Pour commencer, obtenez du plasma riche en plaquettes en centrifugeant le sang total anticoagulé au citrate à 200g pendant 20 minutes. Ajoutez de l’indométacine et du PGE1 au plasma et centrifugez à 500 g pendant 10 minutes. Remettre en suspension la pastille plaquettaire obtenue dans le tampon HEPES modifié de Tyrode à 37 degrés Celsius pour obtenir une densité de 2x10^8 plaquettes par millilitre.
Laissez reposer les plaquettes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter du DETC à une concentration finale de cinq micromolaires et de la déféroxamine à une concentration finale de 25 micromolaires dans la suspension plaquettaire, suivie de CMH jusqu’à une concentration finale de 200 micromolaires. Placez les échantillons dans des cuvettes d’agrégation équipées d’aimants d’agitation recouverts de téflon et chargez-les sur l’agrégateur.
Au bout d’une minute, ajoutez des stimuli tels que la thrombine ou le collagène et incubez pendant 10 minutes. Après l’incubation, transférez la suspension plaquettaire de la cuvette d’agrégation dans un microtube à centrifuger et essorez rapidement à 6 000 g pendant 10 secondes. Chargez 50 microlitres de surnageant dans des micro-pipettes capillaires et scellez avec de la cire à cacheter EPR.
Transférez les échantillons sur le scanner EPR et définissez les paramètres sur le scanner. Estimer l’oxydation du CMH en radical CM comme l’aire sous la courbe des pics EPR enregistrés. Obtenez une courbe d’étalonnage à l’aide du radical CM disponible dans le commerce.
L’intensité du signal EPR dans les échantillons était proportionnelle à l’intensité des pics EPR. La spécificité de la détection a été confirmée avec des piégeurs de ROS et des inhibiteurs sélectifs d’enzymes générant l’anion superoxyde. Les données sur la stimulation plaquettaire par la thrombine ou le collagène en présence de l’inhibiteur sélectif VAS2870 suggéré que les NADPH oxydases sont la principale source d’anions superoxydes plaquettaires en réponse à ces deux agonistes.
