Notre protocole reconnaît la nécessité de mieux récapituler la barrière hémato-encéphalique humaine in vitro pour l’étude des mécanismes cellulaires complexes qui affectent le rétablissement post-AVC. Notre modèle triple présente une intégrité robuste qui est en partie liée à un grand compartimentage des inserts de puits, ce qui nous permet de réduire la fréquence des changements et d’éviter la perturbation des populations. Notre modèle est un excellent outil pour étudier les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent à la barrière hémato-encéphalique pendant et après un AVC ischémique.
Notre protocole permet la découverte de nouvelles cibles et thérapies pour améliorer la récupération post-AVC. Les traitements actuels de l’AVC ischémique sont sensibles au facteur temps et, par conséquent, ne sont pas toujours efficaces. Commencez par cultiver le HBVP dans des flacons de culture T75 avec une surface activée pour l’adhésion cellulaire dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5% à 37 degrés Celsius jusqu’à confluence.
Une fois la confluence atteinte, aspirez l’ancien milieu péricytaire et lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS chaud de Dulbecco. Aspirer le PBS de Dulbecco et détacher les cellules du ballon en combinant quatre millilitres de solution chaude d’EDTA de trypsine et un millilitre de PBS de Dulbecco. Incuber la fiole pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone.
Observez au microscope si les cellules sont détachées du ballon. Ajouter cinq millilitres de milieu péricytaire chaud contenant 2% de FBS dans le ballon et transférer les cellules détachées dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifuger la suspension cellulaire pendant trois minutes à 200 g permettant aux cellules de former une pastille dans le fond du tube.
Aspirez le milieu du tube en vous assurant que la pastille de la cellule reste intacte. Re-suspendre la pastille cellulaire dans un milieu péricytaire. Calculez la quantité de milieu en fonction de la confluence des cellules et du nombre d’inserts de puits nécessaires.
Prenez 10 microlitres des cellules en suspension réactivée, placez-les dans une lame de comptage de cellules et comptez le nombre de cellules. Déterminer la densité cellulaire et ensemencer 300 000 cellules par insert dans un millilitre de milieu péricytaire sur le côté abluminal des inserts de puits. Cultiver les astrocytes humains primaires en utilisant le milieu astrocytaire contenant 2% FBS comme décrit dans le manuscrit texte.
Déterminer la densité cellulaire et ensemencer 300 000 cellules par puits au fond des plaques de culture tissulaire à six puits. Couvrir la plaque pour éviter l’évaporation et incuber pendant la nuit. De même, cultivez HBMEC dans des boîtes de culture tissulaire en utilisant un milieu classique complet contenant 10% FBS comme décrit dans le manuscrit texte.
Sortez de l’incubateur les plaques de culture tissulaire à six puits contenant des astrocytes et les inserts de puits contenant les péricytes de l’incubateur. Aspirer le milieu astrocytaire des plaques de culture tissulaire à six puits et ajouter un millilitre de milieu péricytaire et un millilitre de milieu astrocytaire à chaque puits. Aspirer le milieu péricytaire des inserts de puits et les placer dans les plaques de culture tissulaire à six puits contenant les astrocytes ensemencés.
Ensemencer HBMEC à une densité de 300 000 cellules par puits dans deux millilitres de milieu classique complet sur le côté apical du même puits s’insère. Lavez les cellules trois fois avec le PBS de Dulbecco. Pour les cultures à cellules triples soumises à une privation d’oxygène-glucose, ajouter un milieu exempt de glucose aux compartiments apical et basolatéral.
Remplacer le milieu de culture par du milieu frais et des cultures cellulaires témoins normoxiques. Placez les cultures triples de contrôle dans l’incubateur de dioxyde de carbone à 5% à 37 degrés Celsius. Placez une boîte de Petri contenant 20 millilitres d’eau stérile dans la chambre de l’incubateur d’hypoxie pour assurer une humidification adéquate des cultures.
Ouvrez la chambre en relâchant la pince annulaire, puis disposez les cultures cellulaires sur les étagères. Scellez la chambre en fixant la pince annulaire. Ouvrez les orifices d’entrée et de sortie de la chambre et fixez le tube par le haut du débitmètre de la chambre.
Fixez le tuyau du bas du débitmètre au réservoir de gaz via un filtre à air. Ouvrez la vanne de régulation du débit du réservoir en la tournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour permettre un débit de gaz minimal. Ouvrez lentement la vanne du régulateur de pression en tournant dans le sens des aiguilles d’une montre.
Rincer la chambre avec le mélange de gaz pendant cinq minutes à un débit de 20 litres par minute. Débranchez la chambre de la source de gaz et fermez fermement les deux pinces en plastique blanc. Fermez la vanne de régulation du débit du réservoir en tournant dans le sens des aiguilles d’une montre.
Fermez la vanne du régulateur de pression en tournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Placez la chambre d’hypoxie dans un incubateur conventionnel réglé à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Placez l’instrument TEER stérilisé dans l’enceinte de biosécurité et branchez les électrodes dans l’ohmmètre en volt épithélial.
