La recherche est soutenue par National Institutes of Health subventions AI-52381, CA138623 et le Kentucky Lung Cancer Research Board et l&#39;appui institutionnel de James Graham Brown Cancer Center.

Méthodologie Description du microscope En direct des expériences d&#39;imagerie cellulaire réalisée à l&#39;aide de TE-FM épifluorescence système attaché à Nikon Eclipse TE300 microscope inversé. Le microscope équipé d&#39;étape de chauffage. Une fraîche pression HQ numériques CCD N / B (Roper Scientific) caméra et LAMDA 10-2 filtre optique changeur (fabricant de l&#39;appareil Sutter) est attaché à microscope. Longueurs d&#39;onde d&#39;excitation et d&#39;émission sont contrôlés avec des roues de filtre et contrôlé par Lamba 10-2 contrôleur de roue à filtres, Sutter Instruments Co. Temps d&#39;exposition de 500 ms devrait être suffisant pour voir DP ou GFP dans les cellules vivantes. Le contrôle du matériel et l&#39;acquisition d&#39;images sont contrôlés par le logiciel Metamorph. Le choix des filtres pour la présente étude sont, filtre fixe S480/20x, S525/40m et S565/25x, S620/60m pour la GFP et DP, respectivement; EGFP / DsRed dual dichroïque, technologie Chroma. Cette roue à filtres peut accueillir jusqu&#39;à six ensembles de filtres. Microscope est attaché avec contrôleur étape préalable Proscan avec joystick. Tous ces attachements matériels peuvent être contrôlés par le logiciel Metamorph. Le microscope est également jointe avec Micromanipulateurs pour tenir le micropipettes. A. Mesure des leucotriènes B 4 migration dirigée des cellules dendritiques Utilisation de la mise en microscopie décrites ci-dessus, nous avons développé des méthodes pour la suite ligand migration dirigée des cellules dendritiques en temps réel. Deux micromanipulateurs (Narishige) sont attachés à la loupe. Le chimiotactisme de la moelle osseuse de souris des cellules dendritiques dérivées (BMDCs) vers LTB 4 gradient a été enregistré. Ici, nous décrivons les méthodes pour préparer le micro-pipettes utilisant des micro-pipette extracteur, le chargement du ligand dans les micro-pipette et la mise en place de l&#39;expérience chimiotactisme sur la scène chauffée du microscope pour contrôler la migration directionnelle des cellules. Cette méthode peut être appliquée pour tester l&#39;efficacité des chimiotactiques distinctes dans l&#39;induction de la migration ainsi que l&#39;effet des inhibiteurs de la chimiotaxie des cellules vivantes. L&#39;isolement des BMDCs 21 de la souris a été décrit dans plusieurs publications dont JoVE 22. 1. Préparation de BMDCs <ol><li> Plate BMDCs (après culture pendant 10 jours) sur le plat lamelle Fluoro bas et leur permettre de croître pendant 16 heures d&#39;avance sur l&#39;expérience. </li><li> Laver les cellules avec 3 mL de PBS 1X au moins 2 fois (en ajoutant 3 ml de PBS 1X à la plaque et l&#39;aspiration de la sortie du tampon). </li><li> Ajouter 2 mL de 1XPBS à l&#39;assiette. Les cellules sont maintenant prêts pour l&#39;expérience. Gardez les cellules de 37 ° C avant d&#39;incubateur d&#39;expérience. </li></ol> Préparation du ligand chargés micro pipette: <ol start="4"><li> Fixer les tubes capillaires en verre (verre standard, 0,75 mm x 0,4 mm; 6 &quot;, Cat # 625500, AM Systems, Inc) sur la verticale extracteur micropipette (Narishige International USA, Inc.) </li><li> Maintenir la température à 52 ° C et laisser le verre pour faire fondre et séparer pour former des conseils tranchant. </li><li> Fixer la pipette sur le support micro-pipette. </li><li> Lisse les aspérités de la pipette à l&#39;aide de micro Micro forger M-900 (Narishige International USA, Inc) en regardant sous le microscope. </li><li> Préparer au moins 10-20 pipettes pour chaque expérience. Remarque: Les micropipettes peuvent également être achetés à partir d&#39;instruments de précision du monde (TIP μ, T1801TW1F). </li><li> Prenez concentration souhaitée (500 uL de 100 nM LTB 4 dans l&#39;expérience actuelle) du ligand dans 1 ml