Ce protocole permet l’imagerie directe de la population de neurofilaments chez les axones myélinés de souris juvéniles ou adultes à l’aide d’une microscopie de fluorescence, ce qui permet de mesurer la directionnalité et la vitesse du transport du neurofilament dans des segments nerveux isolés. Cette méthode dépend de la disponibilité de souris exprimant une fusion fluorescente photoactivatable de la protéine d’intérêt, mais peut être adaptée pour une utilisation dans n’importe quel nerf facilement disséqué. Pour commencer, versez la solution saline oxygénée dans une seringue de 60 millilitres et assurez-vous qu’il reste un minimum d’air dans la seringue.
Connectez la seringue au tube, puis placez le tube de sortie dans un flacon de déchets. Placez le joint extérieur dans le boîtier de la chambre de perfusion, en veillant à ce que l’entrée d’écoulement et les poteaux de sortie soient alignés avec les trous dans le joint, puis mentez le joint intérieur sur un couvercle circulaire numéro 1.5 et lissez soigneusement toutes les rides dans le joint pour assurer un joint serré. Placez le coverslip et le joint sur une serviette en papier ou un chiffon de tâche avec le joint faisant face vers le haut.
Utilisez une paire de gros ciseaux de dissection pour faire une incision dorsale dans la peau près du milieu de la colonne vertébrale et continuer à couper autour de l’aspect ventral de l’animal. Tirez lentement la peau loin du muscle et coupez le fascia. Ensuite, utilisez des ciseaux de microdissection pour faire une incision dans les muscles de la cuisse à mi-chemin entre la queue et le genou pour exposer le nerf sciatique.
Assurez-vous que le nerf, qui est visible à travers le muscle, n’est pas coupé. Étendre l’incision dorsalement et ventrally pour enlever le muscle, puis enlever les muscles du mollet, en gardant les coupes peu profondes et courtes pour éviter d’endommager les nerfs. Continuez à enlever les muscles jusqu’à ce que le nerf tibial soit complètement exposé à partir du point où il se ramifie du nerf sciatique au talon.
Saisissez le nerf tibial à l’extrémité proximale de la colonne vertébrale avec une paire de forceps et coupez-le avec une paire de ciseaux de microdissection, en vous assurant de ne pas appliquer trop de tension sur le nerf. Soulevez-le soigneusement loin du muscle et coupez les attaches, en prenant soin de ne pas mettre de tension sur le nerf. Couper l’extrémité distale de la colonne vertébrale du nerf tibial et le transférer dans une petite boîte de Pétri de température ambiante oxygénée saline.
À partir de l’extrémité proximale du nerf, saisir doucement les extrémités exposées de l’axon avec une paire de forceps pointe très fine. Avec une deuxième paire de forceps, saisir la gaine nerveuse proximalement et lentement tirer vers l’extrémité distale du nerf en s’assurant qu’aucune tension indue n’est appliquée au cours de ce processus. Saisissez l’extrémité proximale du nerf et ez-le lentement sur un coverslip, puis redressez-le sous une tension douce.
Placez la glissade du microaqueduct sur le nerf avec la glissière rainurée vers le bas et placez la direction de l’écoulement parallèle au nerf. Retournez le coverslip et l’assemblage des microaqueducts et placez-le dans le boîtier de la chambre de perfusion avec la glissière opposée au joint extérieur. Pour fixer la chambre de profusion, placez-la dans le boîtier métallique et faites pivoter l’anneau de verrouillage.
Déprimez lentement le piston salin de seringue et remplissez la chambre de perfusion. Gardez l’entrée et le tube de sortie, le flacon de sortie et la seringue surélevés au-dessus de la chambre elle-même en tout temps pendant la configuration et l’imagerie. Transférer l’assemblage de profusion à un stade de microscope inversé et monter la seringue saline dans la pompe à seringues, puis démarrer le moteur et ajuster la vitesse pour un débit de 0,25 millilitres par minute.
Connectez le chauffe-solution en ligne et réglez-le à 37 degrés Celsius. Connectez le chauffe-eau objectif et réglez-le à 37 degrés Celsius. Appliquer de l’huile sur l’objectif et insérer la chambre de profusion dans la monture de scène.
Appliquez de l’huile sur le coussin chauffant de chambre et fixez-la à la chambre de perfusion, puis connectez-la et réglez-la à 37 degrés Celsius. Verrouillez la chambre de profusion dans l’adaptateur de scène et mettre l’huile objective en contact avec le coverslip sur le dessous de la chambre. Utilisez l’éclairage Brightfield pour vous concentrer sur la couche d’axones sur la surface inférieure du nerf le plus proche de la surface du coverslip.
