Cette recherche a été financée en partie par le Programme de recherche intra-muros de l&#39;Institut national du cancer.

1. L&#39;entretien de culture cellulaire de dormance et métastatique des lignées cellulaires tumorales <ol><li> Cultivez dormants (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) et métastatique des cellules tumorales (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) dans 10 des plaques de culture contenant du milieu cm Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) élevés de glucose et 10% de sérum fœtal bovin ( FBS) et des antibiotiques. Une fois que les cellules atteignent 70-80% de confluence, procéder à des dosages suivants. </li></ol> 2. Test de prolifération cellulaire des cellules tumorales dormantes (repos) et métastatiques (prolifération) en culture dans un système 3D-BME La culture de cellules dormantes / métastatique dans le système 3D <ol><li> Décongelez la croissance Cultrex facteur réduite Extrait de la membrane basale (BME) dans un réfrigérateur à 4 ° C une nuit avant d&#39;effectuer le dosage. Notez le BME doivent être manipulés sur la glace en tout temps. </li><li> Le lendemain, placer une plaque de 96 puits sur un plateau de glace à l&#39;intérieur d&#39;une hotte laminaire. Manteau chaque puits avec 50 100 pi de BME glacée en utilisant un distributeur avec une seringue. Assurez-vous qu&#39;aucun des bulles se forment dans les puits. Placer la plaque de 96 puits enduits de BME dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 30 minutes. </li><li> En attendant aspirer les médias à partir des cellules dormantes et ou métastatique des tumeurs (préparés à l&#39;article 1). Rincer les plaques de culture avec 10 ml de phosphate saline tamponnée, de pH 7,4 (PBS). Aspirer le PBS et ajouter 2 ml de trypsine préchauffé à 37 ° C, pour les plaques de culture. Incuber les plaques dans une atmosphère humidifiée à 5% 2 à 37 ° C, pendant 5 min. </li><li> Transfert des cellules dans un tube de 15 ml conique contenant 5ml de DMEM glucose supplémenté avec 10% de FCS et des antibiotiques et de compter les cellules. </li><li> Isoler le nombre total de cellules à être cultivées dans une centrifugeuse de culture tissulaire à une vitesse de 1500g, à température ambiante pendant 5 min. Dans nos essais nous préparons 2X10 3 cellules / puits pour chaque lignée cellulaire ou un point de temps pour être examiné. Toutefois, cela peut varier selon les lignées cellulaires utilisées. </li><li> Soigneusement aspirer le surnageant. Remarque, dans la plupart des cas, le culot n&#39;est pas visible. Par conséquent, laisser un peu les médias. Appuyez sur le fond du tube 15ml conique avec vos doigts afin de s&#39;assurer que la suspension des cellules individuelles est obtenue. Re-suspendre le culot avec du DMEM faible taux de glucose avec des antibiotiques supplémenté avec 2% de SVF BME + 2% (dosage de médias). 100 pi de la presse dosage doit être ajoutée pour tous les 3 2x10 cellules. Triturer les cellules de nombreuses fois avec une pipette de 5 ml pour s&#39;assurer que seule une suspension cellulaire est maintenue. </li><li> Assiette une 100 ul du mélange de cellules par puits sur le dessus de la plaque de 96 puits recouvert de BME. Pour l&#39;évaluation de fond (dans la section 2.8) plaque dans 100 ul par puits de plus que les médias d&#39;essai au-dessus des 96 plaque enduite ainsi BME. Incuber les plaques de culture 96 puits dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 à 37 ° C. Les cellules doivent être ré-alimentés tous les 4 jours avec les médias dosage. </li></ol> Test de prolifération: <ol start="8"><li> Test de prolifération des cellules: ajouter aux puits au moment voulu des points 20 ul du titre Cellule 96 aqueux Un kit de dosage Solution Cellulaire prolifération. Incuber dans un humidifié à 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C pendant 2h. Utiliser un dossier lecteur de plaque Elisa l&#39;absorbance à 490nm. Pour l&#39;évaluation et la soustraction de fond, ajouter 20 pi du titre Cellule 96 aqueux Un kit cellulaire Solution test de prolifération à des puits de pré enduits de BME et seulement superposées avec les médias dosage. Utiliser un dossier lecteur de plaque Elisa l&#39;absorbance à 490 nm. </li></ol> 3. La coloration par immunofluorescence pour des molécules de signalisation cellulaire dans le sommeil (au repos) des cellules tumorales et / ou métastatiques (prolifération) des cellules tumorales La culture de cellules dormantes / métastatique dans le