Pour commencer, pipetez 50 microlitres d’échantillons isolés de rat NET dans un tube contenant 450 microlitres de tampon Tris-EDTA. Maintenant, pipetez 100 microlitres des étalons ADN et les échantillons dans une plaque de 96 puits. Ajouter un volume égal de réactif de test dans les puits.
Incuber ensuite la plaque à température ambiante pendant deux à cinq minutes, en évitant l’exposition à la lumière directe. Placez la plaque dans un lecteur de microplaques à fluorescence. Définissez un spectre d’émission d’environ 530 nanomètres et un spectre absorbant d’environ 480 nanomètres.
Incuber les cellules dans un microlitre d’une coloration du noyau pendant 30 minutes. Ensuite, incubez les cellules dans un microlitre de souche d’ADN acellulaire pendant 10 minutes. Mélangez délicatement les colorants fluorescents.
Chargez la plaque d’échantillon dans le cytomètre. Passez au canal SYTOX Green, puis sélectionnez le canal HEXT. Réglez l’éclairage sur Bleu 377/447 et réglez le temps d’exposition sur 300 000 microsecondes.
Cliquez sur Configuration du focus, puis sur Enregistrer auto pour ajuster automatiquement la mise au point. Sélectionnez le canal SYTOX Green et réglez l’éclairage sur Green 483/536. Réglez le temps d’exposition de SYTOX Green à 30 000 microsecondes.
Cliquez sur Démarrer l’analyse pour commencer le processus d’analyse. Des réponses comparables dans la sécrétion de TNE étaient discernables entre les neutrophiles périphériques et les neutrophiles de la moelle osseuse, indépendamment de la stimulation par PMA. Les réseaux de rats présentaient également des capacités de réticulation limitées les uns avec les autres.
L’incubation avec PMA a entraîné une augmentation de 10 % de la teneur en ADN acellulaire après quatre heures, indiquant une plus grande propension à déclencher la formation de NET.