effendorf tube et conserver la pointe de la pipette de micro dans la solution et permettre à la solution d&#39;entrer dans la pipette de micro (remblayage). </li><li> Prélever 1 ml de ligand et dans la seringue (1 cc de tuberculine seringue) lentement et remplissez le ligand à l&#39;aide de micro-aiguilles Remplir (MF 28G-5, Instruments de précision mondiale) dans la pipette de micro, de haut. </li><li> Fixez le tuyau, ce qui correspond étroitement à la pipette à la pipette et le tube de l&#39;aiguille (21 G 11 / 2) attaché à seringue de 1 mL, qui est rempli avec le ligand. </li><li> Maintenant, déplacez le ligand attentivement remplie de micro-pipette à la platine du microscope et de fixer sur des micro manipulateurs. </li><li> Appliquer peu de pression de la seringue pour faire ligand sûr, c&#39;est libérant lentement de la pointe. </li><li> Amener le BMDCs plaqués immatures au microscope et de les garder sur la plaque chauffée (37 ° C) étape. </li><li> Retirez le couvercle du plat fluorées. </li><li> Concentrer les cellules en utilisant l&#39;huile à immersion lentille d&#39;objectif 60X. </li><li> Soigneusement, faire tomber le ligand chargés pipette à l&#39;aide «grossier manipulateur manuel MN-188NE &#39;à la proximité des cellules. </li><li> Concentrer l&#39;aide de la pipette »micromanipulateur hydraulique Beaux-MN-188 NE». </li><li> Appliquer peu de pression de la seringue pour s&#39;assurer que ligand est la libération dans le plat. </li><li> Définissez les paramètres d&#39;acquisition d&#39;image à acquérir dans les brillantes déposée (exposition de 10 ms) dans toutes les 15 secondes pendant 2 heures en utilisant le logiciel Metamorph. </li><li> Gardez surveillance toutes les 30 min pour la progression de migration vers le ligand. </li><li> Si les cellules sont surpeuplées à l&#39;extrémité de la pipette, changer l&#39;emplacement de l&#39;extrémité de la plaque pour continuer la migration de l&#39;expérimentation. </li></ol> B. Mesure GPCR (BLT1) et protéine cytosolique (β-arrestine) Interactions, la translocation dans les cellules vivantes 1. Préparation de constructions d&#39;ADN plasmidique Les détails de constructions d&#39;ADN plasmidique ont été décrites dans Jala et al. (2005) 18. 2. La transfection de l&#39;homme BLT1-DP et β-arrestines-GFP dans les cellules RBL-2H3 <ol><li> Maintenir le Rat basophiles Leukomia (RBL-2H3) Cellules (60 à 70% de confluence) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 95% d&#39;air, 5% de CO 2 en tant que cultures monocouches dans un milieu de croissance (DMEM supplémenté avec 15% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / mL de streptomycine) dans des flacons T75. </li><li> Détacher les cellules de la boîte / flacons en utilisant 6 ml de trypsine-EDTA (0,05% de trypsine, 0,53 mM EDTA) et incubation pendant 5 min à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 95% d&#39;air, 5% de CO 2. Secouez doucement les flacons de surveiller l&#39;ampleur de détachement des cellules. </li><li> Ajouter 6 mL de milieu de croissance au flacon contenant 6 ml de trypsine-EDTA et recueillir les cellules en les mélangeant par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Transférer les cellules dans des tubes de 15 ml Falcon. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et prendre 4 x 10 6 cellules dans 15 tubes à centrifuger ml et centrifuger à 480g rpm pendant 3 minutes et de remettre en suspension dans 200 uL de médias de transfection (DMEM, 20% de FBS, HEPES 50 mM). Si vous prévoyez d&#39;effectuer trois transfections, préparer les cellules et les médias transfection en conséquence par le nombre de cellules augmente et le volume du milieu de transfection. </li><li> Préparer les plasmides transfectés à des concentrations d&#39;au moins 1,5 ug / uL. Nous préparons l&#39;ADN plasmidique en utilisant l&#39;ADN plasmidique Maxi kit QIAGEN. Ajouter l&#39;individu ou les deux ADN plasmide codant pour l&#39;homme BLT1-DP (25 ug) et β-arrestin1-GFP (15 ug) de