Les auteurs ont rien à révéler.

1. Test clonogénique <ol><li> Préparer un seul suspensions de cellules de lignées de cellules de cancer du sein oestrogène-dépendante des cellules MCF-7 et T47D en suivant les étapes décrites ci-dessous <ol><li> Aspirer le milieu de culture (DMEM / 10% inactivé par la chaleur sérum de veau foetal / glutamine et pen / strep) à partir d&#39;une boîte de culture tissulaire de 10 cm qui est non confluentes de cellules MCF-7 ou les cellules T-47D plus de 50%. Rincer avec du PBS. Incuber avec de la trypsine 0,25% / 2,21 mM EDTA dissout dans du DMEM riche en glucose à 37 ° C pendant 1-4 min. </li><li> Voir les cellules à des intervalles de 1 min sous un microscope à contraste de phase pour garantir une répartition de la cellule unique. Remettre les cellules avec une pipette de 2 ml par aspiration et à plusieurs reprises de perturber contact cellule-cellule pour obtenir un statut de cellules presque invariable, unique. </li><li> Continuer à incuber les cellules dans la trypsine à 37 ° C pendant 4 min si vous observez des amas de cellules après seulement 2 min d&#39;incubation. Ne pas utiliser ces cellules pour des études clonogènes si elles restent adhérentes à l&#39;each autre bout de 4 min de la trypsine parce que l&#39;erreur sera introduit dans le rendement de nombre de colonie. NOTE: Si les cellules sont agglutinées, le nombre de colonies formées reflétera le produit de moins de cellules que le nombre incubés. Si les cellules sont trop trypsinisées, leur potentiel clonogénique peut être diminuée. </li><li> Préparer une suspension cellulaire unique de 1.500 cellules / ml de milieu de culture pour les plaques à 24 puits, ou moins, (+ 500 cellules / ml, en fonction du type cellulaire ou du nombre de passage), par des dilutions en série dans un tube principal contenant la totalité du volume nécessaire pour toutes les variables dans l&#39;expérience. NOTE: L&#39;objectif est une densité cellulaire finale de 800 cellules / cm 2 (gamme d&#39;environ 500 à 1100 cellules / cm 2). L&#39;objectif est de produire environ 100 + 50 colonies, qui permet le comptage relativement facile, empêche l&#39;encombrement et permet colonies suffisantes pour entraîner des différences statistiques significatives lorsque les colonies sont augmenté ou diminué de perturba expérimentaletions. </li></ol></li><li> Incuber les cellules à clonogénique densité en utilisant les étapes décrites ci-dessous <ol><li> Incuber les cellules dans des puits quadruples sur 24 plaques revêtues de fibronectine puits à une densité clonogénique de 1500 cellules / puits à partir d&#39;un seul tube de suspension de cellules de maître de 1500 cellules / ml. Triturer le milieu contenant des cellules avec une pipette de 5 ml en dressant 3 ml et 1 ml de milieu de distribution dans chacun des 2 puits. NOTE: fibronectine plaques doivent être achetés pré-revêtu d&#39;un fournisseur commercial. des plaques de revêtement à l&#39;extérieur d&#39;un contrôle de qualité, des résultats de processus automatisés dans une surface inégale inadapté pour ce dosage. </li><li> Mélanger la suspension par pipetage de haut en bas avec une pipette de 5 ml, dresser 3 ml de suspension cellulaire et remplir 2 puits avec 1 ml chacun. Remplissez seulement 2 puits à tout moment d&#39;une pipette. Retour le volume restant dans la pipette à la suspension de cellules dans le tube de maître, remettre les cellules à nouveau par aspiration et refoulement et d&#39;élaborer un autre 3 ml pour remplir une autre 2 wells avec 1 ml chacune. NOTE: Le mélange continu du tube de maître est nécessaire parce que les cellules seront en permanence sédimenter. Rédaction volume suffisant pour remplir seulement 2 puits est nécessaire d&#39;ajouter le nombre de cellules semblables à chaque puits parce que les cellules sédimentent dans la pipette ainsi. </li><li> Travaillez rapidement pour distribuer les grands volumes de cellules parce que les cellules permettant de siéger en suspension à la température ambiante et de la concentration de CO 2 va moduler leurs potentiels (observations non publiées) clonogéniques. </li><li> Optimiser la distribution spatiale des cellules pendant l&#39;acte d&#39;entre eux pipetage dans des puits pour des essais de la colonie. Faire par pipetage lentement la suspension contenant la concentration cellulaire finale dans le milieu du puits. Ne pas soumettre la plaque pour faire avancer le mouvement avant que les cellules se déposent au fond. Ne pas agiter la plaque parce mélange circulaire sera effectivement centrifuger les cellules à la périphérie du puits créant de fortes densités cellulaires et colonies confluentes innombrables à 6 jours. NOTE: Ne pas mélanger moins nécessaire car cela est moins souhaitable que pas de mélange du tout après l&#39;introduction du volume avec les cellules en suspension. Si il est nécessaire de mélanger des cellules, le faire en déplaçant la plaque avant et en arrière dans des directions perpendiculaires alors qu&#39;il repose sur une surface plane. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C 5% de CO 2, sans changement de support pour 6 jours. Le petit nombre de cellules dans un puits après six jours ne sera pas un impact significatif sur la composition en nutriments ou cytokine ni le pH du milieu d&#39;origine. </li><li> Concevoir le cours du temps de l&#39;analyse comme suit: incuber les cellules sur la fibronectine revêtu substrats le jour 1. Remplacer support existant avec 1 ml de milieu frais ou milieu frais contenant le FGF-2 10 ng / ml au jour 0. cellules tache sur la journée 6 ci-dessous en 1.4). Mener des perturbations expérimentales au jour 3, comme ci-dessous au point 1.3). </li></ol></li><li> Set Up perturbations expérimentales de signalisation moléculaire ou molécules d&#39;adhésion <ol><li> Au jour 3, ajouter 10056; l d&#39;une solution contenant de 10 fois la concentration finale voulue de l&#39;agent perturbateur au moyen de 1 ml dans les puits. Ne pas mélanger. Continuer à incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 3 jours. NOTE: les agents Perturber peut inclure une variété d&#39;inhibiteurs et des agents de blocage de molécules d&#39;adhésion, des récepteurs ou d&#39;autres protéines de surface, des inhibiteurs de voies intracellulaires de signalisation, des molécules, des facteurs, des cofacteurs ou des protéines structurelles, qui peuvent jouer un rôle dans le soutien de l&#39;état de dormance. </li><li> colonies de tache sur 6 jours, comme suit. </li></ol></li><li> Colonies de Stain <ol><li> les taches cellules après 6 jours de culture avec un cristal violette fraîchement préparé 0,1% dans l&#39;éthanol à 2% / borate de sodium 10 mM (pH 9,0) solution. Aspirer médias et ajouter une solution de cristal violet à une ml à chaque puits pendant 20 min. </li><li> Lavez assiettes en les immergeant avec les ouvertures de puits orientés vers le bas à un angle aigu dans un seau à glace débordant de robinet en continul&#39;eau dans l&#39;évier. Inclinez la plaque à un angle horizontal une fois sous l&#39;eau, et l&#39;ouverture vers le bas, puis inclinez revenir à un angle aigu lors du retrait dans un mouvement fluide douce. </li><li> Répéter l&#39;immersion deux ou trois fois jusqu&#39;à ce que l&#39;eau au fond des puits est plus bleue. Lavages vigoureux peuvent éliminer les cellules ou colonies qui sont moins adhérentes due à l&#39;intervention expérimentale, ajoutant de manière significative à l&#39;erreur dans le comptage et les données. </li><li> Plaques sécher pendant la nuit en les plaçant à l&#39;envers sur des serviettes sur la paillasse à côté de leurs couvertures marqué correspondant. </li></ol></li><li> Compter les colonies <ol><li> Comptez le nombre de colonies croissance et de dormance dans chaque puits après 6 jours d&#39;incubation, la coloration et le séchage. Compter les colonies de façon optimale à 40X dans un inversé microscope à contraste de phase. Compter les colonies de&gt; 30 cellules en culture et des colonies de 12 cellules ou moins, avec l&#39;aspect morphologique de très grande taille par rapport à la croissance de cellules, grande expacytoplasme DEMVSO avec grande cytoplasme au noyau rapports, présentés dans la figure 1 7,15. NOTE: Des grappes de 13-29 cellules ne sont pas normalement considérés comme ils ne sont pas très fréquents dans les essais de dormance simples. Ils peuvent être comptés si les perturbations se déplacent le potentiel de croissance ou soit des cellules dormantes croissance. Ces résultats devront ensuite être corrélé avec une signification biologique. </li></ol></li></ol> 2. clonogénique incubation d&#39;études immunofluorescence <ol><li> Ajuster le nombre de cellules à environ 7,500-8,000 cellules / puits dans des plaques à 6 puits, à correspondre à la cellule numéros / aire de surface analogue à des expériences 24 puits. </li><li> Placez un rond, stérile, lamelle de fibronectine dans chaque base ainsi des plaques de 6 puits pour les études d&#39;imagerie avant l&#39;addition de la cellule. Pipet cellules dans 3 ml volumes dans chaque puits 2 puits à la fois à des concentrations décrites, comme décrit pour les expériences clonogènes ci-dessus en 1.2). </li><li> Incuber les cellulespendant 6 jours, comme ci-dessus en 1.2.4 et 1.2.5. Ajouter facteurs perturbateurs sur trois jours à des concentrations de 10 x 300 pi de volumes, comme décrit dans les procédures d&#39;essai de colonie à 1,3). </li><li> cellules tache sur la journée 6 avec des anticorps à la cellule des molécules d&#39;adhésion comme les intégrines α4, α5, α6, β1, β3, par exemple, l&#39;adhésion focale molécules complexes FAK, paxillin et vinculine, par exemple, des protéines impliquées dans la motilité tels que α-tubuline, par exemple, de signalisation éléments de voie tels que la phospho-Akt, phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK, par exemple, ou toute autre protéine qui est la cible d&#39;une enquête pour son rôle dans la dormance, en utilisant des techniques standard pour direct ou indirect immunofluorescence. <ol><li> Retirer les lames avec une pince jour 