système 3D pour la coloration immunofluorescence * Le protocole suivant est une modification d&#39;un protocole de culture 3D publié par Debnath J et al 18. <ol><li> Préparer BME comme décrit dans la section 2.1. Le jour suivant: place un système 8-chambre de lame de verre sur un plateau de glace à l&#39;intérieur d&#39;une hotte laminaire. Enrober chaque bien avec 50ul d&#39;glacée BME utilisant un Pipetman 200 pl. Assurez-BME est répartie uniformément et sans bulles se forment dans les puits. Placer la lame 8 chambre de verre revêtu d&#39;BME dans une atmosphère humidifiée à 5% 2 à 37 ° C pendant 20 min. </li><li> Récolte des cellules dormantes et ou métastatique de la section 1 et se préparer à la culture comme décrit dans la section 2.3 à 2.4. Collecter le nombre total de cellules à cultiver dans un tube de 15 ml conique. Nous préparons 5 x10 3 cellules / puits pour chaque lignée cellulaire et le point de temps pour être examiné. Isoler les cellules dans une centrifugeuse de culture tissulaire à une vitesse de 1500g, à température ambiante pendant 5 min. Aspirer le surnageant avec précaution. Notez que le culot n&#39;est pas visible; donc laisser derrière certains médias. Appuyez sur le fond du tube 15ml conique avec vos doigts pour s&#39;assurer que seule une suspension cellulaire est obtenue.Re-suspendre le culot avec les médias dosage. 400μl des médias dosage doit être ajoutée pour tous les 3 5x10 cellules. Triturer les cellules de nombreuses fois avec une pipette de 5ml. Cette étape est très important de s&#39;assurer que la suspension cellulaire unique est maintenu. </li><li> 400μl Plaque du mélange de cellules par puits sur le dessus de chacune des 8 chambres enduits de BME. Incuber la culture système 8 chambres lame de verre dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 à 37 ° C. Les cellules doivent être ré-alimentés tous les 4 jours avec les médias dosage. </li></ol> Immunofluorescence: <ol start="4"><li> Dans les points de temps souhaité, aspirer la couche supérieure de la presse et ajouter 200 ul du fixateur contenant du paraformaldéhyde à 4% (PFA), 5% de saccharose et 0,1% de Triton X-100 et incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Aspirer le fixateur et ajouter 200 ul de 4% PFA contenant 5% de saccharose et incuber à température ambiante pendant 25 minutes. </li><li> Aspirer le fixateur, ajouter 400 ul de tampon phosphate salin (PBS) à chaque puits. Incuber 10 minutes à température ambiante. Aspirer le PBS et ajouter 400 μ PBS contenant 0,05% de Tween 20 pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Bloquer les cellules fixées à température ambiante avec 200 ul d&#39;âne soit 10% de sérum ou avec 3% de BSA pour 1 heure (une solution de blocage à utiliser doit être déterminée empiriquement pour chaque anticorps primaire). </li><li> Aspirer la solution de blocage et ajouter 200 ul de l&#39;anticorps primaire (dilution doit être déterminée empiriquement pour chaque anticorps primaire doit être utilisé). Diluer l&#39;anticorps primaire dans le sérum d&#39;âne de 10% si 10% de sérum d&#39;âne a été utilisé pour bloquer ou de diluer l&#39;anticorps primaire dans de la BSA 3% si 3% de solution de BSA de blocage a été utilisé. Incuber avec l&#39;anticorps primaire nuit à 4 ° C. </li><li> Aspirer l&#39;anticorps, laver les puits avec 400μl de PBS pendant 15 minutes et répéter deux fois. Aspirer le PBS et ajouter 200 ul d&#39;âne anti-IgG conjugué respectifs-à la rhodamine rouge (dilution doit être déterminée empiriquement), couvre la diapositive 8 de chambre avec du papier aluminium et laisser incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver les puits avec 400μl de PBS (3x15 minutes à chaque lavage). Aspirer le PBS. Monté avec Vectashield milieu de montage avec le DAPI. Diapositives à sec pendant 40 minutes à température ambiante dans l&#39;obscurité. Les diapositives peuvent être conservés pendant 1 semaine à 4 ° C. Stocker les lames dans l&#39;obscurité. Image diapositives par microscopie confocale. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Un exemple d&#39;une analyse de la prolifération de la D2.0R et des cellules dormantes métastatique des tumeurs D2A1 dans la culture 3D est montré dans la figure 1A. Cellules dormantes sont D2.0R (au repos) à travers l&#39;ensemble de la période expérimentale de 14 jours de culture alors que les cellules hautement métastatiques D2A1 restent dormantes seulement pour quatre à six jours, après quoi ils commencent à proliférer. Pendant la phase initiale dormantes, de nombreuses cellules restent solitaires dans la culture en 3-D (figure 1B; jour 4) alors que d&#39;autres cellules non-proliférantes sous forme de sphéroïdes multicellulaires. La transition de D2A1 cellules à partir d&#39;un sommeil à l&#39;état prolifératif in 3-D de la culture (figure 1B; jour 12) est associée à des changements dramatiques dans la morphologie cellulaire. Par conséquent, ce test peut être utilisé pour tester ce facteur / s peuvent déclencher des cellules dormantes D2.0R de sortir de leur état ​​de dormance et ce facteur / s peut empêcher les cellules D2A1 à la transition de leur état ​​de dormance. Figure 2 est un exemple d&#39;un agent prévenir D2A1 cellules à la transition de dormant à un état prolifératif. Comme l&#39;illustre la figure 2, les traitements des D2A1 cellules avec un inhibiteur spécifique de la kinase chaîne légère de myosine (ML-7) maintenu D2A1 cellules dans un état ​​de dormance. Signalisation cellulaire dans les cellules dormantes et prolifèrent tumorales en culture dans le système 3D peut être étudiée par immunofluorescence pour des molécules de signalisation cellulaire. Comme l&#39;illustre la figure 3 une augmentation significative de la phosphorylation de la myosine chaîne légère dans D2A1 cellules (coloration rouge) suivi par une réorganisation des filaments d&#39;actine formant des fibres de stress d&#39;actine (coloration verte) se produit pendant leur transition de la dormance (1-4 jours) pour prolifération (jour 7). Toutefois, en bloquant la lumière myosine chaîne de l&#39;activité kinase dans les cellules par D2A1 shRNA ou médicament spécifique (ML-7) conserve D2A1 cellules dans un état ​​de dormance et se traduit par une inhibition de la phosphorylation de la myosine chaîne légère et la F-actine organisation des fibres de stress (figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" /> Figure 1. Modèle in vitro pour étudier solitaires de dormance des cellules tumorales et l&#39;interrupteur à la croissance métastatique. A) La prolifération des D2.0R dormantes et métastatique D2A1 en 3-D BME Cultrex, n = 8 (moyenne ± SE). Les résultats représentatifs de trois expériences (* p ≤ 0,05). B) des images de microscopie et de Lumière de D2.0R D2A1 cellules cultivées en 3-D x20 Cultrex agrandissement BME.Figure modifiée à partir de Barkan et al 17. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" /> Figure 2. Prévenir l&#39;interrupteur d&#39;D2A1 cellules de dormance (quiescence) à la prolifération dans le système de culture en 3D par l&#39;inhibition de kinase chaîne légère de myosine (MLCK). Évolution dans le temps des D2A1 prolifération cellulaire cultivée en 3-D BME Cultrex, n = 8 (moyenne ± SE). Les cellules ont été traitées (témoin), ou traités avec un inhibiteur spécifique de MLCK (ML-7, 5 uM) pendant 48 h sur commence 5 jours de culture. Figure modifiée à partir de Barkan et al 17. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" /> Figure 3. Phosphorylation chaîne légère de myosine suivi par F-actine au cours de réorganisation du commutateur d&#39;D2A1 cellules de la dormance à la croissance proliférative. D2A1 cellules ont été cultivées en 3-D BME Cultrex le 8 lame de verre chambre. Les cellules ont été fixées et colorées avec du DAPI (bleu) pour la localisation nucléaire, phalloïdine (vert) pour le F-actine et avec un anticorps contre la forme phosphorylée de la chaîne légère de myosine (MLC-p) (rouge), comme indiqué à divers moments. Fusion de la F-actine, et MLC-p coloration (jaune). Expression du MLC-P a été augmenté au cours de la transition des cellules de la dormance D2A1 (jours1-4) à la croissance proliférative (jour 7) suivie de la formation de fibres d&#39;actine stress (flèches). La microscopie confocale, grossissement x63. Blanc-bar est égal à 20 microns. Figure modifiée à partir de Barkan et al 17. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" /> Figure 4. . Inhibition de kinase chaîne légère de myosine (MLCK) médiée F-actine formation des fibres de stress dans les cellules D2A1 D2A1 cellules ont été traitées (témoin), ou traités avec des inhibiteurs de MLCK (ML-7, 5 M), pour 48 h le jour de début de la culture 5, ou traités avec des œufs brouillés ou MLCK shRNA et colorées pour la forme phosphorylée de la chaîne légère de myosine (MLC-p) (rouge), F-actine (vert), et des noyaux (bleu). Fusion de la F-actine, et MLC-p coloration (jaune). La microscopie confocale, grossissement x63. Blanc-bar est égal à 20 microns.

