Ce travail a été soutenu par des subventions de fonctionnement aux BAV de la maladie de Crohn et la colite Foundation of Canada (CCFC) et les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Go a été financée par une bourse d&#39;études supérieures des IRSC. BAV sont les enfants souffrant de troubles intestinaux et du foie (ENFANT) Président de la Fondation de la recherche sur les MII de pédiatrie et la Chaire de recherche du Canada en gastroentérologie pédiatrique.

1. Préparation de l&#39;inoculum et Citrobacter rodentium gavage de souris <ol><li> Préparer et passer à l&#39;autoclave Luria Bertani (LB). </li><li> Obtenir viable C. rodentium à partir d&#39;un stock de glycerol congelé et sans stries sur gélose LB à l&#39;aide d&#39;une anse stérile inoculation ou de pointe de la pipette. Incuber à 37 ° C pendant la nuit. Inoculer 3 ml de bouillon LB stérile dans un tube de culture faucon avec des colonies de la plaque de LB en utilisant une boucle d&#39;inoculation ou de pointe de la pipette. Préparation de l&#39;inoculum doit être fait en utilisant des techniques aseptiques. </li><li> Incuber la C. culture rodentium en aérobiose à 37 ° C pendant la nuit dans une incubation de table agitateur à 200 tpm. Le bouillon LB inoculé devrait apparaître nuageux après une nuit de culture. </li><li> Utilisez une ampoule à pointe aiguille de gavage gastrique attachée à une seringue de 1 ml à chaque souris gavage avec 100 ul de la nuit C. rodentium culture. Doucement nuque de la souris, en tenant fermement la peau lâche sur son cou et le dosavec le pouce et les doigts. Tirez la tête de l&#39;animal avec votre index pour immobiliser la tête et redresser l&#39;œsophage pour l&#39;insertion de l&#39;aiguille de gavage. </li><li> Maintenir la souris dans une position verticale et de diriger la pointe de l&#39;aiguille ampoule gavage sur le côté de sa bouche et sur sa langue. Doucement passer l&#39;aiguille sur le toit de la bouche et le faire avancer dans l&#39;œsophage. S&#39;il ya une résistance ressentie lors de cette procédure, retirez l&#39;aiguille gavage et réinsérez-le. </li><li> Lentement, injecter 100 ml de l&#39;inoculum bactérien et retirez délicatement l&#39;aiguille de gavage. Surveiller le rythme de la respiration et le comportement de la souris après le retourner à sa cage. </li></ol> Notes: <ul><li> Dans les étapes 2 et 3, également préparer un tube de culture en utilisant des techniques aseptiques faucon avec 3 ml de bouillon LB stérile pour être cultivées pendant une nuit pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y ait pas de contamination bactérienne du bouillon lui-même. Le bouillon LB doit être limpide après une nuit de culture. </li><li&gt; Agiter doucement la culture dans le tube falcon avant le chargement des seringues pour gavage sorte qu&#39;une dose égale de bactéries est remis à chaque souris, à l&#39;étape 4. </li><li> Culture d&#39;une nuit doit être jeté s&#39;il a été vacciné depuis plus de 24 heures. </li><li> Toutes C. rodentium infections et de logement des animaux infectés doivent être effectuées dans un centre de biosécurité de niveau 2. </li></ul> 2. Mesure de la perméabilité colique barrière épithéliale en C. rodentium souris infectées <ol><li> Mesurer intégrité de la barrière à un moment souhaité après l&#39;infection. </li><li> Le jour de l&#39;essai, préparer suffisamment de 4 kDa isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextrane dissous dans un tampon phosphate salin (PBS) à une concentration de 80 -1 mg ml à chaque souris gavage avec 150 pi et de préparer la courbe d&#39;étalonnage. </li><li> Scruff la souris et le gavage avec 150 ul de FITC-dextran. Retirer la nourriture de la cage pour le moment. </li><li> Anesthésier les souris 4 heures aprèsgavage et de recueillir autant de sang que possible (~ 450 pi) par ponction cardiaque. Ajouter le sang à une concentration finale de 3% d&#39;acide citrate dextrose dans un microtube pour empêcher la coagulation. Euthanasier les souris et recueillir des tissus du côlon chez PBS pour le nombre de bactéries (étapes 3,1 à 3,5) et dans 10% de formol pour la fixation des tissus et, finalement, l&#39;immunofluorescence (étapes 4,1 à 4,8). </li><li> Faites tourner les échantillons de sang à 1000 xg pendant 12 min dans une centrifugeuse à 4 ° C. Recueillir le sérum et diluer à 1/10 et 1/100 dans du PBS. Ajouter 100 ul de chaque échantillon à ces deux dilutions sur une plaque de 96 puits dans répétitions. </li><li> Pour préparer la courbe d&#39;étalonnage, diluer l&#39;original 80 mg ml -1 FITC-dextran utilisé pour gavage des souris dans du PBS pour les concentrations suivantes: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, et 0 pg / ml . Ajouter 100 ul de chaque concentration à une plaque de 96 puits en trois exemplaires. </li><li> Quantifier la fluorescence de chaque échantillon à l&#39;aide d&#39;un fluorimètre à une excitation wavelength de 485 nm et de longueur d&#39;onde d&#39;émission de 535 nm. </li><li> Analyser les données brutes en traçant la courbe standard. Saisissez les données brutes de chaque échantillon dans l&#39;équation de la droite engendrée par la courbe standard pour déterminer la concentration de FITC-dextran dans chaque échantillon. </li></ol> Notes: <ul><li> Partir de l&#39;étape 4 et suivants, conserver des échantillons de sang sur la glace et de minimiser l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Lors de la mesure intégrité de la barrière épithéliale un point dans le temps, ou avant, 7 jours post-infection est optimale, car de graves lésions tissulaires partir de cet instant. Mesure intégrité de la barrière avant se produise des dommages graves vous permet de déterminer les différences maximales de perméabilité au cours de C. infection rodentium entre les souches de souris. </li><li> Assurez-vous que les souris témoins non infectés sont également testés pour intégrité de la barrière épithéliale. </li></ul> 3. Mesure de la charge bactérienne dans les tissus de C. rodentium souris infectées <ol><li> Ajouter 1 ml de PBS stérile d&#39;une un métal autoclave talon à fond rond d&#39;un tube de 2 ml centrifugeuse utilisant une technique aseptique. Les différents tissus prélevés sur chaque animal seront placés dans des tubes séparés PBS. Peser les tubes avant l&#39;addition du tissu. </li><li> Retirez le caecum et le côlon de la souris. Séparer le caecum du côlon et poussez le contenu luminal à l&#39;aide de pinces. Ajouter le contenu d&#39;un tube de PBS. Après séparation de 0,5 cm sections de la partie distale du côlon et du caecum pour la fixation au formol à 10%, couper le reste du côlon et du caecum longitudinalement et laver avec du PBS stérile avant de les placer dans des tubes de tissus. </li><li> Peser les tubes PBS avec le tissu, puis homogénéiser les échantillons à l&#39;aide d&#39;un fouet perles pendant 6 min à 30 Hz. </li><li> En utilisant des techniques aseptiques, ajouter 180 ul de PBS stérile par puits d&#39;une plaque 96 puits. Ajouter 20 ul de chaque échantillon homogénéisé au premier puits de chaque rangée. Bien mélanger et diluer en série, en ajoutant 20 pl de chaque précédente ainsi d&#39;obtenir des dilutions de 10 -1 (d&#39;abord nousll) à 10 -6. Planche 10 ul de chaque dilution de chaque échantillon en triple sur une plaque LB fond carré avec une grille. Incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Comptez unités formant colonies (UFC), puis la moyenne des 3 chefs, et d&#39;enregistrer la dilution à laquelle chaque échantillon a été compté. Multipliez moyenne UFC par 50, comme 20 pl de l&#39;original 1 ml d&#39;échantillon a été utilisé, et par le facteur de dilution à laquelle l&#39;échantillon a été compté résultant en UFC / ml. Finalement, diviser par la masse de tissu afin de déterminer UFC / g. </li></ol> 4. Évaluation histologique et la coloration par immunofluorescence de tissus infectés Colon <ol><li> Recueillir des tissus comme à l&#39;étape 3.2. Boutique de tissus dans le formol durant la nuit, puis laver avec de l&#39;éthanol à 70%. Intégrer les tissus en paraffine et coupé 5 sections um pour la coloration. Tache avec de l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine pour évaluation histologique et procéder aux étapes suivantes pour immunofluorescence. </li><li> Pour Déparaffiner tissus avant la coloration, le lieu glisse dansune cuvette Coplin et mettre en bain d&#39;eau à 65 ° C pendant 10 min. Ensuite, placer les lames dans du xylène pendant quatre lavages de 2 minutes chacun. Les lames doivent être réhydratés avec deux 5-minute lavages dans de l&#39;éthanol 100%, suivi par une 5 min de lavage dans chacune des catégories suivantes: éthanol 95%, éthanol à 75% et dH 2 0. Ces lavages doit être effectuée sous une hotte pour éviter l&#39;exposition à des vapeurs nocives. </li><li> Placer les lames dans la jarre Coplin avec préchauffé tampon citrate de sodium, puis le placer dans un bateau à vapeur pendant 30 min, puis laisser reposer 30 min. Ce processus rompt la réticulation de la protéine formée par la fixation au formol récupérer sites antigéniques potentiels. </li><li> Laver avec du PBS azide pendant 5 min, trois fois. Lames sèches et la zone autour du tissu marque avec un stylo PAP pour créer une barrière hydrophobe, en gardant les réactifs de coloration localisés sur le tissu. </li><li> Bloquer les tissus pendant 1 heure à température ambiante avec un tampon de blocage (par exemple α-sérum de chèvre) dans une chambre humide immunomarquage. </li><li> Diluer primary anticorps à la concentration souhaitée à l&#39;aide du tampon de dilution d&#39;anticorps. Verser tampon bloquant et ajouter 50 à 100 ul de l&#39;anticorps primaire dans les tissus. Incuber à 4 ° C pendant la nuit ou à la température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Laver avec du PBS azide pendant 5 min, trois fois. Ajouter 50-100 ul d&#39;anticorps secondaire dilué dans un tampon de dilution d&#39;anticorps dans les tissus et les incuber à température ambiante pendant 1 heure dans l&#39;obscurité. Laver avec dH 2 O pendant 5 minutes, trois fois. </li><li> Déshydrater les lames, ajouter DAPI Prolongez moyen d&#39;or de montage et recouvrir d&#39;une lamelle. Afficher les diapositives sous un microscope à fluorescence. </li></ol> Notes: <ul><li> PBS azide peut être substitué par du PBS fraîchement préparé comme alternative pour éviter la prolifération bactérienne dans le milieu de lavage provenant de l&#39;étape 4 en avant. </li></ul>

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Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Citrobacter rodentium infection constitue un modèle précieux pour l&#39;étude de deux maladies infectieuses et de la colite chez la souris. Ce modèle unique permet de caractériser des réponses de l&#39;hôte, ainsi que les propriétés pathogènes de bactéries. Les étapes décrites dans ce protocole détail l&#39;utilisation réussie de ce modèle. Il ya plusieurs étapes critiques de ce protocole à garder à l&#39;esprit lors de l&#39;induction de colite et de l&#39;analys...

L&#39;infection par des bactéries pathogènes entériques déclenche gastro-intestinal (GI) l&#39;inflammation, ainsi que pathologie intestinale et la physiopathologie, y compris la diarrhée intestinale et dysfonction de la barrière épithéliale. Les mécanismes de virulence des bactéries pathogènes qui colonisent le tractus gastro-intestinal de leurs hôtes, ainsi que les réponses spécifiques de l&#39;hôte qui défendent contre de telles infections sont mal comprises, mais les progrès récents dans la modélisation des infections entériques bactériennes ont commencé à nous aider dans notre compréhension de ces processus. Les bactéries entériques ont également été associés à des maladies inflammatoires de l&#39;intestin (MICI). Maladie de Crohn Le MII (CD) et UC sont des maladies complexes d&#39;étiologie inconnue, caractérisée par une inflammation intestinale chronique et des lésions tissulaires. De nombreux modèles murins d&#39;inflammation intestinale existent, d&#39;une inflammation spontanée des souches génétiquement modifiés, tels que l&#39;IL10 - / - souris, aux défis chimiques avec des composés tels que le sulfate de dextrane sodique (DSS) et dinitrobenzene sulfonique (DNBS) 1. Il a été émis l&#39;hypothèse que les réponses inadaptées chroniques inflammatoires présentes chez les patients MICI se développer en individus génétiquement sensibles à l&#39;exposition anormale du système immunitaire intestinal muqueuse de bactéries entériques 2, donc l&#39;étude des modèles de colite infectieuse offre également un potentiel important pour la définition de l&#39;hôte potentiellement pathogène . réponses à des bactéries entériques Citrobacter rodentium colite induite est l&#39;un des rares modèles de colite infectieuse qui a été bien caractérisés 1,3, ce qui permet l&#39;analyse des réponses de l&#39;hôte aux bactéries entériques et de la compréhension de nouveaux mécanismes potentiels de la pathogenèse de MICI, une étape essentielle dans le développement de nouveaux traitements préventifs et thérapeutiques. C. rodentium est une gram négatif attachant et effaçant (A / E), murin pathogène bactérien spécifique qui est étroitement liée à l&#39;humain importantentéropathogène pathogènes E. coli (EPEC) et entérohémorragique E. coli (EHEC) 3-8. La famille d&#39;un des agents pathogènes / E intimement joindre à la membrane de la cellule hôte apicale de l&#39;épithélium du caecum et du côlon, la formation d&#39;un non-invasive piédestal structure en forme de la cellule hôte. Provocation par voie orale avec C. rodentium de 10 8 -10 9 organismes produisant un modèle robuste d&#39;une colite infectieuse caractérisée par une hyperplasie du côlon ou de l&#39;allongement des cryptes, infiltration mononucléaire cellules immunitaires et l&#39;épuisement des cellules caliciformes 3,4. Le site initial de la colonisation, quelques heures après la provocation, est le patch du caecum, suivie par une progression dans le côlon distal 2 à 3 jours après l&#39;infection 3. Dans souches de souris immunocompétentes, l&#39;élimination de l&#39;agent pathogène est atteinte 3 à 4 semaines après l&#39;infection 1,3,4. Cependant, de nombreuses souches génétiquement modifiés, c.-à-gène déficient ou KO (- / -) des souris, ont été trouvés pour afficher augsed susceptibilité à l&#39;infection causant des dommages exagérés et / ou d&#39;une infection chronique et l&#39;inflammation 9-14. L&#39;utilisation de ce modèle de colite infectieuse chez ces souches huitièmes de finale, beaucoup manquent innées protéines de signalisation, a été indispensable pour révéler plusieurs protéines de l&#39;hôte faisant partie intégrante de la résolution de l&#39;infection et de l&#39;inflammation intestinale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Luria Broth </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> Ajouter 25 g de poudre de LB pour 1L d&#39;eau. Autoclave avant d&#39;utiliser. </td></tr><tr><td> Plaque de fond carrée avec grille </td><td> Pêcheur </td><td> 08 à 757-11A </td><td></td></tr><tr><td> Tube de culture Falcon </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> Ampoule à pointe aiguille de gavage gastrique </td><td> Outils Fine Science </td><td> 18060-20 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 1 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC-dextran </td><td> Sigma </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> Acide citrique </td><td> Sigma </td><td> C7129 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Le citrate de sodium </td><td> Pêcheur </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Pêcheur </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> Acide citrate dextrose </td><td></td><td></td><td> 20 mM d&#39;acide ctiric, 110 mM de citrate de sodium, 5 mM de dextrose </td></tr><tr><td> Noir Plaque 96 puits </td><td> Pêcheur </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> Perles en métal (5 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> Formol à 10% </td><td> Pêcheur </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> Flacon de 5 ml </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Hématoxyline </td><td> Pêcheur </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosine </td><td> Pêcheur </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> Xylène </td><td> Pêcheur </td><td&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> Cuve de coloration Coplin </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon citrate de sodium </td><td></td><td></td><td> 10 mM de citrate de sodium, 0,05% Tween 20, pH 6,0 </td></tr><tr><td> Stylo Pap </td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de chèvre </td><td> Sigma </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin (BSA) </td><td> Pêcheur </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azoture de sodium </td><td> Sigma </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de blocage </td><td></td><td></td><td> 2% de sérum de chèvre, 1% BSA, 0,1% de Triton X-100, 0,05% Tween 20, 0,05% de sodiumazide, PBS 0,01 M, pH 7,2, mélanger et conserver à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Tampon de dilution d&#39;anticorps </td><td></td><td></td><td> 0,1% de Triton X-100, 0,1% de BSA, 0,05% d&#39;azoture de sodium, 0,04% d&#39;EDTA </td></tr><tr><td> Tampon de blocage tampon de dilution et d&#39;anticorps pour tir </td><td></td><td></td><td> Mêmes recettes que ci-dessus, mais sans addition de détergents (Triton X-100 et Tween 20) </td></tr><tr><td> Prolongez réactif Antifade or avec DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelles de </td><td> Pêcheur </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Incubation de table shaker </td><td> Barnstead Lab Line </td><td> Max Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorimètre </td><td> Perkin Elmer </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse réfrigérée </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td> Bateau à vapeur </td><td> Black &amp; Decker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour produire un modèle robuste d&#39;une maladie infectieuse et la colite, ainsi que les méthodes utilisées pour caractériser l&#39;infection Citrobacter rodentium chez la souris. C. rodentium est une gram négatif, murin pathogène spécifique bactérienne qui est étroitement liée à l&#39;importance clinique humaine entéropathogène pathogènes E. coli entérohémorragique et E. coli. Lors de l&#39;infection à C. rodentium, souris immunocompétentes souffrent de la perte de poids modeste et transitoire et de la diarrhée. Histologiquement, l&#39;allongement crypte intestinale, l&#39;infiltration de cellules immunitaires, et l&#39;épuisement des cellules caliciformes sont observées. Garde d&#39;infection est atteinte après 3 à 4 semaines. Mesure de l&#39;intégrité barrière épithéliale intestinale, la charge bactérienne, et les dommages histologiques à différents moments après l&#39;infection, permettent la caractérisation des souches de souris sensibles à l&#39;infection. Le mécanisme de virulences par des bactéries pathogènes qui colonisent le tractus intestinal de leurs hôtes, ainsi que les réponses spécifiques de l&#39;hôte qui défendent contre de telles infections sont mal compris. Par conséquent, le C. rodentium modèle d&#39;infection bactérienne entérique constitue un outil précieux pour aider à la compréhension de ces processus. Les bactéries entériques ont également été associés à des maladies inflammatoires de l&#39;intestin (MICI). Il a été émis l&#39;hypothèse que les réponses inflammatoires chroniques inadaptés observés chez les patients MICI se développer en individus génétiquement sensibles après une exposition anormale du système immunitaire intestinal des muqueuses à des bactéries entériques. Par conséquent, l&#39;étude des modèles de colite infectieuse offre un potentiel important pour la définition potentiellement pathogènes réponse de l&#39;hôte aux bactéries entériques. C. rodentium colite induite est un modèle du genre rare qui permet l&#39;analyse des réponses de l&#39;hôte aux bactéries entériques, approfondir notre compréhension des mécanismes potentiels de la pathogenèse du commerce international;essentiel dans le développement de nouveaux traitements préventifs et thérapeutiques.