6. Fix dans l&#39;acétone / méthanol 1: 1 à -20 ° C pendant 20 min et l&#39;air sec. Un fixateur de remplacement, tel que le paraformaldehyde, peuvent être utilisés, si nécessaire. Perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton X-100, le citrate de sodium à 0,1% pendant 2 min fou la détection d&#39;antigènes intracellulaires. Laver les cellules avec du PBS. </li><li> Pour la coloration de immunofluorecence indirect, les lames de bloc pendant 1 heure à température ambiante avec 5% de BSA ou avec 10% de sérum pré-immun de l&#39;espèce dans laquelle l&#39;anticorps secondaire a été généré. </li><li> Incuber une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires à la cellule des molécules d&#39;adhésion, des molécules complexes focaux, signalisation membres de la voie ou de toute autre protéine qui est la cible d&#39;une enquête pour son rôle dans la dormance dilué à dilutions spécifiques recommandées par le fabricant dans du PBS 0,1% de Triton X -100. </li><li> Laver 3 fois avec du PBS. Incuber lamelles avec des anticorps de fluorophore conjugué à la température ambiante pendant 2 heures. A titre d&#39;exemple, Alexa Fluor 488 âne anti-IgG de souris d&#39;anticorps peut être utilisé pour détecter des anticorps primaires monoclonaux de souris. Mont lamelles de côté cellule vers le bas sur des lames de verre à l&#39;aide d&#39;un agent de antifade avec Dapi. Sceller les périmètres avec du vernis à ongles. </li><li> Pour immunofluorescence directe, effectuer la BSAbloquant comme ci-dessus au paragraphe 2.4.2), incuber avec l&#39;anticorps primaire fluorophore conjugué nuit à 4 ° C. Laver 3 fois avec du PBS. Incuber les lames avec un agent de antifade et Dapi et joint avec du vernis à ongles. </li><li> Couverture plateaux coulissants avec une feuille d&#39;aluminium et conserver à 4 ° C pour l&#39;imagerie et la photographie à tout moment jusqu&#39;à plusieurs semaines plus tard. Voir et photographie cellules en utilisant des systèmes d&#39;imagerie microscopique fluorescence équipés d&#39;une caméra à 1,000x grossissement. </li><li> Pour la coloration de l&#39;actine fibrillaire, les lames de blocs dans 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) pendant 30 minutes et on incube dans BODIPY FL-phallacidine (vert) ou la rhodamine phalloïdine (rouge) à la température ambiante pendant 20 min. Ajouter un agent de antifade et sceller comme ci-dessus. </li></ol></li></ol> 3. clonogénique incubation pour les études moléculaires <ol><li> Western Blot <ol><li> Incuber ER + cancer du sein cellules MCF-7 ou T47D à des densités clonogéniques de 20.000 cellules / plaque de 60 mm et de 50 000 cellules / plaque de 100 mm sur fibronecrevêtu d&#39;étain plaques à 37 ° C dans 5% de CO2. </li><li> Incuber les cellules à des densités légèrement plus élevés de 75 000 cellules / plaque de 100 mm pour les études moléculaires nécessitant des quantités mg de protéines à partir de lysats. Utilisez jusqu&#39;à dix plaques par point expérimental pour recueillir suffisamment de protéines pour les études moléculaires en utilisant des empreintes occidentaux ou pour l&#39;isolation de l&#39;ARN pour des transferts de Northern. </li><li> Le nombre de cellules gel à base de chargement est un complément nécessaire pour comparer l&#39;expression des protéines dans les cellules de croissance et de dormance très différentes taille. Recueillir des cellules par trypsinisation et compter une aliquote dans un hémocytomètre dans 0,2% Trypan Bleu pour la préparation de lysats pour des transferts de Western lieu de racler les cellules avec une seule lame de bord. </li><li> Centrifuger les cellules à 10.000 g pendant 2 min, retirez les médias par aspiration, ajouter 200 tampon de lyse, soniquer les cellules dans un tampon de lyse et de déterminer la concentration en protéines. </li><li> Calculer la quantité de protéine par cellule en divisant le rendement de la protéine par le nombre de cellulesqui a généré ce montant. Charger le lysat dans chaque puits de gels de polyacrylamide séparées qui représente à la fois a) des quantités équivalentes de la protéine et b) des quantités de protéines représentant des nombres équivalents de cellules. Au moins 25 pg de protéine doit être chargé dans chaque puits. NOTE: Ce sera de permettre des comparaisons entre croissance et de dormance des cellules, qui sont significativement différents en taille et en teneur en protéines (figure 1). </li></ol></li><li> Cytométrie en flux <ol><li> Recueillir des cellules de plaques de 100 mm par trypsinisation, comme en 3.1 et d&#39;analyser par cellulaire activé par fluorescence tri standard (FACS) en utilisant des protocoles coloration par immunofluorescence primaire ou secondaire pour des antigènes intracellulaires ou extracellulaires, comme indiqué dans 2.4. REMARQUE: Retrait de cellules à partir de plaques de culture tissulaire par traitement à la trypsine n&#39;a pas d&#39;incidence sur la concentration des protéines membranaires, comme déterminé par marquage de l&#39;anticorps. </li></ol></li></ol>