<ol>
	<li>Aguirre-Ghiso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models,+mechanisms+and+clinical+evidence+for+cancer+dormancy.">Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy.</a> Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).</li><li>Pantel, K., Woelfle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micrometastasis+in+breast+cancer+and+other+solid+tumors.">Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors.</a> J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffectiveness+of+doxorubicin+treatment+on+solitary+dormant+mammary+carcinoma+cells+or+late-developing+metastases.">Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases.</a> Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).</li><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Framework+models+of+tumor+dormancy+from+patient-derived+observations.">Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations.</a> Curr Opin Genet Dev. , (2010).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+solitary+mammary+carcinoma+cells+in+a+secondary+site:+a+possible+contributor+to+dormancy.">Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy.</a> Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).</li><li>Townson, J. L., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dormancy+of+solitary+metastatic+cells.">Dormancy of solitary metastatic cells.</a> Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proliferation-associated+molecules+in+individual+micrometastatic+carcinoma+cells.">Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).</li><li>Demicheli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+dormancy:+findings+and+hypotheses+from+clinical+research+on+breast+cancer.">Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).</li><li>Braun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer.">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).</li><li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+micrometastases.">Cancer micrometastases.</a> Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).</li><li>Goss, P. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+tumour+dormancy+offer+a+therapeutic+target.">Does tumour dormancy offer a therapeutic target.</a> Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).</li><li>Mendoza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung.">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+human+tumor+dormancy:+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype.">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment.">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).</li><li>Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+A+gatekeeper+in+the+transition+from+dormancy+to+metastatic+growth.">Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth.</a> Eur J Cancer. , (2010).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton.">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Morris, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+cell+lines+of+high+and+low+metastatic+potential+differ+not+in+extravasation+but+in+subsequent+migration+and+growth.">Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth.</a> Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).</li><li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis.">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les mécanismes sous-jacents qui maintiennent les cellules tumorales disséminées dans un état dormant ou le résultat de leur transition vers une croissance métastatique restent encore largement inconnus. Ce phénomène a été extrêmement difficile à étudier chez l&#39;homme et de quelques 4,12 modèles précliniques ont été développées pour résoudre ce problème. Néanmoins, certains systèmes in vivo et ex vivo du modèle de dormance tumorale ont été caractérisées (examin?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> DMEM glucose élevé </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM faible taux de glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td> Le facteur de croissance réduite en 3-D Extrait Cultrex membrane basale </td><td> Trevigen Inc </td><td></td><td> La concentration en protéines entre les 14-15mg/ml </td></tr><tr><td> D2.0R et D2A1 lignées cellulaires </td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2 et K7M2AS1.46 cellules </td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF-7 et MDA-MB-231 cellules de cancer du sein </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Un système de chambre de 8 lames de verre </td><td> (Lab-Tek, Thermo Scientific) </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td> Cellule Titer 96 aqueux Une cellule Solution test de prolifération kit </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield milieu de montage avec DAPI </td><td> Vector Laboratories Inc </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Normale du sérum d&#39;âne </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> Lecteur de plaque ELISA </td><td> Bio-Tec </td><td></td><td> 490nm enregistrement </td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Zeiss-LSM-510 </td><td></td><td> Grossissement x63 </td></tr></tbody></table>