Au cours d&#39;une expérience d&#39;infection standard, les souris sont infectées avec environ 2,5 x 10 8 UFC par gavage de 100 pi C pendant une nuit rodentium culture. L&#39;infection des souris C57BL / 6 avec C. rodentium résultats dans la perte de poids modeste et transitoire et de la diarrhée. Bien que rare avec souris C57BL / 6, les animaux peuvent tomber malades et nécessitent l&#39;euthanasie. Par conséquent, les souris doivent être surveillés pour le degré de perte ...

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The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection constitue un modèle précieux pour l&#39;étude des infections bactériennes entériques ainsi que l&#39;hôte réponses immunitaires et la colite chez la souris. Ce protocole décrit la mesure du intégrité de la barrière, la charge de pathogènes et les dommages histologiques permettant la caractérisation approfondie des contributions pathogène et de l&#39;hôte à la colite infectieuse murin.

La<em&gt; Citrobacter rodentium</emModèle de souris&gt;: Étudier Contributions des agents pathogènes et l&#39;hôte de la colite infectieuse

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

26.3K vues.  BC Children's Hospital. Citrobacter rodentium infection constitue un modèle précieux pour l'étude des infections bactériennes entériques ainsi que l'hôte réponses immunitaires et la colite chez la souris. Ce protocole décrit la mesure du intégrité de la barrière, la charge de pathogènes et les dommages histologiques permettant la caractérisation approfondie des contributions pathogène et de l'hôte à la colite infectieuse murin.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;utilisation d&#39;un piège optique pour l&#39;étude des interactions hôtes pathogènes pour l&#39;imagerie cellulaire dynamique en direct

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Recherche

Immunologie et infection

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D imagerie multimodalité des<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infections chez les souris

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Utilisation de Click Chemistry pour mesurer l&#39;effet de l&#39;infection virale sur Host-Cell Synthèse des ARN

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

Un modèle de souris pour l&#39;inflammation chronique induite par pathogène sur les sites locaux et systémiques

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infection expérimentale avec<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En tant que modèle pour l&#39;étude de l&#39;hôte Réponses Interféron-y

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Un modèle de Culture primaire de cellules bursite de poulet Ex Vivo pour étudier la bursite infectieuse Virus pathogenèse

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

À l’aide d’un bactérie pathogène à sonde pour réponses cellulaires et organismique au niveau de l’hôte

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...