cuves d&#39;électrophorèse stérile, (Bio-Rad # 16552088), qui a 0,4 cm écartement des électrodes. </li><li> Prenez 200 ul de cellules en suspension au-dessus et de les placer dans des cuvettes contenant soit hBLT1-DP ou β-arrestin1-GFP ou les deux ensemble et les mélanger délicatement avec une pipette stérile mL. </li><li> Laisser les cuvettes ci-dessus à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Électroporation dans les cellules Gene Pulser II avec une tension de 250 V et la capacité de 500 pF. </li><li> Après électroporation laisser les cellules restent à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Prélever 1 ml de milieu de croissance régulière et le mélanger avec des cellules par électroporation dans les cuvettes. </li><li> Distribuer 300 uL de ce mélange dans des boîtes de 35 mm de tissu de verre culture sur le fond (plat fluoro, Instruments de précision mondiale) contenant 2 mL de milieu de croissance régulière et incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 95% d&#39;air, 5% de CO 2. Laisser les cellules adhèrent au fond du plat. </li><li> Remplacez le support après 1 h d&#39;incubation avec une croissance régulière des médias et leur permettre de croître à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 95% d&#39;air, 5% de CO 2 incubateur pendant 18-24 heures. </li></ol> 3. Imagerie de cellules vivantes Acquisition d&#39;images <ol><li> Après 18-24 heures, laver les cellules 2 ou 3 fois avec 2 ml d&#39;eau tiède rouge de phénol contenant du RPMI sans HEPES 10 mM, pH 7,55 (Ajouter 2 mL de milieu chaud directement à l&#39;assiette et les médias aspirer. Répétez 2 ou 3 fois). Ajouter 1,8 ml de phénol chaude RPMI rouges gratuite contenant 10 mM HEPES. </li><li> Placer 30 mm plats en verre à fond la culture lamelle contenant cellules RBL-2H3, transfectées avec hBLT1-DP et β-arrestin1-GFP sur la platine du microscope chauffée (37 ° C). </li><li> Recueillir les images à un grossissement de 600x cellulaire utilisant 60 x Objectif Nikon plan Apo 60X/1.4 lentilles numériques d&#39;immersion d&#39;ouverture d&#39;huile (disponible dans notre système de microscope). </li><li> Mettez une goutte d&#39;huile sur la lentille 60 x objectif et de concentrer les cellules avec le champ lumineux régulier lumière transmise en touchant le fond de la plaque. </li><li> Pour surveiller la fluorescence des protéines transfectées, passer de champ lumineux (lumière transmise) à la fluorescence de filtre (DP filtre, si vous voulez voir des récepteurs ou GFP, si vous voulez voir β-arrestin1). </li><li> Choisissez la cellule brillant et sain, qui exprime hBLT1-DP sur la surface de la cellule en utilisant DP filtre et capturer l&#39;image. </li><li> Puis passage à la GFP de filtre et de s&#39;assurer que β-arrestine-GFP exprimée dans le cytoplasme et capturer l&#39;image. Puis pseudo couleur à la fois les images, avant que le temps écoulé capturer des images de cellules vivantes pour s&#39;assurer que saigner à travers de la fluorescence n&#39;est pas en prenant survenant entre DP et GFP. </li><li> Une fois le choix de votre cellule fait, définissez les paramètres en fonction de votre objectif en utilisant un logiciel (Software Metamorph dans ce cas). </li><li> Dans la démonstration actuelle, seize images bits sont acquises avec la venuemis en binning ra à 1 X 1 combiné avec l&#39;objectif 60 du Plan X Nikon Apo 60X/1.4 lentilles numériques d&#39;immersion d&#39;ouverture de pétrole. </li><li> Recueillir les images de fluorescence pour DP et fluorochromes GFP simultanément à 30 intervalle de temps sec (si les interactions translocation / sont trop rapides, on peut réduire les intervalles de temps) de ces roues en utilisant un filtre contrôlé par un logiciel Metamorph. </li><li> Le temps d&#39;exposition Appareil photo réglé à 1000 ms pour DP et GFP. (Réglez le temps d&#39;exposition spécifique en fonction de l&#39;intensité de fluorescence de DP et GFP). </li><li> D&#39;abord recueillir les images pendant 