Pour commencer, étiquetez trois ensembles de tubes stériles de 1,7 millilitre et un ensemble de tubes stériles à fond conique de 15 millilitres. Préparez une centrifugeuse à godets pivotants avec des inserts de tube de 15 millilitres et pré-refroidissez à quatre degrés Celsius. Prenez la plaque de culture cellulaire à six puits avec des cellules transfectées de 293FT.
Aspirez les fluides des puits. Ajoutez 250 microlitres de trypsine-EDTA et incubez à 37 degrés jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de test complété à 10 % de FBS dans chaque puits et pipetez vigoureusement pour créer une suspension unicellulaire.
Transférez un millilitre de suspension cellulaire dans des tubes de 15 millilitres pré-étiquetés. Ajoutez un millilitre de milieu de test complété à 10 % de FBS dans chacun de ces tubes et retournez cinq fois pour mélanger. Transférez ensuite immédiatement 20 microlitres de suspension cellulaire dans le premier ensemble de tubes.
Centrifugez maintenant les tubes de 15 millilitres pendant cinq minutes à 250 g dans une centrifugeuse pré-refroidie. Mélangez 20 microlitres de colorant cellulaire au bleu trypan avec les cellules de la première série et comptez à l’aide d’un compteur de cellules ou d’un hémocytomètre. Après avoir retiré les tubes de 15 millilitres de la centrifugeuse, aspirez le milieu des granules cellulaires et remettez les granules en suspension dans un milieu de test sans sérum pour créer une suspension unicellulaire.
Pour réfrigérer les cellules dans des plaques de 384 puits et de six puits, retournez plusieurs fois les tubes de 15 millilitres pour obtenir une suspension cellulaire homogène et transférez 500 microlitres dans des tubes de 1,7 millilitre dans les deuxième et troisième ensembles. Ajoutez 0,5 microlitre de DMSO pour régler deux et 0,5 microlitre de ligand Halo 618 pour le troisième ensemble de tubes et mélangez bien. Transférez le DMSO et les suspensions cellulaires ligand-positives dans des puits séparés des réservoirs de réactifs.
À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 40 microlitres de chaque suspension dans la plaque de culture à 384 puits. Transférez les cellules restantes dans des plaques de culture fraîches à six puits pour une analyse ultérieure par transfert Western et incubez des plaques à 384 puits et à six puits pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Prenez un milieu de dosage sans sérum préchauffé à 37 degrés Celsius.
Diluez le substrat de nanoluciférase décongelé 1:100 dans un milieu de dosage sans sérum et transférez-le dans un réservoir de réactif. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 10 microlitres de mélange de substrat dans chaque puits de la plaque de culture à 384 puits. Tournez doucement la plaque pendant une minute.
Insérez la plaque de 384 puits dans un lecteur de plaques multimode et enregistrez les émissions de 460 et 618 nanomètres de tous les puits équipés de cellules. Calculez les rapports BRET bruts pour les unités Vehicle-positif et ligand-positif en milliBRET à l’aide de l’équation donnée. Calculez le rapport BRET corrigé en soustrayant le rapport BRET véhicule-positif de celui du ligand-positif.
Le mutant nano-CRAFS259A réduit le signal BRET d’environ 45 % et le mutant nano-CRAFS621A d’environ 25 %Le double mutant élimine presque le signal BRET.
