우리는이 프로 시저에 mitochondrial 생물학 많은 유용한 통찰력과 조언의 분야에 대한 저자의 소개 교수 A. Vinogradov 및 박사 베라 Grivennikova 감사합니다. 저자는 비디오 준비 도움 퀸즈 대학교 미디어 사무실에서 부인 아만다 McKintock에게 감사하고 있습니다.

소개 쥐의 심장에서 Mitochondria은 세포 대사의 과거 및 현재 연구에 대한 가장 일반적인 준비의 하나입니다. 그들은 야생 입력하거나 노크 아웃 동물에서 다량으로 신속하고 안정적​​으로 얻을 수 있습니다. 일반적인 절차는 트립신, 분류 및 차등 원심 분리에 의해 조직 소화로 구성되어 있습니다. 심장 (그림 1)을 포함한 다양한 조직에서 mitochondria의 분리 동안 보관해야 할 몇 가지 조건이 있습니다. <ul><li> 조직은 직접적으로 얻을 mitochondria의 수율에 영향을 미치는 때문에 철저하게, 다진되어야한다. 심장 조직은 작은 곡선 가위로 말하다하는 것이 가장 좋은 방법입니다 그리고 조직 연삭기는 1.0 주변 mm 직경의 콘센트 구멍의 직경과 마늘을 눌러 사용할 수없는 경우 Latapie 조직 분쇄기를 사용하여 다음 또는 수 있습니다. </li><li> 그것은 각 단계에서 솔루션의 온도를 유지하기 위해 필요합니다. 따라서 전체 절차는 차가운 방에서 모든 악기에 실시해야하고 솔루션을 준비하고 사전에 냉각해야합니다. 온도 조건이 유지되지 않으면 준비 안정 몇 가지 속성이 손실될 수 있습니다. Mitochondrial 구조 때문에 적극적인 교통 연구 중요 특히, 허용되지 않습니다 (원심 분리하는 동안 예를 들면) 정지 overfreezing 동결 매우 민감합니다. </li><li> 중요한 매개 변수는 프로 시저의 시간 길이입니다, 격리는 가능한 한 빨리 수행하며 얻은 준비는 즉시 사용할 수있다한다. 따라서, 수술 도구, 솔루션 및 어플 라이언 스는 사전에 준비해야합니다. </li></ul> 재료 및 악기 악기 <ol><li> 스트레이트 운영 가위, 샵 포인트 </li><li> 곡선 가위 </li><li> 집게 </li><li> 페트리 접시 </li><li> 작은 깔때기 + 나일론 필터의 조각 (prewashed) </li><li> 6 비커 ​​50 ML </li><li> 두 자성 stirrers 두 얼음 욕조 </li><li> 큰 얼음 목욕 </li><li> 이 작은 자석 막대 </li><li> 힘든 펠렛에 대한 Spatulas </li><li> 원심 분리기 튜브 </li><li> Latapie 조직 보도는 (마늘 프레스로 대체 가능) </li><li> 20ml 테플론 - 유리 homogenisers 1 - 2ml </li><li> 폐기물 비커 </li><li> 단백질 결정에 대한 최종 mitochondrial 정지 및 샘플 Eppendorf 튜브 </li><li> 얼음 욕조 </li></ol> 솔루션 (2 쥐 당 계산) : <ol><li> 워싱 버퍼 : 0.3 M의 자당, 10 MM의 HEPES (산도는 = 7.2), 0.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (1000 ML) </li><li> 절연 버퍼 : 0.3 M의 자당, 10 MM의 HEPES (산도 = 7.4), 0.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MG / ML BSA (시그마 A6003) (세척 버퍼에서 준비 100ml). 알부민 소 혈청은 저렴 지방산 무료 analogues로 대체 수 있습니다. 동일한 버퍼 또는 isotonic 유사 콘텐츠는 버퍼를 Resuspending으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 트립신 (시그마 T8003) 솔루션 : 1mM HCL에 2.5mg/ml (0.5 ML) </li><li> 간장 콩에서 트립신 억제제 (시그마 T9128) 절연 버퍼의 6.5 mg/10 ML </li></ol> 프로토콜 절차의 일반적인 구조는 그림에 표시됩니다. 1. 마음은 냉각과 버퍼, 심실 조직은 excised 귤껍질과 트립신과 photolytic 치료하는 동안 homogenised 세탁에 세탁해야합니다. 정지는 낮은 속도 centrifuged하며 얻은 뜨는은 mitochondria 수집하는 높은 속도로 다시 centrifuged입니다. 계획 실험에 따라 resuspending 버퍼는 다른 isotonic 솔루션으로 대체하실 수 있습니다. 