Les axones myélinés peuvent être identifiés par la présence d’une gaine de myéline qui est visible sous l’éclairage lumineux transmis par Brightfield sans amélioration du contraste. Acquérir une image de référence Brightfield, enregistrer la directionnalité du nerf, puis acquérir une image confoccale à l’aide d’un laser de 488 nanomètres et un filtre d’émission approprié pour gfp photoactivatable. Réglez la puissance laser à environ cinq fois la puissance normale d’imagerie et d’acquérir une image avec un temps d’exposition de trois à quatre minutes, puis acquérir une autre image confocale pour enregistrer l’autofluorescence pré-activation après l’étape de blanchiment.
Tracez une ligne parallèle aux axones avec une longueur égale à la taille de fenêtre d’activation désirée de l’image Brightfield. En utilisant cette ligne comme guide, dessinez une région rectangulaire d’intérêt à travers le champ de vision perpendiculaire aux axones. Activez la fluorescence GFP dans cette région par excitation de modèle avec la lumière de 405 nanomètres, en s’assurant qu’une image est acquise juste avant et immédiatement après l’activation.
À la fin de l’activation, démarrez une minuterie d’une minuterie. Quand il s’éteint, commencer l’acquisition d’une série timelapse. Ajouter 250 milligrammes de poudre de fluorescéine à 0,5 millilitres d’eau distillée double et mélanger jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de particules visibles, puis faire tourner la solution pendant 30 secondes dans une centrifugeuse de table pour sédimenter tout matériau non dissous.
Ajouter huit microlitres de solution de fluorescéine à une diapositive et appliquer un numéro 1.5 coverslip. Éponger l’excès de liquide, sceller le coverslip avec du vernis à ongles et laisser sécher la toboggan. Placez le côté coverslip de glissement vers le bas sur le stade inversé de microscope et ajustez l’accent sur le plan mince de fluorescence à la surface du coverslip.
Déplacez la diapositive pour trouver un champ de vision qui ne contient pas de bulles d’air ou de grosses particules de fluorescéine et d’acquérir une pile Z couvrant six micromètres à intervalles de 0,2 micromètre de sorte que l’image du milieu est le plan de mise au point d’origine. Fermez tous les volets de chemin lumineux, y compris l’obturateur de la caméra et réglez la puissance laser et le temps d’exposition à zéro seconde. Acquérir une pile de 100 images avec ces paramètres, qui seront en moyenne pour générer l’image du champ sombre.
Des images représentatives d’expériences d’évacuation des impulsions et de propagation des impulsions sont présentées ici. Pour la méthode d’évacuation des impulsions, la cinétique de désintégration de fluorescence dans la région activée peut fournir des informations sur le comportement d’arrêt à long terme et à court terme. La région activée peut être courte pour ces expériences.
Une région activée plus longue est utilisée pour la méthode de propagation des impulsions afin de fournir un plus grand bassin de neurofilaments fluorescents. Cela allonge le temps pendant lequel l’augmentation de la fluorescence dans les régions flanquées reste linéaire. 15 micromètres flanquant des fenêtres sont utilisés ici.
La fluorescence totale de la fenêtre de mesure a été quantifiée. La désintégration est biphasique pour la méthode d’évacuation des impulsions avec une décomposition exponentielle initiale représentant le départ des neurofilaments sur piste et une deuxième pourriture exponentielle plus lente à 10 à 20 minutes qui représente le départ des filaments hors piste. Pour la stratégie de propagation des impulsions, les calculs de la vitesse et de la directionnalité du mouvement ne dépendent que des pentes des fenêtres latérales.
Pour les longueurs de fenêtre utilisées ici, la phase linéaire s’étend sur environ cinq minutes. Un timelapse d’un nerf glycolytiquement inhibé est montré ici, démontrant une réduction apparente du transport hors de la région activée. En effet, les pentes distales et proximales sont significativement plus faibles dans les nerfs traités avec l’inhibiteur.
Il y a également une diminution significative de la vitesse de population entre ces deux conditions. Lorsque vous essayez ce protocole, rappelez-vous qu’il est crucial d’être hâtif dans la conduite de la dissection et des parties d’assemblage de chambre que la santé nerveuse diminue après le sacrifice de l’animal. La culture cellulaire neuronale peut permettre la mesure et l’analyse du mouvement des neurofilaments individuels, ce qui compléterait les données à l’échelle de la population recueillies à l’aide de ce protocole.
