a> Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).</li></ol>

Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht es, die Kollision Querschnitt von Proteinen oder Protein-Komplexen mit einem unbekannten dreidimensionale Struktur zu definieren, mit dem Ziel der Bereitstellung von Informationen über ihre gesamte Form, Untereinheit Verpackung und Topologie. Zu diesem Zweck einmal Stoßquerschnitt Werte sind dargestellt, ist es notwendig, diese Werte zu strukturellen Details zu konvertieren. Dieser Prozess erfordert zusätzliche experimentelle Bemühungen sowie computergestützte Analyse, die kurz diskutiert werden unten. Zunächst ist es empfehlenswert, Proteine ​​oder Protein-Komplexen mit bekannten Strukturen zu analysieren. Diese Messungen können eine nützliche Kontrolle der Qualität der Methodik und Genauigkeit Beurteilung des Erwerbs Parameter durch den Vergleich theoretischer und gemessener Ω-Werte zu ermöglichen. Die theoretische Querschnittsflächen kann aus der Kristallstruktur berechnet werden koordiniert mit der MOBCAL 15,16 Software, die eine Open-Source-basierte Software ermöglicht FORTRAN Code-Bearbeitung nach dem Operator benötigt wird. Für den Betrieb solcher Berechnungen ist es erforderlich, das Programm so, dass die Zahl der iterative Berechnungen pro Input-Struktur durchgeführt erhöht wird und dass die Akten koordinieren, die große Zahl der Atome sind 1 akzeptiert zu ändern. Ein IM-MS-Strategie für die Definition von topologischen Anordnung der Untereinheiten innerhalb Mehrkomponenten-Baugruppen wurde vor kurzem 4,6 vorgeschlagen. Das Verfahren beinhaltet die Überwachung der Dissoziationspfade von Protein-Baugruppen zu kleineren Komponenten. Diese Dissoziation wird durch gezielte Einstellung der Lösungsphase Bedingungen, die Anlass zu einer Verteilung von Subkomplexe reflektiert die &quot;Bausteine&quot; der Baugruppen erreicht. Die gleichzeitige Messung von Ω-Werte sowohl des intakten komplexen Auf-und Abbau-Produkte erzeugt strukturelle Beschränkungen, die dann für die Berechnung der topologischen Modelle der Protein-Komplexen eingesetzt. Die Grundannahme dieser Methode ist, dass die erzeugten Subkomplexe ihrer Muttersprache wie Bestätigungen erhalten, und zwar neuere Studien haben gezeigt, dass die Lösung Struktur der Demontage Produkte erhalten bleibt und keine größeren Umlagerung entweder in Lösung oder Gasphase haben 4,6 aufgetreten. Der letzte Schritt bei der Zuordnung der Quartärstruktur auf Gas-Phase-Protein-Komplex-Ionen passt die Kollision Querschnitt Werte computergenerierte Modelle. Modeling Ansätze eingesetzt, um die verschiedenen möglichen topologischen Anordnung der Untereinheiten und ihre in-silico-Ω-Werte berechnet und verglichen mit den experimentellen erkunden. Derzeit ist nur ein paar computergestützte Ansätze verwendet werden, wie die spheretype grobkörnigen Methode, die den Durchmesser der Untereinheiten 1,8 annähert. Im Großen und Ganzen ist dieses Feld noch in den frühen Jahren und ein weiterer Ausbau erforderlich, um diesen Ansatz generisch und für eine breite Palette von Komplexen.