동물은 영국에 따라 종료했다 &quot;동물 (과학 절차) 법.&quot; 잘린 다음 경추 전위에 의해. 그것은 바로 동물의 잘린 후 마음을 추출하는 데 필요한, ​​동물 종료 및 심장 추출 사이에 지연이 없다 그래야. mitochondria간에 병렬로 고립이 예상되는 경우 쥐 전에 실험에 밤새 금식을해야합니다. <ol><li> 버퍼 워싱 40 ML을 포함한 세 비커를 준비합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 3-5 분 얼음 소금 목욕에서 그들을 쿨. 그들을 overfreeze 얼음 결정의 구름이 나타나도록 그냥 시작 후 즉시 사용하지 않도록하십시오. </li><li> 참수 암흑의 흉부를 열고 심장을 압축을 풉니다. 작은 incisions를 확인 후 바로 첫 번째 비커에 얼음처럼 차가운 솔루션에 마음을 전송할 수 있습니다. 혈액을 제거하고 두 번째 비커에 넣어 가슴을 묶어라. 각각의 마음에 대해이 작업을 반복합니다. </li><li> 필터 종이에 마음을 건조. 모든 지방, 응고된 혈액, auricles 및 fasciae과 수영장 심실 조직을 제거합니다. </li><li> 입자의 크기가 1-2mm에 대한 때까지 5 분 주위에 얼음에 페트리 접시에 작은 곡선 가위로 풀링 조직을 말하다. </li><li> 조직 보도에 다진 조직을 넣고 통과통과. 자료의 상당한 금액이 때문에 언론의 벽과 바닥의 모든 심장 조직을 수집 언론에 남아있을 수 있습니다 점에 유의하십시오. </li><li> 50 ML의 세척 버퍼로 비커에 자료를 전송하고 저어. 그런 다음 나일론 필터를 통해 현탁액을 필터링합니다. 워싱 버퍼와 필터 3 회에 다진 조직을 세척하고 여과물 폐기하십시오. </li><li> 워싱 버퍼 20 ML로 씻어 조직을 전송하고 자기 활동가에 얼음 욕조에 넣습니다. 지속적인 교반 하에서 트립신 솔루션의 0.5 ML를 추가하고 타이머를 시작합니다. 또 자기 활동가, 얼음 욕조와 두 번째 50 ML의 비커를 준비합니다. </li><li> 4 번째 잠깐 간단히 정지를 해산까지 몇 아래 스트로크와 작은 느슨하게 장착되어 유리 테플론 homogeniser (10 - 15ml)을 사용 부분에 의해 서스펜션 부분을 homogenise. homogenisation 후 두 번째 비커에 정지를 전송합니다. 당신이 총 정지 homogenisation 두 번 수행할 수 있도록, 9 번째 분의 절차를 반복합니다. 부화 15 분 후, 버퍼가 들어있는 트립신 억제제를 분리 10 ML을 추가, 1 분 알을 품다. </li><li> 나일론 필터를 통해 다시 정지를 필터링하고 여과물을 저장합니다. 워싱 버퍼의 15-20 ML 1 분 필터와 homogenise ​​왼쪽 미립자 분수를 수집합니다. </li><li> 여과액 및 600g에 15 분 원심 분리기로 homogenate를 결합합니다. </li><li> 조심스럽게 새로운 원심 튜브에 발생 뜨는을 필터링합니다. 펠렛의 오염을 방지하고 8,500g 15 분 다시 원심 분리기. </li><li> 고속 원심 분리 후 뜨는을 버리고 버퍼 폐기 무성한 하얀 바깥쪽 가장자리 층 1 ML과 펠릿 2-3 번 씻어. 주걱으로 펠렛을 휴식하지만 맨 아래에있는 적혈구의 붉은 자리를 피하십시오. 혈액 세포가 루스있다면, homogenisation 전에 정지에서 빨간색 비트를 제거합니다. </li><li> 부드러운 pipetting하여 작은 homogeniser하거나 또는와 펠렛을 Resuspend. 더 많은 Isolationbuffer과 정지를 희석하고 8천5백g 15 분 다시 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소, 버퍼 (선택 isotonic 버퍼) Resuspending에서 펠렛을 resuspend 다시 원심 분리기. </li><li> 결과 갈색 펠렛은 씻어 그대로 mitochondria가 포함되어 있습니다. 원하는 isotonic 버퍼의 아주 작은 볼륨에서 펠렛을 Resuspend. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. mitochondria 쥐 심장의 분리의 단계 절차에 의해 단계를 보여주는 제도. 상단 부분, 단계 1-9 : 조직 파괴, 트립신 처리 및 homogenisation, 하단 부분, 단계 10-15 : 차등 원심 분리.

