L’objectif global de cette procédure est de suivre en temps réel la formation de proplaquettaires à partir de mégacaryocytes de souris, qui ont mûri dans leur environnement natif. Cette méthode a l’avantage d’être simple, reproductible et rapide. On peut analyser de nombreux mégacaryocytes et visualiser la formation de proplaquettaires en seulement six heures, au lieu d’attendre le premier jour de culture comme pour les mégacaryocytes de souris in vitro.
Une application intéressante de cette méthode est la possibilité d’étudier l’effet du traitement pharmaceutique ou de la mutation génétique, en particulier à l’étape de l’extension proplaquettaire. Ici, il n’y a pas d’interférence avec le processus de différenciation, comme dans le cas de la culture in vitro. Cette vidéo permet d’assurer ces étapes clés du rinçage et de la coupe de la moelle osseuse.
Il est également expliqué comment classer la morphologie et les mégacaryocytes, ce qui est vraiment utile pour la caractérisation des défauts dans la maladie thrombophile. Pour commencer, réchauffez le tampon de Tyrode à 37 degrés Celsius et allumez la chambre de chauffage du microscope pour amener la température à 37 degrés Celsius. Préparez tous les outils nécessaires, tels qu’une minuterie, des chambres d’incubation, des seringues de calibre 21 millilitres, des pinces, une lame de rasoir, des pipettes Pasteur, des lames en verre et un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Rincez la moelle osseuse avec deux millilitres de tampon de Tyrode en introduisant une aiguille de calibre 21 dans l’ouverture du fémur du côté du genou et appuyez lentement sur le piston pour récupérer un cylindre de moelle intact. Utilisez une pipette en plastique de trois minutes pour transférer soigneusement et doucement la moelle osseuse intacte sur une lame en verre. Coupez les extrémités de la moelle qui peuvent avoir été comprimées au moment de la chasse d’eau.
Coupez ensuite de fines sections transversales de 0,5 millimètre d’épaisseur à l’aide d’une lame de rasoir tranchante pour éviter d’endommager les mégacaryocytes. À l’aide d’une pipette en plastique, collectez 10 sections dans un tube d’un millilitre contenant le tampon de Tyrode. Transférez soigneusement les sections dans une chambre d’incubation d’un diamètre de 13 millimètres.
Aspirez le tampon et réglez le volume à 30 microlitres du tampon de Tyrode complété par du sérum de souris à 5%. Positionnez les sections à distance. Scellez la chambre auto-adhésive avec un glissement de couvercle de 22 par 55 millimètres, en inclinant le glissement du couvercle pour éviter la formation de bulles d’air.
Placez la chambre dans la chambre de chauffage à 37 degrés Celsius. Démarrez le chronomètre et exécutez l’expérience pendant six heures à 37 degrés Celsius, Faites des vidéos pour enregistrer la transformation des mégacaryocytes. Après 30 minutes, les cellules de la moelle migrent progressivement vers la périphérie de l’explantation formant une monocouche.
Après une heure d’incubation, les mégacaryocytes peuvent être identifiés par leur grande taille et leurs noyaux polylobulés. Le nombre de mégacaryocytes augmente après trois heures d’incubation, et certains ont de longues extensions. Dessinez une carte pour localiser chaque section de la chambre d’incubation.
Après une heure, identifiez les mégacaryocytes visibles, qui sont des cellules polylobulées géantes à la périphérie de chaque section, et tracez leurs positions sur le dessin. Répétez cette procédure après trois et six heures. Les mégacaryocytes sont comptés manuellement et classés selon leur morphologie trois et six heures après la fermeture de la chambre d’incubation.
Ils sont classés comme petits, grands avec une intention épaisse et proplaquettaires. Avec l’aide de la cartographie, leur évolution peut être suivie au fil du temps. Les résultats sont exprimés en pourcentage de chaque classe à chaque moment d’observation.
Classiquement, la moitié des mégacaryocytes visibles à la périphérie s’étendent les proplaquettaires à six heures pour la moelle osseuse de souris de type sauvage. Le sort des mégacaryocytes ronds a été suivi par la capture d’images séquentielles au fil du temps pour imager comment ils forment des proplaquettaires. Une chose importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de maintenir les explants à 37 degrés Celsius pendant toute la durée de l’expérience.
Une température différente peut modifier les résultats. Fait intéressant, le protocole explant peut être utilisé après des expériences de microscopie introvertie. En fin de compte, les mégacaryocytes dans les explantes de moelle osseuse seront naturellement fluorescents et leur comportement peut être facilement étudié.
Cela permet de combiner différents traitements sur les mêmes animaux et ainsi de réduire le nombre de souris. En conclusion, la méthode d’explantation est rapide, simple et fournit de nombreuses informations sur la capacité des mégacaryocytes naturels aux proplaquettaires externes. Les résultats qualitatifs et quantitatifs qui en résultent sont essentiels à notre compréhension de la maladie thrombophile.
dans un contexte physiologique ou pathologique.
