Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH et de R01DA021194 R01NS058850.

1. La préparation de tranches de cerveau <ol><li> Jeunes (15-40 jours) mâles et femelles Sprague-Dawley sont utilisés. (Nous utilisons également ce même protocole chez la souris.) Sous anesthésie profonde uréthane, les animaux sont décapités et le cerveau est rapidement disséqué. Puis de 300 um d&#39;épaisseur des tranches de cerveau contenant la partie coronale midrostral du locus niger sont coupés sur une vibratome Leica (VT-1200S). La tranche de coupe procédure est effectuée dans une glace froide, saccharose oxygénée couper solution contenant (en mm): 220 de saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO3, 0,5 CaCl2, MgCl2 7, 10 D- glucose. Il fait barboter avec un mélange de 95% de CO O 2 / 5% 2 pour garder oxygénée et maintenir le pH à 7,4. Conserver la solution de coupe glacée pendant toute la procédure. </li><li> Les tranches de cerveau sont incubés dans une chambre d&#39;incubation rempli d&#39;un liquide céphalo-rachidien oxygénée artificiel (ACSF) contenant (en mM): 125 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO3, 2,5 CaCl2, 1,3 MgCl 2, 10 D-glucose. Il fait barboter avec un mélange de 95% de CO O 2 / 5% 2 pour garder oxygénée et maintenir le pH à 7,4. La température d&#39;incubation est de 34 ° C pendant 45 min puis à température ambiante jusqu&#39;à ce que la tranche de cerveau est transférée à la chambre d&#39;enregistrement. </li></ol> 2. Empreintes électrophysiologique des neurones nigrales <ol><li> Une tranche de cerveau est transféré à une chambre d&#39;enregistrement patch clamp continuellement perfusées avec le aCSF oxygénée à 32 ° C. </li><li> Pipettes de patch sont retirés de l&#39;autoclave borosilicate (KG-33) tube capillaire en verre (1,10 mm di, 1,65 mm de diamètre extérieur, le roi de précision en verre, de Claremont, Californie) à l&#39;aide d&#39;un tire-PC-10 (Narishige, Tokyo, Japon) et rempli de solution intracellulaire préparés avec de la DNase-eau sans RNase (Fisher Scientific) (contenant 135 mM de KCl, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl 2, pH ajusté à 7,3). Les pipettes de patch ont des résistances de 2-3 MQ dans le bain. </li><li> La substantia nigra est identifié en fonction de sa localisation anatomique distincte (Fig. 1A1-2). Sous la direction visuelle d&#39;un microscope vidéo (Olympus BX51W1) équipé d&#39;une optique Nomarski et 60X objectif à immersion d&#39;eau, de grandes cellules dans la substance noire pars compacta (SNC) et la substantia nigra pars reticulata (SNR) (possible neurones DA et les neurones GABA) sont sélectionnés pour l&#39;enregistrement. Conventionnel giga-ohms étanchéité configuration cellule entière est obtenue (Fig. 1B1). Courant analyses pince de serrage et de tension peut être effectuée. Afin de minimiser la dégradation de l&#39;ARNm, l&#39;enregistrement électrophysiologique doit être brève (≤ 5 min). Une option consiste à enregistrer seulement la membrane et les propriétés de dopage de fournir des empreintes digitales électrophysiologiques pour les neurones des intérêts (Fig. B2-3). Cet enregistrement ne prend que brève environ 1 min. </li></ol> 3. L&#39;aspiration Cytoplasme <ol><li> Après les empreintes digitales et la caractérisation électrophysiologique des neurones GABA et SNr DA, la bouche d&#39;aspiration douce est appliquée pour aspirer le cytoplasme. Le noyau de la cellule peut aussi être aspiré, résultant de la contamination d&#39;ADN génomique. L&#39;étanchéité ne doit pas être brisée; les débris contraire extracellulaires dont l&#39;ARNm peut être aspiré dans la pipette de patch et de contaminer le contenu de la cellule. L&#39;intégrité de l&#39;étanchéité est bonne tant que l&#39;augmentation du courant de maintien à -70 mV ne dépasse pas 100 pA. </li><li> Ensuite, le contenu de la cellule aspiré est expulsé dans un tube de 0,2 ml par PCR en cassant la pointe de la pipette et une faible pression positive. Un contenu cellulaire est recueilli dans un tube PCR. Après avoir accepté le contenu de la cellule, le tube collecteur PCR, pré-refroidi sur la glace, est immédiatement placé dans un congélateur à -20 ° C. </li><li> Afin d&#39;exclure la contamination de débris extracellulaires qui peuvent contenir des ARNm, la pipette de patch est descendue dans le tissu sans réellement aspirer le cytoplasme, puis le contenu de la pipette est soumis à la RT-PCR. </li></ol> 4. La transcription inverse (RT) <ol><li> Après avoir recueilli le contenu des cellules à partir