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E., Hameed, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-ordinate+loss+of+FGF-2+and+laminin+5+expression+during+neoplastic+progression+of+mammary+duct+epithelium.">Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium.</a> Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).</li><li>Wieder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+basic+fibroblast+growth+factor+in+MCF-7+human+breast+cancer+cells:+lack+of+correlation+between+inhibition+of+cell+growth+and+MAP+kinase+activation.">Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation.</a> J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).</li><li>Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+release+of+basic+fibroblast+growth+factor+from+human+bone+marrow+cultures+as+a+biologically+active+complex+with+a+phosphatidylinositol-anchored+heparan+sulfate+proteoglycan.">Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan.</a> J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).</li><li>Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+stimulates+myelopoiesis+in+long-term+human+bone+marrow+cultures.">Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures.</a> Blood. 77 (5), 954-960 (1991).</li><li>Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblast+heparan+sulfate+is+required+for+cytokine-mediated+ex+vivo+maintenance+of+human+long-term+culture-initiating+cells.">Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells.</a> Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).</li><li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyl+transferase+inhibitor+treatment+of+breast+cancer+cells+leads+to+altered+RhoA+and+RhoC+GTPase+activity+and+induces+a+dormant+phenotype.">Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype.</a> Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).</li><li>Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+confers+a+more+differentiated+phenotype+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells.">Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes &amp; Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+dormant+estrogen-dependent+breast+cancer+micrometastases+by+bone+marrow+stromal+injury+in+an+in+vitro+model+of+dormancy.">Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy.</a> Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , (2014).</li></ol>

