La production et le travail expérimental présenté ici reflète l&#39;aide dévouée et enthousiaste de Reynaldo Pareja. Financé par le Département administratif de la Colombie de la Science, de la Technologie et de l&#39;Innovation (Colciencias) et par une subvention de la Fondation Bill &amp; Melinda Gates à travers l&#39;initiative du Grand Challenges Explorations.

1. Plantes <ol><li> Surface de stériliser les graines de soja (cv. Calima) en les plongeant pendant deux minutes dans de l&#39;hypochlorite de sodium à 0,5% et à deux minutes dans de l&#39;éthanol à 70%. Rincer trois fois les graines dans de l&#39;eau distillée stérile. </li><li> Évaluer le succès de votre stérilisation en étalant 100 ul de la dernière eau de rinçage sur les pommes de terre gélose dextroxe (PDA) des médias, et l&#39;incubation de la plaque pendant 10 jours à 25 ° C. Terminer et redémarrez l&#39;expérience si aucune croissance est visible sur la plaque. </li><li> Plantez les graines dans des groupes de trois dans des pots contenant un mélange stérile de terre et de sable à un ratio de 2:1. Transférer les pots à une chambre de croissance à 25 ° C, env. 50% HR et photopériode de 12 heures. Une semaine après la germination, éliminer les au moins deux jeunes plants vigoureux. Eau tous les 2-3 jours avec de l&#39;eau distillée stérile et fertiliser 10 et 20 jours après la plantation avec une solution d&#39;eau 6 g / L d&#39;engrais NPK 15-15-15. </li></ol> 2. Fongus <ol><li> Procurez-vous un comformulation financière de souche GHA de Beauveria bassiana (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombie). </li><li> Pour générer une culture unique stock de spores, de suspendre ca. une inoculation de conidies boucle complète dans 1 ml d&#39;une solution aqueuse à 0,1% de Triton X-100 et vortex pendant 10 sec. Ensuite, la plaque 100 ul de la suspension sur de la gélose Noble 2,5% et incuber pendant 24 heures à 25 ° C. Transférer une seule conidie germant dans un PDA 100 mm et plaque contenant croître jusqu&#39;à ce qu&#39;elle couvre la totalité de la plaque (environ 3-4 semaines). </li><li> Dans des conditions stériles, gratter la croissance fongique à partir de la surface du support et le suspendre dans 10 ml stérile 0,1% de Triton X-100. Vortex pendant une minute. Ensuite, filtrer la suspension à travers une étamine stérile pour éliminer les hyphes et obtenir la suspension stock. </li><li> Utilisez un hémocytomètre pour estimer la concentration de la suspension de conidies stock. Pour faciliter comptes de conidies, préparer une dilution de série 10000 fois du stock, à chaque fois que le transfert de 100 pi of suspension de conidies dans 900 ul de 0,1% de Triton X-100, et vortex pendant 10 secondes avant la dilution suivante. </li><li> Pour générer l&#39;inoculum, ajuster la suspension-mère à une concentration finale de 10 8 conidies / ml, en utilisant la formule: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="équation 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Pour évaluer la viabilité des conidies, la plaque 100 ul de la dilution de 10.000 fois sur gélose Noble 2,5% et incuber pendant 24 heures à 25 ° C. Ensuite, inspecter trois groupes aléatoires de 100 conidies pour estimer la germination pour cent. Examiner une conidie germé quand un tube germinatif visible de plus de la moitié du diamètre des projets de ce conidie. N&#39;utilisez que la suspension lorsque la germination pour cent en moyenne dépasse les 90%. </li></ol> 3. Inoculation <ol><li> Inoculer les plantes quand elles atteignent leur stade première feuille vraie (environ 14 jours après la plantation). Les plantes aquatiques à la capacité du sol à distiller stérilel&#39;eau ed 24 heures avant inoculation. </li><li> Pour la méthode de pulvérisation foliaire, utiliser un pulvérisateur manuel d&#39;appliquer la suspension de conidies (traitement), soit 0,1% de Triton X-100 (contrôle) à l&#39;adaxial (supérieure) de surface de feuilles jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la saturation. Couvrez le dessus du pot avec du papier aluminium pour éviter le ruissellement des conidies au sol. Après la pulvérisation, couvrir les plantes avec un sac en plastique pendant 24 heures afin de maintenir