Os autores agradecem os membros do grupo Sharon para a sua revisão crítica, e por suas contribuições ao manuscrito. Estamos gratos pelo apoio dos Programas Morasha e Bikura, a Israel Science Foundation (Grant n. º s 378/08 e 1823-1807), o Josef Cohn Minerva Center for Research biomembrana, a Família Chais Fellows Program para novos cientistas, o Abraham e Sonia Rochlin Foundation, o Family Trust Wolfson Charitable, a Helen e Milton A. Kimmelman Centro de Estrutura Biomolecular e Montagem; o espólio de Shlomo e Beirzwinsky Sabine; Meil ​​de Botton Aynsley, e Karen Siem, Reino Unido.

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	<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility-mass+spectrometry+analysis+of+large+proteincomplexes.">Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes.</a> Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).</li><li>Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+wave+ion+mobility+mass+spectrometry+studies+of+protein+structure:+biological+significance+and+comparison+with+X-ray+crystallography+and+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+measurements.">Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).</li><li>Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+drift+time+measurements+from+travelling+wave+ion+mobility+spectrometry-mass+spectrometry+studies.">Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies.</a> Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).</li><li>Leary, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+measuring+conformation+of+solvent-disrupted+protein+subunits+using+T-WAVE+ion+mobility+MS:+an+investigation+into+eukaryotic+initiation+factors.">Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+stoichiometry+and+conformational+changes+in+the+first+step+of+the+P22+tail+assembly.">Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly.</a> J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).</li><li>Pukala, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multiprotein+assemblies+determined+using+restraints+from+gas-phase+measurements.">Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements.</a> Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperonin+complexes+monitored+by+ion+mobility+mass+spectrometry.">Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry.</a> J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).</li><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+macromolecular+protein+rings+in+the+absence+of+bulk+water.">Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water.</a> Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).</li><li>Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+native+proteins+are+retained+in+vacuum.">Aspects of native proteins are retained in vacuum.</a> Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).</li><li>Giles, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+travelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide.">Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).</li><li>McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+measurements+of+increased+accuracy+resolve+heterogeneous+populations+of+intact+ribosomes.">Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes.</a> J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).</li><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility-mass+spectrometry+reveals+long-lived,+unfolded+intermediates+in+the+dissociation+of+protein+complexes.">Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+660+peptide+ion+cross+sections:+use+of+intrinsic+size+parameters+for+bona+fide+predictions+of+cross+sections.">A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).</li><li>Mesleh, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+information+from+ion+mobility+measurements:+effects+of+the+long-range+potential.">Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential.</a> J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).</li><li>Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exact+hard-spheres+scattering+model+for+the+mobilities+of+polyatomic+ions.">An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions.</a> Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui descrito permite definir a seção transversal de colisão de proteínas ou complexos de proteínas com uma estrutura de três desconhecidos dimensional, com o objetivo de fornecer informações sobre sua forma geral, embalagem subunidade e topologia. Para este efeito, uma vez valores colisão seção transversal são retratados é necessário converter esses valores para detalhes estruturais. Este processo requer esforços adicionais experimental bem como a análise computacional, que são brevemente discutidos abaixo. Para começar, recomenda-se a análise de proteínas ou complexos de proteínas com estruturas conhecidas. Estas medidas podem proporcionar um controle de qualidade útil da metodologia e permitirá avaliação da acurácia dos parâmetros de aquisição, comparando os valores teóricos e medidos Ω. O teórico áreas das secções transversais podem ser calculadas a partir da estrutura de cristal coordenadas usando o software MOBCAL 15,16, que é um software de código aberto baseado em FORTRAN que permite a edição de código de acordo com as necessidades do operador. Para a execução de tais cálculos é necessário modificar o programa de tal forma que o número de cálculos iterativos realizados por estrutura de entrada é maior e que os arquivos de coordenadas contendo grande número de átomos são aceitos 1. Uma estratégia IM-MS para a definição de arranjos topológicos de subunidades dentro multicomponentes montagens propôs recentemente 4,6. O método envolve o monitoramento de vias dissociação de grupos de proteínas para os componentes menores. Essa dissociação é conseguido através do ajuste das condições controladas fase de solução, que dá origem a uma distribuição de subcomplexes reflexivo da &quot;blocos de construção&quot; das assembléias. A medição simultânea de valores Ω de ambos os complexos intacta a desmontagem e produtos gera restrições estruturais que são então utilizados para calcular os modelos topológicos dos complexos de proteína. O pressuposto básico subjacente a esta metodologia é que o subcomplexes gerada reter seus nativos como confirmações, e na verdade estudos recentes têm demonstrado que a estrutura de solução dos produtos desmontagem é mantida e nenhum rearranjo importante em qualquer solução ou fases de gás têm ocorrido 4,6. O último passo na atribuição de estrutura quaternária de íons em fase gasosa em proteínas complexas é adequado a colisão valores seção transversal de modelos gerados por computador. Abordagens de modelagem são empregadas, a fim de explorar as diferentes possíveis arranjos topológicos de subunidades e seus valores em silico Ω são calculados e comparados com os experimentais. Atualmente, apenas algumas abordagens computacionais são usados, como o método de granulação grossa spheretype que se aproxima o diâmetro de 1,8 subunidades. No geral, este campo ainda está em seus primeiros anos e desenvolvimento é necessário para fazer essa abordagem genérica e aplicável a uma ampla gama de complexos.