1 min sans ligand ajoutant, qui sert de point 0 fois. </li><li> Ajoutez les 200 uL de ligand (en stock de 10 uM à une concentration finale de 1 uM) après 1 min sans déranger la plaque / ou position de la cellule. </li><li> Les images de fluorescence sont recueillies pendant 60 min après l&#39;ajout du ligand et stocké sous forme d&#39;images TIFF avec l&#39;ordre croissant des noms de fichiers. </li><li> Tous ces fichiers peuvent être faites sous forme de fichiers individuels avec pile / combiné des images de fluorescence avec des timbres de temps en utilisant le logiciel. </li></ol> Processus d&#39;images et de quantification de la fluorescence des protéines et la localisation <ol><li> Acquérir les images avec support ordinaire (sans cellules) avec filtres DP et GFP fluorescentes et les enregistrer comme images de fond. Utilisez ces images pour soustraire à partir d&#39;images données réelles obtenues ci-dessus. </li><li> Préparer la pile d&#39;images individuellement pour les images DDP et GFP. </li><li> Sélectionner / définir les différentes régions (surface vs cytosolique) pour mesurer l&#39;intensité de fluorescence de la DP et la GFP (BLT1 et β-arrestine translocation) </li><li> Tracer les intensités de fluorescence selon le montant qu&#39;il en fonction du temps. Ce graphique va fournir les informations sur la cinétique de la translocation de la molécule donnée. </li></ol> Les résultats représentatifs A. Mesure des leucotriènes B 4 migration dirigée des cellules dendritiques La méthode décrite dans ce protocole a été utilisé pour déterminer la migration des cellules dendritiques vers leucotriène B 4 (figure 1 et vidéo ci-jointe 1) 21. Nous pouvons appliquer la même méthodologie pour déterminer la capacité chimiotactique de cellules à un ligand particulier dans les cellules vivantes. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Moelle osseuse de la souris dérivées de migration des cellules dendritiques vers 100 nM LTB 4. Vidéo 1. Direct la migration cellulaire des BMDCs vers LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Boddulrui_Video1.AVI">Cliquez ici pour voir la vidéo</a> . B. Mesure GPCR (BLT1) et protéine cytosolique (β-arrestine) Interactions, la translocation dans les cellules vivantes A l&#39;issue de cette procédure, on peut obtenir les informations suivantes dans les événements signalisation des RCPG. <ol class="lroman"><li> La localisation des RCPG et protéines cytosoliques et le noyau (figure 2). </li><li> Interaction ligand induit de la surface de GPCR (BLT1 dans ce cas) avec des protéines cytosoliques (β-arrestine dans ce cas) (figure 3). </li><li> Cinétique de l&#39;internalisation du récepteur et la β-arrestine translocation vers la membrane suivie d&#39;une internalisation long avec des récepteurs (figure 4) (Jala et al. 2005) 18. </li><li> On peut déterminer le statut de dépendance ligand activation du récepteur dans des cellules vivantes (ci-joint la vidéo 2) et de déterminer les motifs critiques ou processus impliqués dans l&#39;activation du récepteur (Jala et al. 2005) 18. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Expression de BLT1-DP (A), β-arrestine-GFP (B), pNuc-PCP (C) dans les cellules RBL-2H3. Image couleur combinée montré dans le panneau D. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Translocation induite Ligand des récepteurs β-arrestine et. Ligne de balayage des intensités de fluorescence dans les cellules sont représentées. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Cinétique de l&#39;internalisation du récepteur et la β-arrestine translocation lors de l&#39;addition de 1 uM LTB 4. Les intensités de fluorescence ont été mesurées en fonction du temps à la membrane et les lieux cytosolique de la cellule. Vidéo 2 d&#39;imagerie en direct de cellules exprimant BLT1-DP et β-arrestine-GFP à l&#39;addition de 1 uM LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Bodduluri_Video2.AVI">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a>