un niveau élevé d&#39;humidité faciliter l&#39;invasion fongique. </li><li> Pour la méthode de trempage du sol, utiliser un cylindre gradué d&#39;appliquer 10 ml de suspension de conidies (traitement), soit 0,1% de Triton X-100 (contrôle) à la surface du sol à la base de la plante. </li><li> Après inoculation, le retour des plantes dans les chambres de croissance en les disposant en blocs aléatoires complets. Pas moins de quatre blocs expérimentaux supplémentaires devraient être installés pour permettre des évaluations de la croissance des plantes, en plus des évaluations de la colonisation endophyte, dans la même expérience. </li></ol> 4. Evaluations <ol><li> Évaluer l&#39;expérience d&#39;un bloc à la fois, en sélectionnant les blocs dans un ordre aléatoire. Ceci est particulièrement important pour les grandes expériences qui ne peuvent pas être évalués sur une seule journée. </li><li> Avant de traiter une plante, mesurer et enregistrer la hauteur de la base vers le méristème apical. Puis, déraciner soigneusement et lavez soigneusement à l&#39;eau courante. </li><li> De chaque plante, l&#39;échantillon deux feuillets, deux morceaux de racine et deux morceaux de tige. Sélectionner des échantillons au hasard dans la brochure première vraie feuille de la plante. Ensuite, obtenir deux échantillons de tiges, 3 cm de long chacune, à partir du milieu de la plante et de près de la surface du sol. Enfin, obtenir deux échantillons pivotante, aussi 3 cm de long chacune, à partir du milieu du pied et de 1 cm de l&#39;extrémité de la racine. Placer les échantillons sur trois sacs en papier et d&#39;étiquettes séparées de manière appropriée. </li><li> Après lavage et d&#39;échantillonnage toutes les plantes dans un bloc, commencer par traiter les feuilles, puis les racines, et enfin les tiges. </li><li> Surface stériliser tquestions dans une hotte à flux laminaire stérile comme en 1.1, ci-dessus. Rincer chaque échantillon trois fois par immersion dans de l&#39;eau distillée stérile et laissez-le sécher dans une serviette en papier stérile. Puis, disséquer et jeter ses bords extérieurs, où les endophytes aurait pu être éliminé en raison du contact avec des désinfectants. </li><li> Couper l&#39;échantillon coupé en six sections, avec une moyenne 6x6 mm pour les feuilles et 6 mm de long pour les tiges et les racines. Plaque des six sections sur une plaque de 60 mm de Pétri avec les médias PDA complétées par la tétracycline antibiotiques, la streptomycine et la pénicilline à 2 mg / L chacun. Sceller la plaque avec du parafilm et incuber à l&#39;obscurité à 25 ° C. Chaque plante donne six assiettes, deux pièces par plante. </li><li> Changez l&#39;eau de rinçage après le traitement de chaque bloc d&#39;une partie de la plante donnée. Avant de jeter l&#39;eau de rinçage utilisée, une plaque échantillon de 100 ul sur un support PDA et les incuber pendant 10 jours à 25 ° C pour évaluer le succès de stérilisation. Si la croissance des champignons en découle, ne considérez pas les échantillons correspondants pour les analyses. </li><li> Inspectez les plaques tous les 2-3 jours pendant 20 jours pour observer et enregistrer une croissance fongique. Parties de l&#39;installation d&#39;accise et de transfert présentant présence de champignons endophytes des plaques contenant PDA fraîche. Ceci permettra d&#39;éviter la contamination des parties de l&#39;installation voisins dans la plaque d&#39;origine. </li><li> Enregistrer B. croissance bassiana de parties de l&#39;installation. Beauveria bassiana peuvent être identifiés par caractéristique mycélium blanc dense devient crème à jaune pâle au bord. En cas de doute, monter le spécimen dans une goutte d&#39;eau et inspecter sous un microscope, à la recherche d&#39;globuleux conidies et des conidiophores en forme de zigzag, caractéristique de l&#39;espèce. </li><li> Utilisez d&#39;autres blocs expérimentaux pour évaluer l&#39;impact des traitements sur la biomasse végétale. Tout d&#39;abord, mesurer leur hauteur à partir de la base vers le sommet du méristème apical. Ensuite, bien se laver et déraciner les plantes dans l&#39;eau du robinet et laissez-les sécher à 45 ° C pendant trois jours afin de déterminer leur poids sec. </li></ol>

