L’expression hétérologue des connexines et des innexines dans les ovocytes xenopus est une approche puissante pour analyser les propriétés biophysiques des jonctions lacunaires. Le principal avantage de notre technique est d’utiliser une approche de mesure de courant latéral élevé qui convient aux pinces de tension à double site. La procédure sera démontrée par Yuan Shui, un post-doctorant de mon laboratoire.
Dès que 70 à 80% des ovocytes sont défoliculés, décantez la solution enzymatique en inclinant doucement le tube. Lavez les ovocytes cinq fois en remplissant le tube avec une solution de ND96, puis en décantantant la solution. Après le lavage final, transférer les ovocytes dans une boîte de Petri de 60 millimètres contenant une solution de ND96.
Utilisez une pipette Pasteur en verre propre pour cueillir et transférer de gros ovocytes d’apparence saine dans une boîte de Petri de 60 millimètres contenant une solution de ND96 complétée par du pyruvate de sodium et de la streptomycine à la pénicilline. Préparez un plat d’injection d’ovocytes en collant un petit morceau de maille de nylon au fond d’une boîte de Petri de 35 millimètres. Remplissez le plat d’injection d’ovocytes à peu près à mi-chemin avec une solution de ND96 complétée par du pyruvate et de la streptomycine de pénicilline.
Ensuite, placez 25 à 30 ovocytes en rangées à l’intérieur de la boîte de Pétri. Remplissez à nouveau une micropipette d’injection avec de l’huile minérale légère et insérez-la dans le support de micropipette de l’injecteur. Transférez l’ARNc de l’une des aliquotes stockées à la surface intérieure d’un couvercle ou d’un fond de boîte de Pétri par pipetage.
Appuyez sur le bouton de remplissage du contrôleur de l’injecteur pour aspirer la gouttelette d’ARNc dans la pointe de la micropipette. Ensuite, appuyez sur le bouton d’injection pour injecter l’ARNc. Transférer les ovocytes injectés dans une nouvelle boîte de Petri contenant une solution de ND96 complétée par du pyruvate et de la pénicilline streptomycine.
Gardez-les à l’intérieur de la chambre environnementale à 15 à 18 degrés Celsius pendant un à trois jours. Remplacez la solution quotidiennement en transférant les ovocytes dans une nouvelle boîte de Pétri. Utilisez deux pinces fines pour décoller doucement la membrane transparente de villin qui enveloppe l’ovocyte.
Ensuite, placez deux ovocytes par puits dans une chambre d’appariement d’ovocytes contenant la solution de ND96. Connectez la sonde de tension différentielle et les câbles de courant à la cellule modèle. Ensuite, connectez les prises rouges et noires à la sonde de tension différentielle avec le cavalier inclus et connectez l’une ou l’autre jambe du cavalier à l’une ou l’autre broche de la cellule du modèle.
Connectez le fil de terre de la cellule modèle au câble à partir de la prise de circuit de terre de l’amplificateur. Tournez les boutons de décalage VM et VE pour mettre à zéro les compteurs de tension et de courant à membrane. Éteignez la pince pour être rapide ou lente et tournez le cadran de gain dans le sens des aiguilles d’une montre à un niveau qui permet à la pince de tension appropriée de mettre à zéro les électrodes de tension et les compteurs d’électrodes de bain de l’amplificateur.
Exécutez un protocole d’acquisition simple contenant quelques étapes de tension pour confirmer que la tension affichée dans le voltmètre à membrane change en fonction du protocole d’acquisition et que les traces de tension et de courant sont affichées correctement dans Clampex. Placez une boîte de Petri contenant les ovocytes appariés dans le récipient de la boîte de Petri de la plate-forme d’enregistrement. Sélectionnez une paire d’ovocytes et faites pivoter la boîte de Pétri si nécessaire, de sorte que les deux ovocytes soient dans les directions gauche et droite.
Verrouillez la scène en position par sa base magnétique. Placez une électrode de référence près du bord de la boîte de Petri vers le côté utilisateur. Ensuite, connectez l’électrode de référence à la prise noire dans une seule des deux sondes de tension différentielle.
Prenez une paire de micropipettes en verre, cassez un peu de la pointe avec un scriber en diamant et lissez le bord de la pointe par polissage au feu. Tenez la micropipette au-dessus de la flamme d’un brûleur à alcool et pliez-la à un angle lisse à environ un centimètre de la pointe. Remplissez complètement la pipette en verre avec une solution ND96, puis insérez-la dans un support de microélectrode prérempli.
Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le système. Insérez la broche de deux millimètres du support de microélectrode dans la prise de deux millimètres d’un fil de connexion d’électrode de tension différentielle. Serrez la douille de deux millimètres sur une pince magnétique et dirigez l’extrémité de l’électrode de tension différentielle vers l’un des deux ovocytes.
Insérez la broche d’un millimètre du fil de connexion de l’électrode de tension différentielle dans la prise rouge de la sonde de tension différentielle du même côté. Préparez les électrodes de tension et de courant des capillaires en verre et remplissez-les avec une solution de chlorure de potassium. Ensuite, insérez les électrodes dans les porte-électrodes fournis avec les amplificateurs.
Abaissez les électrodes dans la solution de bain et tournez les cadrans de décalage VM et VE décalés pour mettre à zéro les compteurs de tension et de courant à membrane. Vérifiez la résistance de l’électrode en appuyant sur Test d’électrode VM et Test d’électrode VE. Insérez les électrodes de courant et de tension dans les ovocytes et observez les potentiels membranaires négatifs.
Ensuite, dans la section de serrage de l’amplificateur, confirmez que le gain CC est en position. Tournez le bouton de gain dans le sens des aiguilles d’une montre à un niveau qui permet une serrage de tension appropriée et éteignez l’interrupteur de la pince à rapide. Enfin, exécutez un protocole d’acquisition.
Un diagramme de l’expérience ovocyte est montré ici. Des pas de tension membranaire négatifs et positifs sont appliqués à l’ovocyte 1 à partir d’une tension membranaire de maintien de moins 30 millivolts, tandis que l’ovocyte 2 est maintenu à une tension membranaire constante de moins 30 millivolts. La tension transparentielle, ou Vj, est définie comme la tension membranaire de l’ovocyte 2 moins la tension membranaire de l’ovocyte 1.
Les images représentatives montrent les traces Lj de l’échantillon et la relation de tension trans-jonctionnelle normalisée résultante des jonctions lacunaires homotypiques UNC-9. Les traces Lj de l’échantillon et la relation Gj-Vj normalisée résultante des jonctions lacunaires homotypiques UNC-7b sont présentées ici. Les résultats montrent que ces deux types de Gjs diffèrent par le taux d’inactivation Ij dépendant de Vj, la dépendance Vj et la quantité de Gj résiduel.Lors de la tentative de procédure, il est très important de s’assurer que le système d’électrodes de tension différentielle n’a pas de bulles d’air et que sa pointe est dirigée très près de l’ovocyte et que les électrodes de tension et de courant ont une résistance d’environ un microohm.
Notre technique est facile à mettre en œuvre. Il peut être d’un intérêt particulier pour les laboratoires qui sont nouvellement intéressés par l’utilisation des ovocytes Xenopus pour étudier les jonctions lacunaires.