t-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis

Ionen-Mobilitäts-(IM) ist eine Methode, die Zeit für ein Ion durch eine unter Druck stehende Zelle unter dem Einfluss eines schwachen elektrischen Feldes Reise Maßnahmen ergriffen. Die Geschwindigkeit, mit der die Ionen durchqueren die Driftregion hängt von ihrer Größe: große Ionen wird eine größere Zahl von Kollisionen mit dem Hintergrund Inertgas (meist N 2) Erfahrung und damit mehr reisen langsam durch die IM-Gerät als die Ionen, die eine kleinere umfassen Querschnitt. Im Allgemeinen ist die Zeit, die für die Ionen zu wandern wenn die dichten Gasphase trennt sie, nach ihrer Kollision Querschnitt (Ω). Kürzlich wurde IM-Spektrometrie mit der Massenspektrometrie und ein travelling-wave (T-Welle) SYNAPT Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometer (IM-MS) veröffentlicht wurde gekoppelt. Die Integration der Massenspektrometrie mit Ionenbeweglichkeit ermöglicht eine zusätzliche Dimension der Probe Trennung und Definition, was eine dreidimensionale Spektrum (Masse zu Ladung, Intensität und Drift-Zeit). Diese Trennung ermöglicht es den spektralen Überlappung zu verringern, und ermöglicht Auflösung von heterogenen Komplexe mit sehr ähnlichen Masse oder Masse-Ladungs-Verhältnis, aber unterschiedliche Drift Zeiten. Darüber hinaus bieten die Driftzeit Messungen eine wichtige Schicht von strukturellen Informationen, wie Ω um die Form und die Topologie des Ions verbunden ist. Die Korrelation zwischen der gemessenen Driftzeit Werte und Ω berechnet unter Verwendung einer Eichkurve aus Kalibrierlösung Proteine ​​mit definierten Querschnitten 1 erzeugt. Die Macht der IM-MS Ansatzes liegt in seiner Fähigkeit, die Untereinheit Verpackung und allgemeine Form von Protein-Baugruppen in mikromolaren Konzentrationen zu definieren, und annähernd physiologischen Bedingungen 1. Mehrere neuere Studien IM sowohl einzelner Proteine ​​2,3 und nicht-kovalente Protein-Komplexe 4-9, erfolgreich demonstriert, dass Protein Quartärstruktur in der Gasphase erhalten bleibt, und wies auf das Potenzial dieses Ansatzes in der Untersuchung von Protein-Baugruppen unbekannter Geometrie . Hier bieten wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung der IMS-MS-Analyse von Protein-Komplexen mit dem SYNAPT (Quadrupol-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS Instrument (Waters Ltd; der einzige kommerzielle IM-MS-Gerät derzeit) 10. Wir beschreiben die grundlegenden Optimierung Schritte, die Kalibrierung von Stoßquerschnitte und Methoden für die Datenverarbeitung und-interpretation. Der letzte Schritt des Protokolls werden Methoden zur Berechnung der theoretischen Ω Werte. Insgesamt hat das Protokoll nicht versuchen, jeden Aspekt des IM-MS Charakterisierung von Protein-Baugruppen decken, sondern es ist ihr Ziel, die praktischen Aspekte der Methode, um neue Forscher auf dem Gebiet einzuführen.

Watch this Scientific Journal Video about T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis at JoVE.com

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie ist eine aufstrebende Gas-Phasen-Technologie, die Ionen trennt, auf der Grundlage ihrer Kollision Querschnitt und Masse. Die Methode liefert dreidimensionale Informationen über die gesamte Topologie und Form der Protein-Komplexen. Hier skizzieren wir ein grundlegendes Verfahren für die Geräteeinstellung und Optimierung, Kalibrierung der Drift Zeiten, und die Interpretation der Daten.

T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

t-wave-ion-mobility-mass-spectrometry-basic-experimental-procedures

Research

JoVE Journal

Biology

24.3K Aufrufe.  Weizmann Institute of Science. Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie ist eine aufstrebende Gas-Phasen-Technologie, die Ionen trennt, auf der Grundlage ihrer Kollision Querschnitt und Masse. Die Methode liefert dreidimensionale Informationen über die gesamte Topologie und Form der Protein-Komplexen. Hier skizzieren wir ein grundlegendes Verfahren für die Geräteeinstellung und Optimierung, Kalibrierung der Drift Zeiten, und die Interpretation der Daten.