<ol>
	<li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+heart+mitochondria:+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation.">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li><li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes:+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria.">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

커플링의 높은 학위를 그대로 mitochondria의 격리에 대한 자세한 급속한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 획득 준비는 셀룰러 bioenergetics, proteomic 연구 또는 mitochondrial DNA와 지질 콘텐츠의 분석 기능이나 구조 연구에 사용할 수 있습니다. 이온과 신진 대사 중간체의 적극적인 교통 Biophysical 연구도 수행할 수 있습니다. 그것은 더 submitochondrial 입자, 바깥쪽 막이나 산화 인산화의 정화 별도의 구성 요소를 분리하기 위해 mitochondrial 준비를 처리할 수 있습니다. 설명한 방법은 제이 코 버스와 삭스 1 고립의 표준 프로토콜의 수정입니다. 준비 mitochondria의 예상 수확량은 마음 당 mitochondrial 단백질과 malate / 등 준비 글루 탐 산염은 간의 차이에 대한 호흡 관리 비율의 약 10-15 MG는 0.12 주위 μmol O 2 xmin -1 xmg 단백질의 주 IV의 호흡과 함께 8-12 23 -1 ° 0.25 M의 자당, 10 MM KCl, 0.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 초기화 상태 III의 호흡 150 μm의의 ADP (정확한 실험 조건 및 추가에 대한 심판을 참조하십시오 5 MM의 칼륨 나트륨 (산도 8.0)를 구성된 매체 C 2.). 특별한주의는 격리 절차의 시작하기 전에 몇 가지 기술적인 세부 정보를 제공해야합니다. 그것은 깨끗한 폴리 카보 네이트 또는 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브를 사용하는 데있어 매우 중요합니다, 따라서 튜브는 철저하게 깨끗한 칫솔과 온수, 그러나 세제 치료를 최소한으로 유지되어야 함께 세탁해야합니다. 또한, 그것은 고립되기 전에 하루 추운 방에 필요한 모든 유리와 악기를 수집하는 것이 좋습니다. 절연 동안 비커에 flasks에서 버퍼를 전송할 때, а 특별한주의가 솔루션에 얼음 물이 방울을 방지하기 위해 제공해야합니다. 조직을 다룰 때 그것은 심장 추출이 동물의 잘린 및 조직을 냉각 사이에도 짧은 시간 지연이 부분 uncoupled mitochondria을 초래 하리라는 사실 때문에 가능 한한 빨리 수행되어야한다는 것을 강조해야합니다. 신속한 냉각 및 제거 마음의 철저한 세척는 헤모글로빈과 적혈구 NADase에서 무료로 표준 준비를 얻기 위해 필수적입니다. 트립신은 homogenisation 중 전단의 강제로 조직의 자화율을 높일 결합 단백질의 저하에 사용됩니다. 그것이 열등 품질의 mitochondria 결과 이​​후 프로 테아제에 대한 조직의 장시간 노출을 피해야한다. 고속 centrifugations 후 원심 분리기 튜브의 벽은 벽에 축적된 지방 소재의 예금을 제거 티슈로 닦아해야합니다. 최종 resuspension의 경우는 저장 (심장 당 버퍼 150-200 μl) 동안 mitochondrial 기능의 손실을 최소화하기 위해 최종 버퍼의 낮은 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다. 이가의 양이온의 수송 연구에 대한 chelating 요원들이 EGTA 무료 매체를 여러 번 씻어 및 절연 후 첫번째 시간 이내에 사용해야하므로 mitochondria 최종 준비에 존재이어야합니다.