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Imagerie des cellules vivantes est un outil puissant pour démontrer les fonctions et les interactions des protéines spécifiques comme ils se produisent en temps réel. Les méthodes décrites dans ce manuscrit montrent clairement que LTB 4 peut induire une migration rapide des cellules dendritiques. Ces méthodes, non seulement d&#39;élargir les aspects de LTB 4 fonction des types cellulaires variés, ils permettent des méthodes similaires pour être appliquée à une variété d&#39;autres ch...

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<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CRL-2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Delbecco's modified Eagle&#x2019;s Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol red free RPMI or DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11835-030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES (1M)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Others:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>FD35-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>16552088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Instruments/software:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser II electroporater </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Universal Imaging</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vertical Micro-pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-Forge M-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hadraulic Micromanipulator MO-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coarse Manual Manipulator, MN-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA constructs:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (&beta;-arrestin1-GFP in present study).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

real-time imaging of leukotriene b4 mediated cell migration and blt1 interactions with &beta;-arrestin

Récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) appartiennent à la famille de sept transmembranaire de protéines et de médiation de la transduction des signaux extracellulaires à des réponses intracellulaires. RCPG de contrôle diverses fonctions biologiques telles que le chimiotactisme, la libération de calcium intracellulaire, la régulation des gènes d&#39;une manière dépendante du ligand via protéines G hétérotrimériques 1-2. Liaison du ligand induit une série de changements conformationnels conduisant à l&#39;activation des protéines G hétérotrimériques qui modulent les niveaux de seconds messagers tels que l&#39;adénosine monophosphate cyclique (AMPc), inositol triphosphate (IP3) et du glycérol diacyle (DG). Concomitante avec l&#39;activation de la liaison d&#39;un ligand du récepteur initie également une série d&#39;événements afin d&#39;atténuer le récepteur signalisation via la désensibilisation, la séquestration et / ou l&#39;internalisation. Le processus de désensibilisation des RCPG se fait via la phosphorylation du récepteur par des kinases des récepteurs aux protéines G (GRK) et se fixer des β-arrestines 3. β-arrestines sont des protéines cytosoliques et la translocation de la membrane lors de l&#39;activation de GPCR, la liaison aux récepteurs phosphorylés (la plupart des cas), il en facilitant 4-6 internalisation du récepteur. Leucotriènes B 4 (LTB 4) est une molécule lipidique pro-inflammatoire dérivé de l&#39;acide arachidonique et voie médie ses actions via les RCPG, LTB 4 récepteurs 1 (BLT1; un récepteur de haute affinité) et LTB 4 receptor 2 (BLT2; un récepteur à faible affinité ) 7-9. Le LTB 4-BLT1 voie a été montré pour être critique dans plusieurs maladies inflammatoires, notamment, l&#39;asthme, l&#39;arthrite et l&#39;athérosclérose 10-17. Le présent document décrit les méthodologies développées pour surveiller LTB4 induite par la migration des leucocytes et les interactions des β-BLT1 avec arrestine et la translocation des récepteurs dans les cellules vivantes en utilisant des techniques d&#39;imagerie microscopique 18-19. La moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des souris C57BL / 6 ont été isolées et cultivées comme décrit précédemment 20-21. Ces cellules ont été testés en direct des méthodes d&#39;imagerie cellulaire pour démontrer LTB 4 migration cellulaire induite. Le BLT1 humaine a été marqué avec la protéine fluorescente rouge (BLT1-DP) en C-terminal et β-arrestin1 tagués avec la protéine fluorescente verte (β-arr-GFP) et les plasmides transfectés dans les deux Rat basophiles Leukomia (RBL-2H3) des lignées cellulaires 18-19. La cinétique de l&#39;interaction entre ces protéines et la localisation ont été surveillés à l&#39;aide en direct vidéo-microscopie cellulaire. Les méthodologies dans le présent document décrit l&#39;utilisation de techniques microscopiques pour étudier les réponses fonctionnelles de G récepteurs couplés aux protéines dans les cellules vivantes. Le présent document décrit également l&#39;utilisation de logiciels Metamorph pour quantifier l&#39;intensité de la fluorescence pour déterminer la cinétique de récepteurs et les interactions entre protéines cytosoliques.

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Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

Ce document décrit la méthodologie pour déterminer la réponse chimiotactique des leucocytes à des ligands spécifiques et d&#39;identifier les interactions entre les récepteurs de surface cellulaire et des protéines cytosoliques en utilisant des techniques d&#39;imagerie cellulaire direct.

Imagerie en temps réel des leucotriènes B 4</subMigration> Cell Mediated et BLT1 Interactions avec β-arrestine

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

12.7K vues.  University of Louisville. Ce document décrit la méthodologie pour déterminer la réponse chimiotactique des leucocytes à des ligands spécifiques et d'identifier les interactions entre les récepteurs de surface cellulaire et des protéines cytosoliques en utilisant des techniques d'imagerie cellulaire direct.

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Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

En temps réel l&#39;imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Recherche

Immunologie et infection

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

La migration des cellules dendritiques de surveillance utilisant l&#39;imagerie par résonance 19F / 1H magnétique

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imagerie en temps réel et la Quantification du développement de biofilms fongiques en utilisant un système de flux de recirculation en deux phases

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

Modèle de maladie microfluidique in vitro pour étudier les interactions endoteléliales du sang entier et la dynamique des caillots sanguins en temps réel

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Surveillance de la survie du virus de la grippe à l’extérieur de l’hôte à l’aide d’une analyse cellulaire en temps réel

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Quantification en temps réel des espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles infectés par escherichia coli méningitique

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Imagerie en temps réel des leucotriènes B 4 Cell Mediated et BLT1 Interactions avec β-arrestine

Imagerie en temps réel des leucotriènes B_{4 Cell Mediated et BLT1 Interactions avec β-arrestine}