Soutenu par le ministère de la Défense subventions DAMD17-01-C-0343 et DAMD17-03-1-0524, la Commission d&#39;État du New Jersey sur la recherche sur le cancer 02-1140-CCR-E0 et le Mémorial Goldberg Ruth Estrin for Cancer Research (RW)

Notre modèle se compose de plusieurs éléments essentiels de dormance dans la moelle osseuse. Il se compose d&#39;oestrogènes des cellules sensibles, qui sont du type susceptible de rester en sommeil dans la moelle pendant des périodes prolongées 10, il se compose de la fibronectine, un élément structurel clé de la moelle, le FGF-2, un facteur de croissance abondamment synthétisée par le stroma de la moelle osseuse et fortement déposé dans la matrice extracellulaire de la moelle osseuse et 31...

des cellules de cancer du sein à métastases de la moelle osseuse avant que la maladie est détectable 1, dès que les tumeurs se développent de petits vaisseaux sanguins 2,3. Le processus métastatique est rapide, mais inefficaces. Cellules entrent dans les nouveaux vaisseaux sanguins rapidement, à des millions par jour 4 mais peu survivent au voyage à des organes éloignés 5. Néanmoins, certains micrométastases survivre dans l&#39;os et peuvent être trouvés comme des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans les ponctions de moelle osseuse de patients nouvellement diagnostiqués 1. Ces cellules résistent à la chimiothérapie adjuvante, qui est administré par l&#39;objet même de les éliminer 6. Cette résistance est dotée, sensiblement, par la survie de signalisation initiée par les interactions avec le microenvironnement de la moelle osseuse 7,8. Micrométastases peuvent être trouvés dans environ un tiers des femmes atteintes du cancer du sein localisé et représentent un indicateur indépendant de survie lorsqu&#39;il est analysé par analyse univariée 9. Certains micrometastases sont la croissance amorcée, mais les schémas de récidive dépendent du type de cellule. Les patients atteints de cancer du sein triple négatif ont tendance à réapparaître entre 1 à 4 ans, ce qui suggère un mauvais contrôle de l&#39;état de dormance. Autres types de cellules, y compris ER / PR + cellules, peuvent rester en dormance pendant jusqu&#39;à 20 ans, avec un taux stable et continu de récidive 10. Alors que les différences de dormance signatures d&#39;expression génique entre ER + et RE- lignes et les tumeurs des cellules mammaires reflètent différents potentiels de dormance 11, les interactions avec le stroma de la moelle osseuse représentent probablement une contribution significative à la dormance. L&#39;étude de dormance in vivo est exceptionnellement difficile parce micrométastases sont rares et sont plus nombreux que les cellules hématopoïétiques de plus de 10 6 -fois. Par conséquent, les modèles concernés doivent être générés qui fournissent des données in vitro qui peuvent proposer des mécanismes et générer des hypothèses testables in vivo. Un certain nombre de modèles de dormance, y compris mathe12,13 matiques modèles, des modèles in vitro, in vivo 7,8,14,15 modèles de xénogreffe, des combinaisons de 16 in vitro et des modèles de xénogreffes 17,18 et modèles spontanés de métastases tumorales et 19, ont donné un aperçu de la dormance des cellules cancéreuses 20 . Chacun de ces modèles ont leurs propres limites et sont d&#39;eux-mêmes principalement utile pour générer des hypothèses en ce qui concerne la signalisation moléculaire et interactions qui régissent la dormance à tester dans des modèles plus biologiquement pertinentes. Avec l&#39;objectif général de définir les mécanismes moléculaires de la dormance, les interactions avec le microenvironnement qui se traduit par l&#39;arrêt du cycle, redifférentiation et de résistance et mécanismes thérapeutique qui résultent de la récidive dans ER + cellules, nous avons développé un modèle in vitro qui fournit sélectionné les éléments pertinents de la microenvironnement stromal 7. Ce modèle, bien que relativement rares dans sa composants, est suffisamment robuste pour permettre aux enquêteurs de déterminer des mécanismes moléculaires spécifiques qui affectent les fonctions importantes de dormance. Ces expériences génèrent des hypothèses qui peuvent être directement testés in vivo. Le modèle repose sur quelques éléments clés que nous avons démontré pour être pertinent dans la dormance. Elles comprennent l&#39;utilisation de cellules de cancer du sein oestrogéno-dépendants, la culture de cellules à une densité clonogénique où leur interaction est principalement avec le substrat et les composants solubles du milieu, un substrat de la fibronectine et de la présence de facteur de croissance basique des fibroblastes (FGF-2) dans le milieu. Nous avons caractérisé les mécanismes qui régissent le système in vitro, y compris l&#39;induction de l&#39;arrêt du cycle cellulaire par le FGF-2 21, à médiation par 22 le TGFß, la survie par l&#39;intermédiaire de signalisation PI3 kinase ERK 7,8 et 8 et de la différenciation morphogénétique à un phénotype épithélial, qui dépendait RhoA inactivation, l&#39;intégrine45; 5β1 régulation à la hausse et la ligature de stroma pour la survie de la fibronectine 7,15 (Figure 1). Les effets du cycle cellulaire in vitro de FGF-2 sur les cellules MCF-7 commencent à des concentrations d&#39;au moins un log-dessous de 10 ng / ml 21,23. Le raisonnement était basé sur le contrôle temporel de FGF-2 expression régissant mammaire morphogenèse canalaire, l&#39;expansion cyclique et la récession dans un certain nombre de systèmes de mammifères 24-27. Nous avons démontré que le FGF-2 induit la différenciation, y compris la morphogenèse canalaire in culture 3D 28, et que le FGF-2 expression sont généralement perdue avec la transformation maligne des tumeurs humaines 29. L&#39;expression de FGR1 resté intact dans les carcinomes mammaires interrogés 29 et MCF-7 cellules continuer à exprimer les 4 récepteurs FGF 30. Dans le contexte de la dormance, FGF-2 est exportée par et fortement déposée sur stroma de moelle osseuse 31,32 où il fonctionne dans le maintien de cellules souches hématopoïétiques 33. Nous demtré que le FGF-2 induit un état ​​de dormance dans ER + cancer du sein cellules cultivées sur la fibronectine substrats, également abondants dans la moelle osseuse, où il induit la différenciation morphogénétique 7. Dans le modèle, les cellules de cancer du sein sont la croissance inhibée, Rho A à inactiver le RhoGAP GRAF, pour redifférencier un phénotype épithélial et ré-exprimer des intégrines lost avec la progression maligne. Ils se lient à travers la fibronectine intégrine α5β1 et d&#39;activer la survie de signalisation qui les rendent résistantes à la thérapie cytotoxique 7,8,15 (figure 1). Inhibition de GTPases Rho de classe a été démontré précédemment pour induire un phénotype dormant 34. Ici, nous allons décrire les procédures spécifiques qui permettront aux enquêteurs d&#39;établir le modèle et étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires spécifiques régissant la dormance des cellules ER + cancer du sein. Dans les expériences présentées ici pour illustrer l&#39;utilisation du modèle, Nous avons ciblé la voie de la PI3K (figure 1B) avec un inhibiteur de l&#39;Akt et un inhibiteur de la PI3K et de tous les membres de la famille Rho (figure 1B) avec un inhibiteur pan-Rho et un Rho kinase (ROCK) inhibiteur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T47D cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well tissue culture plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>50-013-PB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Serum Source International</td>
			<td>FB02-500HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 100x, Liquid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF&#160;basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>234-FSE-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>124005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002&#160;</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>19-142</td>
			<td>Chenical PI3K inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C3 transferase&#160;</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>CTO3</td>
			<td>Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>129830-28-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY FL-Phallacidin (green)&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>B607</td>
			<td>Fluorochrome for fibrillar actin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R415</td>
			<td>Fluorochrome for fibrillar actin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R37114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro dormancy model of estrogen-sensitive breast cancer in the bone marrow: a tool for molecular mechanism studies and hypothesis generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