an in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth

Récidive de cancer du sein, souvent suite à une longue période de latence dans laquelle il n&#39;ya aucun signe de cancer et les métastases ne peuvent pas devenir cliniquement apparents que plusieurs années après l&#39;enlèvement de la tumeur primaire et de la thérapie adjuvante. Une explication probable de ce phénomène est que les cellules tumorales ont ensemencé sites métastatiques, sont résistantes aux thérapies conventionnelles, et de rester en dormance pendant de longues périodes de temps 1-4. L&#39;existence de cellules cancéreuses dormantes sur les sites secondaires a été décrit précédemment comme quiescente cellules solitaires que ni prolifèrent, ni apoptose 5-7. De plus, ces cellules solitaires a été montré pour diffuser de la tumeur primaire à un stade précoce de 8-10 progression de la maladie et de résider en arrêt de croissance dans la moelle osseuse des patients, du sang et des ganglions lymphatiques 1,4,11. Par conséquent, la compréhension des mécanismes qui régulent la dormance ou le passage à un état prolifératif est essentielle pour la découverte de nouvelles cibles et des interventions pour prévenir la récidive de la maladie. Toutefois, démêler les mécanismes de régulation de l&#39;interrupteur de la dormance tumorale à la croissance métastatique a été entravée par le manque de systèmes de modèles disponibles. in vivo et ex systèmes modèle in vivo pour étudier la progression métastatique des cellules tumorales ont été décrits précédemment 1,12-14. Toutefois, ces systèmes n&#39;ont pas fourni de modèle en temps réel et dans un aperçu haut débit de façon mécaniste en ce qui déclenche l&#39;apparition de cellules tumorales dormantes solitaires à proliférer comme la maladie métastatique. Nous avons récemment développé un système in vitro en 3D pour modéliser les caractéristiques de croissance in vivo de cellules qui présentent soit dormants (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) ou prolifératives (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) le comportement métastatique in vivo. Nous avons démontré que les cellules tumorales qui présentent la dormance in vivo sur un site métastatique restent tranquilles quand elles sont cultivées dans un 3-dimension (3D) d&#39;extrait de membrane basale (BME), tandis que les cellules hautement métastatiques in vivo facilement proliférer en culture 3D après variable, mais relativement courte périodes de repos. Surtout en utilisant la 3D dans le système modèle in vitro, nous avons démontré pour la première fois que la composition ECM joue un rôle important dans la régulation si les cellules tumorales dormantes va passer à un état ​​prolifératif et ont confirmé dans des études in vivo 15-17. Ainsi, le système modèle décrit dans le présent rapport fournit une méthode in vitro de dormance tumorale et étudier le modèle de transition vers une croissance proliférative induite par le microenvironnement.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth at JoVE.com

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Une modification en 3-D in vitro du système est présenté dans lequel les caractéristiques de croissance de plusieurs lignées cellulaires tumorales dans la membrane basale reconstituée en corrélation avec le comportement en sommeil ou de prolifération de cellules tumorales dans un site métastatique secondaire<em&gt; In vivo</em&gt;.

