Commencez toute la préparation de la monture de l’objectif fixe en créant des coins d’agarose d’immobilisation. Pour ce faire, prenez un plat à fond de verre et versez-y environ cinq à six millilitres d’agarose 2% fondue, dans du PBS. Attendez que l’agarose se solidifie.
Ensuite, utilisez une lame tranchante pour créer un divot triangulaire dans l’agarose solidifiée. Retirez le quartier d’agarose et ajoutez un millilitre de PBS dans le plat. Aspirer toute agarose résiduelle laissée après la coupe.
Créez plusieurs cales dans une seule parabole pour s’adapter à plusieurs lentilles, si nécessaire. Pour conserver le moule, ajoutez-y un millilitre de PBS avant de le maintenir à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pince à épiler incurvée, placez la lentille dans le coin d’agarose contenant un millilitre de PBS.
Ajustez la lentille de manière à ce que la région équatoriale soit orientée vers le bas sur la vitre du microscope lorsqu’elle est placée au-dessus de l’objectif confocal. Placez la boîte sur la platine du microscope. Pour confirmer que la région équatoriale est nette, visualisez les noyaux en vous assurant qu’ils sont alignés en rangées.
Vérifiez également les cellules épithéliales équatoriales irrégulièrement emballées et de forme, ainsi que les cellules de la rangée méridionale alignées avec précision et de forme hexagonale, indiquées par la coloration de la F-actine au niveau des membranes cellulaires. Un empilement aléatoire des noyaux dans le champ de vision indique que la lentille fait face à l’objectif. Si les noyaux ne peuvent pas être observés, cela indique probablement que la face postérieure du cristallin fait face à l’objectif.
Dans de tels cas, utilisez une pince à épiler incurvée pour faire pivoter la lentille jusqu’à ce que les noyaux précisément alignés à l’équateur de la lentille soient observés.
