Cette recherche a été soutenue par la DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft sous numéro de subvention FO 315/4-1 et la DFG SFB 688.

1. Isolement des microvaisseaux du cerveau <ol><li> Pour chaque préparation utiliser cinq à dix souriceaux nouveau-nés des deux sexes (3-5 jours). </li><li> Euthanasier une souris selon locaux IACUC / vétérinaire recommandations, retirez immédiatement le cerveau, et le transfert dans une boîte de Petri contenant la solution suivante: 15 mM de HEPES (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM de CaCl 2, 2H 2 x O, 2,6 mM de MgCl 2 x 6 H 2 O, 1% (p / v) de BSA (ci-après dénommé tampon A). </li><li> Sauf indication contraire, toutes les procédures d&#39;isolement doit être effectuée à la température ambiante (RT) (22-24 ° C) sous la hotte à flux laminaire. Couper le cerveau (cerveau sans cervelet et le tronc cérébral), après élimination des méninges et des fragments capillaires, dans le tampon A l&#39;aide d&#39;un scalpel stérile. Pipeter le tissu fragmente de haut en bas à l&#39;aide d&#39;une pipette 10 ml jusqu&#39;à ce sans grumeaux apparaissent. Transférer la suspension dans un tube Falcon de 50 ml et centrifuger à 250 xg pendant 5 min à température ambiante. </li></ol> Remarque: Méninges peut être identifié en tant que minces membranes transparentes, à la surface du tissu cérébral. Ils peuvent être soigneusement retiré avec une pince stérile. <ol start="4"><li> Jeter le surnageant. </li><li> Dissoudre le culot dans 4,5 ml de tampon A avec 1,5 ml de 0,75% (p / v) de la collagénase / dispase (Roche) et incuber pendant 45 min à 37 ° C dans un bain d&#39;eau (parfois secouer). </li><li> Pendant ce temps, préparer les plaques à 12 puits par enduction quatre puits avec du collagène IV (0,1 mg / ml dans 50 mM d&#39;acide acétique). Permettre de se conformer pendant 1 heure. </li><li> Arrêtez la digestion par addition de 15 ml de tampon glacé A. Remettre en suspension le culot à fond. </li><li> Centrifuger la suspension à 250 xg pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Pour supprimer la myéline, ajouter 10 ml de 25% (p / v) de BSA (Sigma, pureté&gt; 98%) et centrifuger à 1000 xg pendant 20 min à 4 ° C. 25% de BSA doit être dissoute dans du PBS 1x (PAA Laboratories) et filtré sur 0,2 f umiltre). </li><li> Eliminer délicatement le surnageant, dissoudre le culot dans 10 ml de tampon A et transférer dans un nouveau tube Falcon. </li><li> Centrifuger la suspension à 250 xg pendant 5 min à température ambiante. Le culot résultant contient les cellules endothéliales. </li><li> Laver deux fois le collagène IV-12-enduit et plaque avec du PBS. </li><li> Reprendre le culot dans 4 ml de milieu de culture (DMEM contenant 10% de SVF, 50U/ml pénicilline / streptomycine, 1% de L-glutamine) et la plaque de la suspension cellulaire dans deux puits de 2 ml dans chaque puits. Ajouter la puromycine à une concentration finale de 4 ng / ml et incuber pendant 45 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire. Cette étape permet d&#39;éliminer rapidement les cellules adhérentes. Remarque: La puromycine est ajouté pendant 24 heures. Seul le cerveau ECs peuvent le métaboliser, pour d&#39;autres types cellulaires puromycine est toxique 14. </li><li> Transférer le support 2 ml contenant des cellules non adhéré à l&#39;étape 1.14 dans deux puits frais (ces puits contiennent la fraction CE). Remplir les puits avec les cellules collées de step 1,14 avec 2 ml de milieu frais (ces puits contiennent d&#39;autres types cellulaires, par exemple, les fibroblastes, les astrocytes et peut être cultivé en parallèle et utilisés pour les comparaisons de la morphologie). </li><li> Changer le support le jour suivant. </li></ol> 2. Immortalisant les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau <ol><li> Cultiver le GP + E-86 Neo (GPENeo) 15 fibroblastes, sécrétant un virus déficient pour la réplication avec polyome moyen T oncogène dans du milieu DMEM contenant 10% de SVF inactivé par la chaleur, 50U/ml pénicilline / streptomycine et 2 mg / ml de G418 ( . PAA Laboratories) dans des flacons revêtus de gélatine Remarque: polyome milieu de transfection oncogène T provoque avantage de croissance des EC sur les non-ECS conduisant à une monocouche homogène de cellules avec une morphologie endothéliale 4 à 6 semaines