Une In Vitro Système d&#39;étude dormance tumorale et le commutateur à la croissance métastatique

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

an-vitro-system-to-study-tumor-dormancy-switch-to-metastatic

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

15.7K vues.  University of Haifa. Une modification en 3-D in vitro du système est présenté dans lequel les caractéristiques de croissance de plusieurs lignées cellulaires tumorales dans la membrane basale reconstituée en corrélation avec le comportement en sommeil ou de prolifération de cellules tumorales dans un site métastatique secondaire In vivo.

Vidéo: An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

Utilisant la stimulation magnétique transcrânienne à l&#39;étude du système neuromusculaire de l&#39;homme

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Recherche

Médecine

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

La mesure et le traitement de répression dans l&#39;amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Mise en place d&#39;un modèle de xénogreffe humain de myélome multiple dans le poulet pour étudier la croissance tumorale, l&#39;invasion et l&#39;angiogenèse

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

L&#39;injection de cellules syngéniques murin de mélanome pour déterminer leur potentiel métastatique dans les Poumons

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

À l’aide de l’imagerie rétinienne pour étudier la démence

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Surgical Labyrinthectomy of the Rat to Study the Vestibular System

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including surgical or chemical labyrinthectomy and vestibular neurectomy. Surgical labyrinthectomy is a relatively simple, reliable, and rapid method. Here, we describe the surgical technique for rat labyrinthectomy. A postauricular incision is made under general anesthesia to expose the external auditory canal and the tympanic membrane, after which the tympanic membrane and the ossicles are removed without the stapes. The stapes artery, which is located between the stapes and the oval window, is a vulnerable structure and must be preserved to obtain a clear surgical field. A hole to fenestrate the vestibule is made with a 2.1-mm drill bur superior to the stapes. Then, 100% ethanol is injected through this hole and aspirated several times. Meticulous dissection under a microscope and careful bleeding control are essential to obtain reliable results. Symptoms of vestibular loss, such as nystagmus, head tilting, and a rolling motion, are seen immediately after surgery. The rotarod or rotation chair test can be used to objectively and quantitatively evaluate the vestibular function.

This protocol describes the surgical labyrinthectomy of a rat, which is a useful method for studying the vestibular system.

Labyrinthectomie chirurgicale du Rat pour étudier le système vestibulaire

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including ...

Protocole Tuina normalisé pour le modèle de compression Rat DRG

Analgesic Effect of Tuina on Rat Models with Compression of the Dorsal Root Ganglion Pain

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar disc herniation, spinal canal stenosis, and intervertebral foramen stenosis. Although Tuina, a traditional Chinese manual therapy, has shown analgesic effects in clinical practice for the treatment of neuropathic pain, its underlying neurobiological mechanisms remain unclear. Animal models are essential for elucidating the basic principles of Tuina. In this study, we propose a standardized Tuina protocol for rats with compression of the dorsal root ganglion (DRG), which involves inducing DRG compression by inserting a stainless steel rod into the intervertebral foramen, performing Tuina manipulation with specific parameters of location, intensity, and frequency in a controlled environment, and assessing the behavioral and histopathological outcomes of Tuina treatment. This article also discusses the potential clinical implications and limitations of the study and suggests directions for future research on Tuina.

Pleins feux sur l’auteur : Effet analgésique de la tuina sur des modèles de rats avec compression de la douleur ganglionnaire de la racine dorsale  

This article presents a manipulation for treating chronic compression of the dorsal root ganglion in rats using Tuina therapy, along with a method for evaluating its effectiveness based on pain behavior and histopathological results.

Effet analgésique du Tuina sur les modèles de rats avec compression de la douleur ganglionnaire de la racine dorsale

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar ...