1. La croissance de H. Capsulatum <ol><li> Préparer une enceinte de sécurité biologique pour le travail avec le champignon par le nettoyage de l&#39;armoire avec l&#39;eau de Javel à 10% puis 20 min d&#39;irradiation UV. H. capsulatum dans la phase de la levure nécessite du niveau de biosécurité (BSL) pratiques II, tandis que la forme du moule nécessite BSLIII. Utilisez la forme levure dans les étapes suivantes. </li><li> Suivant préparer un tube de 15 ml conique avec 5 ml de PBS. Récolte d&#39;une colonie de H. capsulatum (Hc souche ATCC G217B) à partir d&#39;une plaque de BHI agar au sang [de glucose à 10 g / L, la cystéine 0,1 g / L, la pénicilline-streptomycine 1% et les moutons des globules rouges à 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, USA) ] cultivées à 37 ° C ou prélever une aliquote de stock levures congelés à -80 ° C et l&#39;ajouter à la PBS. Vortex les cellules vigoureusement et centrifugeuse pour 1100 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer délicatement le surnageant sans perturber le culot et ajouter 10 ml d&#39;PBS frais. Répétez cette procédure trois fois. Suspendre les cellules dans 5 ml de PBS et de transférer à un tube conique de 50 ml. </li><li> Pour perturber les cellules agrégées, passer la suspension de cellules de levure dans un G1 26 / 2 u aiguille chanter une seringue de 10 ml 5 fois dans une enceinte de sécurité biologique (utilisant la protection du visage). Pour isoler les petits, la levure uniforme de taille, centrifuger les cellules à 55 g pendant 1 min à température ambiante, puis enlever le haut de 1 ml. </li><li > Ajouter la suspension cellulaire dans un erlenmeyer stérile contenant 100 ml de milieu HAM F12 (Gibco) supplémenté avec 16 g / L de glucose, 1g / L d&#39;acide glutamique, 8.4mg / L cystine, 6g / l d&#39;acide glutamique et ensuite pousser les cellules à 37 ° C pendant 48 h dans un incubateur à 150rpm secouant. </li></ol> 2. Croissance hybridome et purification d&#39;anticorps monoclonaux <ol><li> Transfert des hybridomes sélectionnés pour un milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal, NCTC 10%, 1% de non-acides aminés essentiels et 1% de pénicilline-streptomycine. Cultiver les cellules dans un flacon de culture cellulaire (Becton Dickinson) pendant 5-7 jours à 37 ° C CO / 5% 2. </li><li> Puis centrifuger le milieu à 1100 xg pendant 10 min à température ambiante et de recueillir toutes le surnageant sans perturber les pastilles. </li><li> Ensuite, purifie le surnageant cellulaire gratuitement en utilisant une protéine Une résine / G par FPLC. </li><li> La concentration du MAB peut alors être calculée par une capture (1) ELISA utilisant un contrôle isotype IgG en standard (figure 1B). </li></ol> 3. Préparation Histoplasma capsulatum inoculum <ol><li> Prenez un 48 h Histoplasma capsulatum (Hc souche ATCC G217B) culture en phase de levures cultivées en HAM F-12 à moyen terme. </li><li> Centrifuger les cellules à 1100 xg pendant 10 min. Jeter le surnageant et ajouter du PBS frais. </li><li> Répétez la procédure 3.2 à 3 reprises. </li><li> Passez à la suspension de cellules de levure 5 fois par une aiguille 26G1 / 2 à l&#39;aide d&#39;une seringue. </li><li> Centrifuger la suspension à 55 g pendant 1 min à grappes culot cellulaire résiduel. Transférer le surnageant contenant la suspension cellule unique à un nouveau tube. </li><li> Énumérer la suspension cellulaire unique en utilisant un hématocytomètre. </li><li> Ajuster la concentration de cellules afin de parvenir à 1,25 x 10 7 levures (de survie) ou 5,0 x 10 6 (UFC, de cytokines et de l&#39;histologie) dans une suspention de &lt;50 ul (figure 2). </li></ol> 4. L&#39;administration intrapéritonéale des anticorps monoclonaux <ol><li> Ramassez la souris par la queue et la peau du cou (figure 3A). Immobiliser la souris par la peau du cou aussi près que possible theears (assurez-vous de prendre assez de peau pour que la souris cannotturn sa tête pour mordre la personne qui le manipule; figure 3B et 3C). </li><li> Stabiliser le doigt withthe petite queue délicatement pressé contre la paume de la main (figure 3D). </li><li> Nettoyer la zone d&#39;injection d&#39;éthanol à 70% avant de placer l&#39;aiguille et aspirer à regarder de sang avant l&#39;injection. </li><li> Utilisez le 26G1 / 2 à piercethe peau et abdominalmuscles pour injecter la solution contenant 500μg mAb (PBS, l&#39;anticorps isotype contrôle ou de l&#39;anticorps monoclonal à tester, dilué dans 1 ml de PBS) en gauche thelower ou quadrant inférieur droit abdominale (cavité péritonéale), avec l&#39;animal dans la position tête en bas, en prenant soin d&#39;éviter les organes andother membrane interne (figure 3F). </li><li> Attendez un peu avant de retirer l&#39;needleto réduire la probabilité de fuite. </li><li> Attendre un minimum de deux heures avant de passer à l&#39;étape suivante. </li></ol> 5. L&#39;anesthésie de la souris et les infections par voie intranasale <ol><li> Préparer l&#39;anesthésie avec kétamine et de xylazine à 100 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement. Effectuer l&#39;administration intrapéritonéale de PBS, l&#39;anticorps isotype contrôle, ou d&#39;anticorps expérimentaux tels que décrits dans le protocole d&#39;accompagnement écrite. Attendre deux heures après l&#39;injection mAb avant anesthésier la souris et de procéder à l&#39;infection intranasale. Préparer la kétamine et de xylazine l&#39;anesthésie à l&#39;aide à 100 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement (7).<html> </li><li> Pendant la période de 2h d&#39;attente, préparer l&#39;inoculum capsulum Histoplasma comme décrit dans le protocole d&#39;accompagnement écrite. </li><li> Procéder selon les Articles 5.1 à 5.5. Toe pincer les animaux avec une pincette et de vérifier l&#39;absence de réflexe et de confirmer que l&#39;anesthésie a travaillé. Après anesthésie, doucement suspendre la souris par ses dents de devant d&#39;une chaîne de nylon ou de coton. Utilisez 2 stands colonne pour attacher les ficelles dans l&#39;ordre de suspendre les animaux. </li><li> Lentement administrent environ 50 ul d&#39;inoculum dans un nare aide d&#39;une micropipette tout en surveillant étroitement le taux de respiration de la souris. Laissez la souris pour se reposer dans cette position pendant 2-5 min après l&#39;infection intranasale pour faciliter le dépôt de la levure dans les poumons de l&#39;animal (figure 3F). </li><li> Après la souris a été infectée, maintenir la souris dans un suivi, de l&#39;environnement chaud (température entre 25 et 37 ° C), soigneusement en utilisant une lampe chauffante si nécessaire, jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère de l&#39;anesthésie. Quand le réveil de la souris, c&#39;est revenir à une cage propre avec un accès ad libitum à la nourriture et l&#39;eau. Les cages sont retournés à notre animalerie et gardé dans une pièce les animaux purs (BLSI). </li></ol> 6. Études de survie <ol><li> Évaluer les animaux infectés et infectés cliniquement maquette de la tachypnée, léthargie, obnubilation et perte de poids. Les animaux doivent être vérifiées deux fois par jour par les membres de laboratoire et quotidiennement par les animaliers. </li><li> Avec l&#39;histoplasmose murin, jusqu&#39;à la fermeture à la fin de vie, il ya généralement aucun signe apparent de l&#39;infection autre qu&#39;une légère augmentation de la fréquence respiratoire. Avec la maladie est avancée, ce qui arrive habituellement de 10-11 jours, les souris deviennent significativement tachypnéique et ont une activité réduite. Typiquement, ils deviennent rapidement moribond et expirer. </li><li> Animaux en détresse doivent être euthanasiés de manière appropriée avec le CO 2 dans une chambre dédiée, les animaux décédés doivent être dénombrées quotidienne. </li></ol> 7. Études UFC, histologie et de cytokines <ol><li> Préparer 15 ml tubes coniques de 10 ml avec du PBS pour chaque organe à être collectées. </li><li> Euthanasier les animaux 7 et 14 jours après l&#39;infection avec un inuculum sublétaux (5,0 x 10 6) comme montré précédemment et retirez les poumons, la rate et le foie immédiatement. </li><li> Supprimer un morceau de l&#39;organe à être évalués et d&#39;effectuer la fixation dans le formol durant la nuit. Les sections seront examinés au microscope pour l&#39;évaluation pathologique. </li><li> Préparer des tubes de 50 ml conique avec 5mL de PBS complété avec 70 filtres de cellules um pour chaque organe à être homogénéisé. Laisser macérer chaque portion restante des organes séparément dans le tubes de 50 ml à l&#39;aide pistons de la seringue stérile de 5 ml. </li><li> Ensuite, diluer en série homogénats d&#39;organes (1:100, 1:1000 et 1:5000) et 100 ul de chaque dilution de la plaque sur gélose BHI-sang (2). </li><li> Ajouter comprimés inhibiteur de protéase à l&#39;homogénats conformément aux instructions du fabricant (Roche, Allemagne). </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C pour un maximum de 14 jours et UFC énumérer. </li><li> Centrifuger les homogénats d&#39;organes au 4000xg pendant 10 min et retirez surnageants orgue, whish sera utilisé dans utilisées dans les tests effectués cytokines par des méthodes standard selon le constructeur. </li></ol> 8. Protection anticorps monoclonal contre H. Capsulatum est dépendant de la spécificité des anticorps et Isotype <ol><li> MAb isotype est crucial dans la protection contre H. capsulatum, comme les souris traitées avec IgG1 ou d&#39;anticorps monoclonaux IgG2a Hsp60 ont survie significativement prolongée par rapport aux souris témoins recevant un mAb IgG2b d&#39;Hsp60 ou soit un isotype contrôle mAb ou PBS (figure 4). </li><li> En outre, chez les souris qui ont reçu des Acm de protection, il y avait une réduction significative du nombre de CFU pulmonaires et spléniques au jour 7 et diminue de 2 et 2,5 unités log de numéros de levure dans les poumons au jour 14 (figure 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Croissance de H. capsulatum et hybridomes. (A) la préparation liquide HAM F-12 de la culture d&#39;une seule colonie obtenus à partir de H. capsulatum cultivé sur une gélose BHI-sang. (B) la croissance des hybridomes dans des flacons de culture cellulaire et de purification mAb par la protéine A la chromatographie en résine / G affinité en utilisant. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: H. préparation de l&#39;inoculum capsulatum d&#39;infection intranasale. Suspension cellulaire obtenue après H. capsulatum perturbations agrégats par seringue et de centrifugation est énuméré par comptage dans un hématimètre. La concentration cellulaire est ajustée à 1,25 x 10 7 (expériences de survie) ou 5 x 10 6 (UFC, de cytokines et de l&#39;histologie) dans &lt;50 ul. upload/2532/2532fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figure 3 &quot;/&gt; Figure 3: la manipulation de la souris lors de mAb administration. (A) La souris est capté par la queue et (B et C) immobilisé par la tenue de la peau du cou aussi proche de theears. (D) La queue est tenue entre le petit doigt et de palme. (E) La solution est injectée mAb aide d&#39;une aiguille 26G1 / 2. (F) Le H. capsulatum inoculum est administré par voie intranasale par un léger pipetage la suspension cellulaire dans un nare. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4: MAbs d&#39;Hsp60 peuvent altérer la pathogenèse de l&#39;histoplasmose. injections ip avec 500 ug d&#39;IgG1, IgG2a ou mAb 2 h avant l&#39;infection à la survie significativement prolongée (p &lt;0,05, par rapport aux témoins), mais un mAb IgG2b. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5: UFC déterminations dans les poumons à 7 et 14 jours après un défi sublétaux intranasale avec des levures Hc 5x10 6 de souris traitées avec ip mAb choisi pour Hsp60 ou non pertinentes mAb a montré une réduction du fardeau fongique pour IgG1 et IgG2a mAbs animaux traités. Barres noires représentent UFC au jour 7 et barres blanches 14 jours post-infection (* p &lt;0,001 à 7 jours et ** p &lt;0,001 à 14 jours post-infection).

<ol>
	<li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide.">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li><li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77.">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li><li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum.">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li><li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi.">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. e. e. p. e., &amp;amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S., , ., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics.">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li></ol>

Le protocole présenté ici démontre que MAB à H. capsulatum peut modifier le cours de l&#39;histoplasmose expérimental murin. MAbs d&#39;antigènes de surface cellulaire des pathogènes peuvent modifier la dynamique complexe qui se produisent lors de l&#39;interaction entre un hôte et un agent pathogène. Cette étude établit que mAb intervenir dans la protection dans un modèle murin de l&#39;histoplasmose mortelles lorsqu&#39;elles sont injectées par voie intrapéritonéale, et il suggère protéines c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de la Matière </th><th> Société </th></tr><tr><td> Enceinte de sécurité biologique (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubes coniques </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> HAM F-12 moyennes </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C agitateur </td><td></td></tr><tr><td> Vortex </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubes coniques </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 aiguilles </td><td> BD </td></tr><tr><td> Seringue de 10 ml </td><td> BD </td></tr><tr><td> Flacons de 250 ml </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (Fast chromatographie liquide protéines) du système </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> Lecteur ELISA </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> Anesthésie (kétamine et xylazine) </td><td></td></tr><tr><td> Colonne stands </td><td></td></tr><tr><td> Cordes nylon </td><td></td></tr><tr><td> Lampe chauffante </td><td></td></tr><tr><td> Crépines cellules 70μm </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> Gélose BHI </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

passive administration of monoclonal antibodies against h. capsulatum and others fungal pathogens

Le but de l&#39;utilisation de cette méthodologie est 1) pour faire progresser notre capacité de protéger les individus avec un anticorps ou un vaccin pour prévenir ou traiter l&#39;histoplasmose causée par le champignon Histoplasma capsulatum et 2) d&#39;examiner le rôle des facteurs de virulence comme cible pour la thérapie. Pour générer des AcM, les souris sont immunisées, les réponses immunitaires sont évalués en utilisant une phase solide système ELISA développée dans notre laboratoire, et la meilleure souris répondeur sont sélectionnés pour l&#39;isolement de splénocytes pour la fusion avec des cellules d&#39;hybridome. Souris C57BL / 6 ont été largement utilisées pour étudier H. pathogenèse capsulatum et de fournir le meilleur modèle pour obtenir les données requises. Afin d&#39;évaluer le rôle des anticorps monoclonaux dans l&#39;infection des souris par voie intrapéritonéale sont administrés avec soit mAb à H. capsulatum ou isotype témoin apparié mAb puis infectées soit par voie intraveineuse (iv), intrapéritonéale (ip) ou intranasale (in) itinéraires. Dans la littérature scientifique, l&#39;efficacité des anticorps monoclonaux pour des infections fongiques chez la souris repose sur la mortalité comme un point final, en collaboration avec les unités formin colonie (UFC) des évaluations à des moments plus tôt. Survie (le temps de la mort) des études sont nécessaires car ils représentent le mieux la maladie humaine. Ainsi, l&#39;efficacité de notre intervention ne serait pas suffisamment établie sans courbes de survie. Cela est également vrai pour établir l&#39;efficacité du vaccin ou des tests de mutants de virulence. Avec l&#39;histoplasmose, les souris vont souvent d&#39;être énergique pour morte pendant plusieurs heures. La capacité d&#39;une intervention telle que l&#39;administration d&#39;un anticorps monoclonal peut d&#39;abord protéger un animal de la maladie, mais la maladie peut rechutes qui ne serait pas réalisé dans les expériences de courte UFC. En plus de la survie et des dosages charge fongique, nous examinons les réponses inflammatoires à l&#39;infection (histologie, le recrutement cellulaire, les cytokines). Pour la survie / heure aux expériences de mort, les souris sont infectées et surveillées au moins deux fois par jour pour des signes de morbidité. Afin d&#39;évaluer la charge fongique, l&#39;histopathologie, et les réponses des cytokines, les souris sont euthanasiées à divers moments après l&#39;infection. Les expérimentations animales sont réalisées selon les directives de l&#39;Institut d&#39;études des animaux de l&#39;Albert Einstein College of Medicine.

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Souris C57BL / 6 ont été utilisés pour étudier la pathogenèse Hc et de fournir le meilleur modèle. Nous explorons les avantages potentiels de l&#39;immunité humorale contre ce champignon et a généré plusieurs anticorps monoclonaux [à histone H2B et une protéine de choc thermique 60kDa] que nous avons testés pour leur efficacité protectrice après l&#39;administration par voie intrapéritonéale.

L&#39;administration passive d&#39;anticorps monoclonaux contre H. capsulatum Et autres pathogènes fongiques

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

11.8K vues.  Albert Einstein College of Medicine. Souris C57BL / 6 ont été utilisés pour étudier la pathogenèse Hc et de fournir le meilleur modèle. Nous explorons les avantages potentiels de l'immunité humorale contre ce champignon et a généré plusieurs anticorps monoclonaux [à histone H2B et une protéine de choc thermique 60kDa] que nous avons testés pour leur efficacité protectrice après l'administration par voie intrapéritonéale.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Recherche

Immunologie et infection

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Évaluation de l&#39;activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Transformation biolistique d&#39;un fluorescent Tagged Gene dans la opportuniste pathogène fongique<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

La génération d&#39;anticorps monoclonaux murins par Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Opsono-Adherence Test pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre les anthracis Bacillus et autres pathogènes encapsulés

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...