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(15), e683 (2008).</li><li>Parsa, S., Sotelo, G., Cardona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+herbivore+resistance+mechanisms:+spittlebugs+on+Brachiaria+spp.+as+an+example.">Characterizing herbivore resistance mechanisms: spittlebugs on Brachiaria spp. as an example.</a> J. Vis. Exp. (52), e3047 (2011).</li><li>Atamian, H., Roberts, P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+throughput+screens+with+root-knot+nematodes+Meloidogyne+spp.">High and low throughput screens with root-knot nematodes Meloidogyne spp.</a> J. Vis. Exp. (61), e3629 (2012).</li></ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

De nombreux facteurs peuvent influencer le résultat d&#39;une expérience spécifique d&#39;établir un entomopathogène fongique comme endophyte. Nos résultats démontrent la méthode d&#39;inoculation est l&#39;un d&#39;entre eux. Les facteurs biologiques à expérimenter avec notamment la récolte des espèces ou cultivars sélectionnés et la souche de champignon entomopathogène espèces ou d&#39;isoler utilisé. Autres facteurs à considérer comprennent la manipulation de la concentration de l&#39;inoculum, l&#39;âge de la plante lors de vaccinations, et les conditions de croissance de la plante. Il serait idéal pour une méthode d&#39;inoculation d&#39;aboutir à la colonisation des plantes systémique par un champignon entomopathogène 14,17,18,21. Au lieu de cela, il apparaît que les méthodes d&#39;inoculation ont tendance à privilégier un modèle spécifique de la colonisation locale. Dans le café, par exemple, des pulvérisations foliaires favoriser la colonisation feuilles alors que bassinage du sol favorisent la colonisation des racines 17. Nous avons constaté la même tendance dans le haricot commun. En fin de compte, le choix de la méthode d&#39;inoculation doit êtreguidé par l&#39;emplacement prévu pour l&#39;endophyte dans une usine, probablement correspondant à la niche de la cible ou herbivore phytopathogène. Bien que couramment utilisé, la détection et la quantification endophyte basé sur les cultures des médias peut être coûteux, difficile et source d&#39;erreurs. Par exemple, un total de 10.800 parties de l&#39;installation (étalées sur des boîtes de Pétri 1800) ont été évalués dans une expérience pour optimiser B. inoculations bassiana sur la banane 16. Parmi ceux-ci, 4.496 articles ont été colonisés par une putative B. bassiana, identifiés principalement par la morphologie des colonies. De toute évidence, une vérification microscopique des espèces pour chaque colonie aurait été souhaitable, mais pas inabordable. D&#39;autre part, 1.176 articles ont été colonisées par des champignons et d&#39;autres ont été rejetées et considérées comme des données manquantes 16. La probabilité existe, cependant, que B. bassiana est un mauvais compétiteur ou plus lent à se développer, et aurait finalement émergé de ces articles, si unllowed suffisamment de temps. Par conséquent, les méthodes de détection endophytes basés sur les cultures des médias sont soumis à des faux positifs et des faux négatifs. En conséquence, le développement de la détection et de quantification plus fiable des méthodes, par exemple ceux basés sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) 20,21,24, est bien justifiée. Le but ultime des expériences d&#39;inoculation doit être de développer un traitement efficace qui offre une résistance durable contre les herbivores systémique et / ou de la maladie. Une plausible, mais encore non testés, l&#39;hypothèse est que l&#39;ampleur de la colonisation endophyte doit être en corrélation positive avec le degré de résistance médiée par endophyte. Une prochaine étape naturelle après l&#39;affinement des méthodes d&#39;inoculation, par conséquent, pourrait être d&#39;examiner cette corrélation. Plusieurs protocoles vidéo peut aider les chercheurs à concevoir un test de résistance appropriée pour un organisme cible pathogène ou 29-31. En fin de compte, c&#39;est ce test qui va déterminer le succès de l&#39;inoculumtion méthode, et le potentiel associé pour la lutte biologique endophyte.

Entomopathogènes fongiques sont des régulateurs importants de populations d&#39;insectes avec un potentiel considérable en tant mycopesticides 1. Ce n&#39;est que récemment, cependant, ont entomopathogènes fongiques été observé que les endophytes, à la fois naturellement et en réponse à diverses méthodes d&#39;inoculation 2. La fonction écologique des endophytes fongiques entomopathogènes reste en grande partie inconnue, mais certaines études ont mis en cause dans les 3,4 la croissance des plantes, 5-8 résistance herbivore, et 9,10 résistance aux maladies. L&#39;objectif global des méthodes présentées ici est d&#39;introduire un entomopathogène fongique comme endophyte, en préparation pour les évaluations ultérieures de lutte biologique endophyte. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) est le mieux étudié entomopathogène fongique 5-9,11-19 endophyte, et il est disponible en tant que mycopesticide commerciale. Méthodes d&#39;inoculation testés pour établir <em&gt; B. bassiana comme endophyte comprennent bassinage du sol, 14,17 enrobages de semences 18 et 14, immersions pansements radicule 13,15 racines, des rhizomes et des immersions 11,16,18, tige injections 17, 14,17,20 pulvérisations foliaires et gerbes de fleurs 19. Grâce à ces méthodes, les chercheurs ont introduit B. bassiana dans la banane 11, haricot 7, cacao 13, café 17, le maïs 7, le coton 7, le palmier dattier 12, jute 21, 20 du pavot à opium, la citrouille 7, pin radiata 18, le sorgho 14, 7 et tomate blé 7. Des données récentes suggèrent que endophyte B. bassiana a le potentiel pour protéger les plantes non seulement des arthropodes nuisibles 5-7,22-27, mais aussi de quelque 9 agents pathogènes des plantes. Le haricot commun (Phaseolus vulgaris) se classe parmi les cultures les plus vulnérables aux ravageurset les maladies. Il peut être affecté par plus de 400 organismes nuisibles et de 200 agents pathogènes, dont l&#39;attaque est considérée comme le facteur le plus limitant la production de haricots dans les régions 28. En conséquence, le haricot commun peut être une culture excellent modèle pour étudier le spectre de la lutte biologique endophyte par B. bassiana. Dans une première étape dans cette direction, cet article décrit les pulvérisations foliaires et du sol potions que les méthodes d&#39;inoculation d&#39;introduire B.bassiana l&#39;état endophyte dans le haricot commun.

<table border="1">
<tbody>
	<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Mycotrol SE	</td>
 <td>Laverlam</td>
 <td>4167</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Noble agar</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A5431-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Penicillin G sodium salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3032-25MU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (100 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Petri dish (60 x 15 mm)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-757-13A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Potato dextrose agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>213400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Regular bleach (NaOCl)</td>
 <td>CLOROX</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Streptomycin sulfate salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S6501-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Tetracycline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T3258-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triple quince (NPK)</td>
 <td>ABOCOL</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>X-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Biological safety cabinet</td>
 <td>NuAire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Hemocytometer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-671-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>Leica DM LB microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

Beauveria bassiana est un champignon entomopathogène avec la capacité de coloniser les plantes endophyte. Comme un endophyte, B. bassiana peuvent jouer un rôle dans la protection des plantes contre les herbivores et les maladies. Ce protocole illustre deux méthodes d&#39;inoculation pour établir B. bassiana endophyte dans le haricot commun (Phaseolus vulgaris), en préparation pour les évaluations ultérieures de lutte biologique endophyte. Les plantes sont cultivées à partir de graines stérilisées en surface pendant deux semaines avant de recevoir un B. traitement bassiana de 10 8 conidies / ml (ou l&#39;eau) soit appliqué en pulvérisation foliaire ou par bassinage du sol. Deux semaines plus tard, les plantes sont récoltées et de leurs feuilles, les tiges et les racines sont échantillonnés pour évaluer endophyte colonisation fongique. Pour cela, les échantillons sont individuellement stérilisés en surface, coupé en plusieurs sections, et incubées dans un milieu Potato Dextrose Agar pour 20 jours. Les médias sont inspectés tous les 2-3 jours pour observer la croissance fongiquesociated avec des parties d&#39;installation et d&#39;enregistrer la présence de B. bassiana d&#39;estimer l&#39;ampleur de la colonisation endophyte. L&#39;analyse des succès inoculation comparer la présence de B. bassiana dans une partie de la plante donnée (c.-à-feuilles, tiges ou racines) dans tous les traitements et les contrôles. En plus de la méthode d&#39;inoculation, le résultat spécifique de l&#39;expérience peut dépendre de l&#39;espèce cultivée cibles ou de variétés, les espèces de champignons entomopathogènes souche ou isolat utilisé, et les conditions de croissance de la plante.

B. bassiana a réussi à coloniser endophyte-p vulgaris en réponse aux traitements d&#39;inoculation ont démontré (figure 1). Les deux pulvérisations foliaires et du sol par arrosage abouti à la colonisation endophyte par B. bassiana dans plus de 80% des plantes traitées (figure 2). Cependant, l&#39;ampleur de la colonisation dépend de la partie de la plante évaluée et la méthode d&#39;inoculation utilisée. Les feuilles ont le mieux répondu aux inoculations de pulvérisation. Racines, d&#39;autre part, a répondu uniquement à des inoculations bassinage. Enfin, les tiges réagi de la même pour les deux méthodes d&#39;inoculation. B. bassiana a été détecté dans aucun des parties de l&#39;installation de contrôle. Indépendamment des traitements, autres que les endophytes B. bassiana est passé de 15% des sections de l&#39;usine évalués, mais ils ont été disséqués à partir de plaques médias avant qu&#39;ils ne puissent envahir sections voisines et influencer les résultats. Les usines de traitement et de contrôle étaient visiblement impossibles à distinguer deux semaines après inoculation. Aucune différence n&#39;a été détectée dans leur poids sec et dans leur hauteur. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Les résultats représentatifs de traitements d&#39;inoculation sur la colonisation endophyte des plants de haricot (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Par Beauveria bassiana En haut à gauche:. Contrôle des plaques sans croissance. En haut à droite: endophyte fongique à partir d&#39;une section de l&#39;usine contaminer toute la plaque. En bas à gauche: B. bassiana de plus en plus de deux parties de l&#39;installation. En bas à droite: B. endophytique bassiana conidies et les conidiophores comme on le voit sous un microscope. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Figure 2. Effet des traitements d&#39;inoculation sur la colonisation endophyte de bean plantes (Phaseolus vulgaris cv. Calima) par Beauveria bassiana, deux semaines après inoculation avec la souche GHA. colonisation pourcentage correspond au nombre de sections de plantes colonisées divisé par le nombre de sections de culture.

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Ce protocole illustre deux méthodes d&#39;inoculation d&#39;introduire le champignon entomopathogène<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; L&#39;état endophyte dans le haricot commun (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), En préparation pour les évaluations ultérieures de lutte biologique endophyte.

Établir entomopathogènes fongiques comme endophytes: Vers un contrôle biologique endophytique

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.4K vues.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. Ce protocole illustre deux méthodes d'inoculation d'introduire le champignon entomopathogène Beauveria bassiana L'état endophyte dans le haricot commun ( Phaseolus vulgaris), En préparation pour les évaluations ultérieures de lutte biologique endophyte.

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Greffes d&#39;ingénierie biologique vasculaire basé sur l&#39;aide d&#39;un bioréacteur pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Recherche

Bio-ingénierie

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imagerie des tissus biologiques par désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM d’assemblages biologiques dans un liquide

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Synthèse des hydrogels avec des propriétés antisalissure Membranes pour la purification de l&#39;eau

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Synthèse de cristaux liquides biocompatibles mousses élastomères comme échafaudages cellulaires pour les cultures de cellules spatiales 3D

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

Contrôle de Cluster cellule 3D initial dans un dispositif hybride Gel Cube modèle répétable Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Experimental Methods to Study Human Postural Control

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied by appropriate mathematical methods are needed to understand the role of the different sub-systems involved in human postural control. This article describes a protocol for performing perturbed standing experiments, acquiring experimental data, and carrying out the subsequent mathematical analysis, with the aim of understanding the role of musculoskeletal system and central control in human upright posture. The results generated by these methods are important, because they provide insight into the healthy balance control, form the basis for understanding the etiology of impaired balance in patients and the elderly, and aid in the design of interventions to improve postural control and stability. These methods can be used to study the role of somatosensory system, intrinsic stiffness of ankle joint, and visual system in postural control, and may also be extended to investigate the role of vestibular system. The methods are to be used in the case of an ankle strategy, where the body moves primarily about the ankle joint and is considered a single-link inverted pendulum.

This article presents an experimental/analytic framework to study human postural control. The protocol provides step-by-step procedures for performing standing experiments, measuring body kinematics and kinetics signals, and analyzing the results to provide insight into the mechanisms underlying human postural control.

Méthodes expérimentales pour étudier le contrôle postural humain

Many components of the nervous and musculoskeletal systems act in concert to achieve the stable, upright human posture. Controlled experiments accompanied ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Synthèse des nanoamas d’or électroluminescents électroluminescents pour les applications biologiques

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositifs électriques et magnétiques de champ pour la stimulation des tissus biologiques

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...