d&#39;un nombre raisonnable de neurones, habituellement 10-20, RT devrait commencer immédiatement pour minimiser la dégradation des ARNm. </li><li> Puisque la quantité de contenu de la cellule à partir d&#39;un seul neurone est trop petit, la procédure d&#39;isolement d&#39;ARN n&#39;est pas effectuée. Pour retirer l&#39;ADN génomique contaminant potentiels, le contenu de la cellule aspiration est d&#39;abord digéré par la DNase I (5 uL DNase I et 1,6 uL de tampon DNase I, 5 min à 25 ° C). Puis DNase I est inactivé par addition de 1,2 uL 25 mM d&#39;EDTA et incubation à 75 ° C pendant 5 min. </li><li> L&#39;ADNc est synthétisé en utilisant l&#39;exposant III de la transcriptase inverse des cellules à base-Direct kit de synthèse d&#39;ADNc (Invitrogen, tableau 1). Premier volet d&#39;ADNc est synthétisé à 50 ° C pendant 50 min, puis la réaction est inactivée par incubation à 85 ° C pendant 5 min et 1 ul RNase H est d&#39;ajoutered à digérer ARNm (37 ° C pendant 20 min.) L&#39;ADNc simple brin est stocké à -20 ° C pour l&#39;amplification PCR tard. </li><li> L&#39;élimination complète de l&#39;ADN génomique est vérifiée par RT-moins de contrôle dans lequel la transcriptase inverse est omis alors que tous les composants de la réaction d&#39;autres ont été exactement les mêmes. </li></ol> 5. Deux stade de l&#39;amplification par PCR <ol><li> Des amorces ont été conçues selon les séquences dans GenBank. Autant que possible, intron s&#39;étend paires d&#39;amorces ont été utilisées qui permettent de détecter la contamination d&#39;ADN génomique. La paire d&#39;amorces de séquences sont répertoriées dans le tableau 2. L&#39;efficacité des paires d&#39;amorces doivent d&#39;abord être vérifié par les ARNm ensemble du cerveau qui produisent des produits positifs. Toutes les amorces sont synthétisées par Integrated DNA Technologies (Cedar Rapids, Iowa, Etats-Unis). </li><li> Dans la première phase, 5 ul de l&#39;ADNc 30 uL est amplifié pendant 35 cycles en présence du couple d&#39;amorces (tableau 2). Le protocole de cyclage thermique du thermocycleur (Mastercycler, Eppendorf, tableau 1) est de 2 min à 94 ° C pour la dénaturation initiale, puis 35 cycles de 15 s à 94 ° C pour dénaturer, 30 s à 55 ° C à recuire, et 45 s à 72 ° C afin de prolonger, suivis de 7 min pour une extension finale. Taq ADN polymérase, désoxynucléotides triphosphates (dNTPs), et tous les autres éléments nécessaires à l&#39;amplification par PCR sont fournis par un mélange PCR super (Invitrogen, tableau 1) </li><li> Dans la deuxième étape de PCR, le produit de 1 pl de la 1 ère étape d&#39;amplification PCR est utilisé comme modèle et la paire d&#39;amorces même que celui utilisé dans la première étape est utilisé (tableau 2). 40 cycles sont organisées avec le temps d&#39;extension réduite à 30 s. Le même PCR Super Mix est utilisé. </li><li> Les produits de PCR de l&#39;amplification 2 ème étape sont séparés par électrophorèse sur gel d&#39;agarose 2,5%, visualisée par le bromure d&#39;éthidium (0,05 mg/100 ml de gel) ou gelgreen sous lumière UV, et photographié (fig. B4). Les bandes positives sont ensuite découpés, extraits en utilisant un kit d&#39;extraction Qiagen (tableau 1) et séquencé et comparé avec les séquences publiées des gènes cibles. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: La dopamine (DA) des neurones dans le substantia nigra pars compacta et pars reticulata et les neurones voisins de projection GABA dans la substantia nigra pars reticulata ont distinctes caractéristiques électrophysiologiques (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011).. Comme le montre la Fig. 1B2, SNR neurones GABA présentent dopage à haute fréquence spontanée autour de 10 Hz. Les pics ont une durée de base d&#39;environ 1 ms. Sur hyperpolarisante injection de courant, SNR neurones GABA afficher un affaissement faibles dépolarisants en réponse à hyperpolarisante injection de courant, indiquant une faible expression du courant I h dans ces neurones (fig. 1B2). En revanche, les neurones DA nigrales présentent des basses fréquences (autour de 2 Hz) des pointes spontanées qui ont une durée de base autour de 3 ms. Neurones DA montrent également qu&#39;un affaissement prononcé en réponse à hyperpolarisante injection de courant, indiquant une forte expression de I h de courant (Fig. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011). SCRT-PCR détecté l&#39;ARNm pour l&#39;acide glutamique décarboxylase 1 (GAD1, l&#39;enzyme clé pour la synthèse de GABA et un marqueur de neurones GABA) dans électrophysiologique des neurones identifiés SNr GABA, mais pas dans les neurones DA (fig. 1B4, 5). En revanche, les SCRT-PCR détecté l&#39;ARNm de la tyrosine hydroxylase (TH, enzyme clé pour la synthèse de dopamine et un marqueur de neurones DA) en électrophysiologie identifié SNC et SNr neurones DA, mais pas dans les neurones GABA (fig. 1B4, 5). Alors SCRT-PCR résultats confirment l&#39;identification de neurones électrophysiologiques. Ensuite, SCRT-PCR a été utilisé pour le profil de l&#39;expression de la tension sous-unités activées KV3 canal, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4. Ces sous-unités contribuent à former voltage-dépendants canaux K + de propriétés diverses selon la composition sous-unité (Ding et al. 2011). Dans l&#39;exemple SNr GABA neurone Fig. 1B4, ARNm de Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés. Dans l&#39;exemple SNr DA neurone indiqué dans Fig.1B5, seulement Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés. Dans nos données en commun, Kv3.1 a été plus fréquemment détectés dans les neurones GABA SNr que dans les neurones DA nigrales, indiquant un niveau élevé d&#39;expression des Kv3.1 dans les neurones rapide dopage SNr GABA (Ding et al. 2011). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" /> Figure 1. Identification électrophysiologique des neurones GABA SNr et nigrales neurones DA A:.. Les zones nigrales peuvent être identifiés par leur localisation anatomique distincte A1 indique l&#39;emplacement de la SNC et SNR dans une coronale Nissl teinté section capturé avec un objectif 1X. La zone encadrée est CAPTURED avec un objectif 10X et affiché dans le milieu, comme indiqué par la flèche. La SNC-cellulaire riche et pauvre en cellules SNR sont clairement visibles. A2 indique l&#39;emplacement de la SNC et SNR en direct, coupe coronale non colorées capturées avec un objectif 4X. La SNC-cellulaire riche et pauvre en cellules SNr sont aussi clairement identifiables. VTA, l&#39;aire tegmentale ventrale. B1 montre un SNR GABA neurone pièce étant serrée dans la cellule entière mode. B2 montre les propriétés typiques électrophysiologiques des neurones GABA SNr en mode pince enregistrement en cours. Ces incendies spontanés neurones potentiels d&#39;action à haute fréquence de courte durée et ont une faible réponse, je sag h à médiation hyperpolarisante injection de courant. B3 montre typique de propriétés électrophysiologiques des neurones DA nigrales en mode pince enregistrement en cours. Ils incendie spontané à faible fréquence de potentiels d&#39;action de longue durée et ont un éminent I h à médiation affaissement (tête de flèche) réponse à hyperpolarisante injection de courant. Ainsi, SNR neurones GABA et les neurones dopaminergiques nigrales sont clairement identifiés électrophysiologique. B4 montre une image du gel des SCRT-PCR à partir d&#39;un neurone électrophysiologiques identifié SNr GABA. Glutamate décarboxylase 1 (GAD1) ​​mais pas de l&#39;ARNm de la tyrosine hydroxylase (TH) ARNm a été détecté. ARNm de Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés dans ce neurone SNr GABA. B5 montre SCRT-PCR de détection des ARNm de canal neuronale KV3 dans un neurone SNr DA. ARNm TH mais pas l&#39;ARNm GAD1 a été détecté dans une électrophysiologique des neurones identifiés SNr DA. ARNm de Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés dans cette SNr DA neurone. B6 montre les données regroupées. 7. Potentiel de faux négatifs et de faux résultats positifs Basé sur notre expérience, plusieurs facteurs peuvent conduire à des faux négatifs SCRT-PCR. Ces facteurs comprennent l&#39;échec de l&#39;aspiration quantité suffisante du cytoplasme à cause de colmatage pointe de la pipette de patch, la contamination de RNase, et inefficace amorces de PCR. Colmatage Patch pointe de la pipette en général peut être vu sur le moniteur vidéo et indiqué par un accès accru de résistance. Contamination de RNase peuvent être évités par la désactivation complète et porter des gants. L&#39;efficacité d&#39;amorces PCR doivent être testés en utilisant l&#39;ARN total à partir d&#39;un tissu cérébral poinçon (Zhou et al 2008;.. Ding et al 2011). Depuis que nous utilisons toujours la DNase d&#39;abord traiter nos échantillons avant la RT, nous n&#39;avons pas rencontré de faux résultats positifs. Théoriquement, sans digestion par la DNase, la contamination d&#39;ADN génomique et donc fausse détection positive peut se produire lorsque le gène est intron ou la paire d&#39;amorces ne couvre pas la région intron.

<ol>
	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La combinaison de l&#39;enregistrement de patch clamp en tranches de cerveau avec des SCRT-PCR, nous avons démontré ici fournissent une excellente méthode pour étudier les profils d&#39;expression d&#39;ARNm pour les canaux ioniques, récepteurs et des enzymes clés de la synthèse des neurotransmetteurs dans les neurones individuellement caractérisés. Ceci est particulièrement utile lorsque la protéine en question ne peuvent être détectées et localisées à l&#39;aide d&#39;autres méthodes telles que l&#39;...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tableau 1" /> Réactifs clés Tableau 1. Et de l&#39;équipement <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tableau 2" /> Tableau 2. Paires d&#39;amorces pour le rat neuronale KV3 canal, la tyrosine hydroxylase (TH) et l&#39;acide glutamique décarboxylase 1 (GAD1) ​​ARNm de SCRT-PCR

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

Dans le système nerveux central des mammifères, les différents types de neurones avec diverses caractéristiques moléculaires et fonctionnelles sont entremêlés les uns avec les autres, difficiles à séparer et également pas facilement identifiables par leur morphologie. Ainsi, il est souvent difficile d&#39;analyser l&#39;expression génique dans un type de neurone spécifique. Ici, nous documenter une procédure qui combine les techniques de la cellule entière patch clamp enregistrement avec une seule cellule de réaction transcription inverse polymérase (SCRT-PCR) pour le profil d&#39;expression d&#39;ARNm dans différents types de neurones dans le locus niger substantielle. Les techniques électrophysiologiques sont d&#39;abord utilisés pour enregistrer les propriétés neurophysiologiques et fonctionnelle des neurones individuels. Ensuite, le cytoplasme des neurones seule électrophysiologiquement caractérisé nigrales est aspiré et soumis à des SCRT-PCR pour obtenir des profils d&#39;expression d&#39;ARNm des enzymes de synthèse de neurotransmetteurs, les récepteurs et canaux ioniques. La sélectivité et une sensibilité élevées rendent cette méthode particulièrement utile lorsque l&#39;immunohistochimie ne peut pas être utilisée en raison d&#39;un manque d&#39;anticorps approprié ou le niveau faible expression de la protéine. Cette méthode est également applicable à des neurones dans des zones du cerveau.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques at JoVE.com

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Les neurones sont d&#39;abord caractérisé électrophysiologique. Puis le cytoplasme du neurone enregistré est aspiré et soumis à une transcription inverse-PCR afin de détecter l&#39;expression des ARNm des enzymes de synthèse des neurotransmetteurs, des canaux ioniques et les récepteurs.

Profilage voltage-dépendants expression d&#39;ARNm de potassium dans les neurones Canal nigrales utilisant une seule cellule de RT-PCR

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K vues.  University of Tennessee College of Medicine. Les neurones sont d'abord caractérisé électrophysiologique. Puis le cytoplasme du neurone enregistré est aspiré et soumis à une transcription inverse-PCR afin de détecter l'expression des ARNm des enzymes de synthèse des neurotransmetteurs, des canaux ioniques et les récepteurs.

Vidéo: Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Une seule cellule de profilage de développer et d&#39;âge mûr neurones de la rétine

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Recherche

Neurosciences

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Enregistrement Light-réponses évoquées dans les neurones post-synaptiques dans Dark-adaptés, Préparations rétine de la souris tranche en utilisant des techniques de patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l&#39;ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantification des molécules d&#39;endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression dans les neurones de la moelle épinière génétiquement définies

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Fabrication, des essais et à l’aide de microélectrodes sensibles aux ions Potassium dans des tranches de tissu du cerveau adulte

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

Séquençage de l’ARN des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et Double Transcription In Vitro de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de tranches organotypiques de neurones excitateurs excitateurs de l’hippocampe de souris et de neurones inhibiteurs spécifiques à une classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...