Stériliser les électrodes dans 30 millilitres de solution d’alcool isopropylique à 70% pendant au moins 30 minutes. Allumez l’instrument TEER et réglez la fonction sur ohms. Retirez les électrodes de la solution d’alcool isopropylique à 70% et placez-les dans 20 millilitres de PBS de Dulbecco pendant au moins 30 minutes jusqu’à ce que la lecture numérique sur l’appareil TEER indique zéro ohms.
Insérez la longue broche de l’électrode à travers l’une des trois ouvertures du hangar d’insertion du puits de commande d’insertion de puits vierge en l’abaissant jusqu’à ce qu’elle touche le fond du puits. Assurez-vous que la broche courte repose au-dessus de la culture apicale au fond de l’insert du puits. Attendez que les valeurs de lecture numérique sur l’instrument TEER se stabilisent avant d’enregistrer la valeur.
Replacez les électrodes dans le PBS de Dulbecco pour les laver entre les mesures. Continuer à recueillir toutes les mesures TEER pour deux autres commandes d’insertion de puits vierges. Recueillir les mesures TEER des plaques d’échantillonnage comme démontré précédemment.
Une fois que toutes les mesures ont été effectuées, l’électrode est retournée dans la solution d’alcool isopropylique à 70% pendant 30 minutes. Déconnectez ensuite les électrodes de l’instrument TEER et laissez-les sécher à l’air. Calculez les valeurs TEER.
Aspirer le milieu du compartiment basolatéral et le remplacer par deux millilitres de milieu de croissance cellulaire endothéliale libre au rouge de phénol dans le modèle de barrière hémato-encéphalique de culture cellulaire triple. Lavez deux fois les cellules du compartiment apical avec HBSS. Ajouter un millilitre de la solution de dextrane FITC dans le compartiment apical et couvrir la plaque avec du papier d’aluminium, puis placer la plaque dans l’incubateur réglé à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant une heure.
Prenez 100 microlitres de milieu dans les compartiments basolatéraux et transférez-les dans une plaque noire de 96 puits. Mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques avec les longueurs d’onde d’excitation et d’émission réglées sur 480 et 530 nanomètres, respectivement. Ensemencez 200 microlitres d’HBMEC, d’astrocytes primaires et de HBVP au centre de plats à fond en verre de 35 millimètres enduits de poly-D-lysine à une densité de 150 000 cellules par plat.
Avant d’ensemencer HBMEC, enduire le fond de la vaisselle avec le facteur d’attachement. Laissez les cellules se fixer à la surface du verre en les laissant toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Une fois la confluence atteinte, jeter le milieu de culture et ajouter deux millilitres de milieu sans glucose préchauffé pour la privation d’oxygène-glucose ou de milieu normal pour les témoins.
Après le traitement par privation d’oxygène-glucose, remplacez le milieu par le milieu optimisé pour l’imagerie dans tous les plats, puis effectuez une imagerie de cellules vivantes en fluorescence avec le filtre GFP et l’incubateur de microscope confocale de l’étage supérieur, comme décrit dans le manuscrit textuel. L’intégrité de la barrière de la monocouche endothéliale dans les configurations de modèle de barrière hémato-encéphalique indiquées a été évaluée en déterminant TEER avant et après les privations oxygène-glucose, ainsi qu’après 24 heures de réoxygénation. Pendant quatre heures, la privation d’oxygène-glucose a entraîné une diminution significative des valeurs TEER uniquement dans la monoculture HBMEC et le modèle de co-culture avec HBMEC et HBVP.
Ces niveaux réduits ont atteint les niveaux de base après 24 heures de réoxygénation. Les valeurs TEER dans le modèle de co-culture triple étaient significativement plus élevées que celles des témoins de double co-culture ou du contrôle en monoculture immédiatement après la privation d’oxygène-glucose. La perméabilité paracellulaire des monocouches endothéliales à une masse moléculaire de 20 kilodaltons, FITC dextran, a été considérablement augmentée dans la monoculture HBMEC et, dans une moindre mesure, dans le modèle de co-culture avec HBMEC et HBVP par rapport aux témoins normoxiques.
De plus, les niveaux de perméabilité au dextran FITC de 20 kilodaltons étaient les plus faibles dans le modèle triple barrière cerveau-sang parmi tous les modèles dans des conditions normoxiques et de privation d’oxygène-glucose. Aucun changement n’a été observé dans le flux de dextrane FITC de 70 kilodaltons à travers les monocouches endothéliales dans aucun des modèles. Tous les types humains primaires exposés à la privation d’oxygène-glucose présentaient une forte fluorescence verte, prouvant que les cellules vivantes imagées étaient hypoxiques.
Après avoir ensemencé les péricytes vasculaires du cerveau humain du côté abluminal des inserts de puits, il est très important de les recouvrir de la plaque de retournement pour éviter l’évaporation. Dans notre modèle, nous utilisons un diamètre de pores relativement petit, de 0,4 micromètre, d’inserts de puits en polyester, ce qui le rend approprié pour le dépistage de candidats médicaments à toute maladie nécessitant le franchissement de la barrière hémato-encéphalique pour le traitement. Cette technique offre une excellente occasion de visualiser la modification des protéines et des transporteurs si nécessaire.