t-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis

De mobilidade iônica (IM) é um método que mede o tempo necessário para um íon de viajar através de uma célula pressurizada sob a influência de um campo elétrico fraco. A velocidade pela qual os íons atravessam a região drift depende de seu tamanho: íons grandes vão experimentar um maior número de colisões com o gás de fundo inerte (geralmente N 2) e, assim, viajar mais devagar através do dispositivo de mensagens instantâneas do que os íons que compõem um menor cross-section. Em geral, o tempo que leva para os íons de migrar embora a fase de gás denso separa-los, de acordo com sua colisão transversal (Ω). Recentemente, a espectrometria de IM foi acoplado com espectrometria de massa e uma viagem-wave (onda T) Synapt de mobilidade iônica espectrômetro de massa (IM-MS) foi lançado. Integração de espectrometria de massa com mobilidade de íons permite uma dimensão extra de separação e definição da amostra, produzindo um espectro tridimensional (em massa para o tempo de carga, intensidade e drift). Esta técnica permite a separação de sobreposição espectral a diminuir, e permite a resolução de complexos heterogêneos com massa muito semelhante, ou massa-carga índices, mas os tempos drift diferentes. Além disso, as medidas de tempo deriva fornecer uma importante camada de informações estruturais, como Ω está relacionado com a forma geral e topologia do íon. A correlação entre os valores medidos drift tempo e Ω é calculada usando uma curva de calibração gerada a partir de proteínas de calibração definido com seções transversais 1. O poder da abordagem IM-MS reside na sua capacidade de definir a embalagem subunidade e forma geral das assembleias de proteína em concentrações micromolar, e quase fisiológica condições 1. Vários estudos recentes IM de ambas as proteínas individuais 2,3 e complexos não-covalente de proteínas 4-9, conseguiu demonstrar que a estrutura da proteína quaternária é mantida na fase gasosa, e destacou o potencial dessa abordagem no estudo dos conjuntos de proteínas de geometria desconhecida . Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do IMS-MS análise de complexos de proteínas usando o Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrumento (Waters Ltd; o único instrumento IM-MS comerciais disponíveis atualmente) 10. Descrevemos os passos básicos de otimização, a calibração de colisão seções transversais, e métodos de processamento de dados e interpretação. A etapa final do protocolo discute métodos de cálculo dos valores teóricos Ω. No geral, o protocolo não tenta cobrir todos os aspectos do IM-MS caracterização de conjuntos de proteínas, mas sim, seu objetivo é apresentar os aspectos práticos do método para novos pesquisadores no campo.

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T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion espectrometria de mobilidade de massa é uma tecnologia emergente fase gasosa que separa íons, com base em sua colisão transversal e massa. O método fornece informações tridimensionais sobre a topologia geral e forma de complexos de proteínas. Aqui, descrevemos um procedimento básico para configuração e otimização de instrumento, calibração de vezes drift, e interpretação dos dados.

T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

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24.3K visualizações.  Weizmann Institute of Science. Ion espectrometria de mobilidade de massa é uma tecnologia emergente fase gasosa que separa íons, com base em sua colisão transversal e massa. O método fornece informações tridimensionais sobre a topologia geral e forma de complexos de proteínas. Aqui, descrevemos um procedimento básico para configuração e otimização de instrumento, calibração de vezes drift, e interpretação dos dados.