<html> Des expériences ont été menées afin de récapituler l&#39;essai. L&#39;évolution dans le temps de l&#39;expérience est représenté sur la figure 2A. Les cellules sont incubées à une densité clonogénique le jour -1, FGF-2 dans un milieu frais est ajouté au jour 0 et les cellules sont cultivées jusqu&#39;au jour 6 quand ils sont colorés et les colonies sont comptées. Tous les perturbations du système sont administrés au jour 3 dans des volumes de 100 pi à 10x concentrations finales...

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An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Une<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle dormance du cancer du sein sensible aux œstrogènes dans la moelle osseuse: un outil pour les études de mécanisme moléculaire et Hypothèse Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

8.2K vues.  Rutgers New Jersey Medical School. We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo. 

Vidéo: An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Une In Vitro Système d&#39;étude dormance tumorale et le commutateur à la croissance métastatique

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Recherche

Médecine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modale d&#39;imagerie de l&#39;angiogenèse dans un modèle de rat nu des métastases osseuses du cancer du sein par imagerie par résonance magnétique, la tomodensitométrie et volumétrique ultrasons

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Dépistage du mélanome Modificateurs l&#39;aide d&#39;un modèle de tumeur Zebrafish Autochtone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Utilisation quantitative PCR en temps réel pour déterminer prise de greffe de donneurs de cellules dans un modèle murin concurrentiel greffe de moelle osseuse

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de l&#39;AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Fémorale aspiration de moelle osseuse chez des souris en direct

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

L&#39;utilisation de l&#39;essai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...