preparation of highly coupled rat heart mitochondria

산화 인산화 과정에서 세포 ATP의 생성에 mitochondria의 기능은 널리 인정되고 있습니다. 지난 수십 년 동안 에너지의 생성보다 mitochondria 기타의 기능에 대한 우리의 이해에 상당한 진보가 있었있다. 이러한 organelles, 포유류의 개발을 신호 및 세포 대사 및 세포 증식 사이의 협력에 자신의 기여뿐만 아니라 노화 역할, apoptosis의 역할을 포함합니다. mitochondria에 의해 변조된 생물 학적 과정에 대한 우리의 이해는 고립과 실험실 동물의 조직에서 손상 mitochondria의 취급에 대한 강력한 방법을 기반으로합니다. 쥐의 심장에서 Mitochondria 노크 아웃 동물 연구를 포함하여 세포 대사의 과거 및 현재 연구에 대한 가장 일반적인 준비의 하나입니다. 여기 커플링의 높은 학위를 그대로 mitochondria의 격리에 대한 자세한 신속한 방법을 설명합니다. mitochondria 쥐 심장의 이러한 준비 셀룰러 bioenergetics, mitochondrial DNA, 단백질 및 lipids의 biomolecules, proteomic 연구 및 분석의 교통에 대한 기능 및 구조 연구를위한 훌륭한 개체입니다.

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Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

우리는 세포 bioenergetics, biophysical 측정, proteomics 또는 mitochondrial DNA와 lipids 분석의 기능이나 구조 연구 mitochondria 순수, 높은 결합 쥐 심장의 절연을위한 а 프로토콜을 설명합니다.

Mitochondria 높은 결합 랫 마음의 준비

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.7K 조회수.  University of Manchester. 우리는 세포 bioenergetics, biophysical 측정, proteomics 또는 mitochondrial DNA와 lipids 분석의 기능이나 구조 연구 mitochondria 순수, 높은 결합 쥐 심장의 절연을위한 а 프로토콜을 설명합니다.

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Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

랫 중심에 엔지니어링된 조직의 주입

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

연구

생물학

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

효모 세포 Mitochondria의 정화

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Biomechanical 및 Mechanobiological 연구 랫 타일 힘줄의 준비

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징<em&gt; 생체</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

포유류의 전체 배아 문화에 적합 쥐 혈청의 제조

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

자동화 모​​듈 높은 처리량 엑소 폴리 사카 라이드 심사 플랫폼은 매우 민감한 탄수화물 지문 분석과 결합

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

격리 된 작업 쥐의 심장에서 포도당과 지방산 산화의 가격의 결정 방법

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