de culture. GPENeo ne sont pas disponibles dans le commerce et peuvent être obtenues en tant que matériau public partagé (s&#39;il vous plaît se référer à des publications originales 4,16). </li><li> Pour utiliser le support contenant le virus de<html> immortalisation, cultiver les cellules GPENeo dans un milieu sans G418 pendant 24 h. </li><li> Prélever 10 ml du surnageant et ajouter GPEneo Polybrene (hexadiméthrine bromure) (Sigma) à une concentration finale de 8 pg / ml, stériliser par filtre de 0,45 um pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Retirez le milieu de croissance des cultures communautaires établis dans la partie 1 et ajouter 2 ml de surnageant GPEneo / Polybrene mélange dans les puits. Répétez cette opération le lendemain avec une nouvelle GPEneo surnageant / Polybrene mélange. Remarque: Polybrene est utilisé pour fabriquer des pores dans la paroi cellulaire afin de faciliter l&#39;infection avec les particules virales). </li><li> Retirer le surnageant GPEneo / Polybrene mélange le lendemain, laver les cellules deux fois avec du PBS et maintenir les cellules dans le milieu de croissance changeantes tous les 3 jours. À la confluence, diviser les cellules de collagène IV 1:2 sur des plaques revêtues. </li><li> En règle générale, stables endothéliales cérébrales lignées cellulaires (cend) doit être obtenu 4-5 semaines plus tard. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Cultiver les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau <ol><li> Décongeler les cellules de cryoaliquot au bain-marie et le transfert dans 15 ml Falcon-avec 10 ml préchauffé à moyen terme. </li><li> Centrifuger la suspension à 250 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirer moyen de transférer la pastille dans le collagène IV enduit T flacon de 25 cm2 de culture cellulaire avec un milieu de croissance préchauffé (densité cellulaire pour le placage doit être au moins 1x 10 4 cellules / ml). </li><li> Changer le milieu le lendemain, et après que les cellules ont atteint la confluence (généralement après 5 jours) diviser les cellules. </li></ol> 4. Fractionnement des cellules Cend (Note: Le fractionnement devrait être fait seulement une fois par semaine, éviter l&#39;éclatement supérieur à 1:4). <ol><li> Éliminer le milieu, laver les cellules avec du PBS. </li><li> Ajouter 3 ml d&#39;eau tiède trypsine-EDTA (PAA Laboratories) (T flacon de 75 cm2), incuber à 37 ° C et attendre que la couche des cellules est dispersée (habituellement dans les 5 à 15 minutes). </li><li> Ajouter 5 ml omilieu de croissance f, pipeter de haut en bas, et le transfert à un nouveau collagène IV enduit de ballon. </li></ol> 5. La congélation des cellules cend- <ol><li> Obtenir la suspension cellulaire tel que décrit à l&#39;étape 4 </li><li> Centrifuger la suspension à 250 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension les cellules (obtenu à partir de 1 T 75 cm 2 flacon) culot dans 6 ml milieu de congélation (95% milieu de croissance, 5% DMSO). </li><li> Diviser la suspension cellulaire en quatre 1,5 ml cryo-aliquotes. Remarque: Un cryo-aliquote peut être ensemencées sur T flacon de 25 cm2. </li><li> Conserver les aliquotes cryo-sous azote la température du liquide vapeur. </li></ol> cend milieu de croissance: 450 ml de DMEM, 10% SVF, 10 ml de L-glutamine, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 pyruvate natrium ml, 50 U / ml de pénicilline / streptomycine 6. Les résultats représentatifs Les cellules Cend et cerebEND ont été caractérisées par immunomarquages ​​de endothéliale une BBB marqueurs ainsi que par la mesure de la résistance électrique transendothéliale (TEER) et la perméabilité. Le Cend et cerebEND présentaient une morphologie similaire à des cultures primaires de cerveau EC, avec des monocouches de cellules allongées serrées qui présentaient une inhibition de croissance à confluence. Les cellules ont exprimé des niveaux détectables de bien claudine-5, occludine et VE-cadhérine protéines qui ont été localisées au niveau des jonctions cellule-cellule, comme indiqué par immunofluorescence (figure 3) 4,5. CEND cellules en culture en milieu sans sérum réduite conduit à une augmentation de la TEER (à partir de 150 Qcm 2 en présence de 10% de sérum de 500 Qcm 2 en présence de 2% de sérum), qui a été potentialisée par l&#39;ajout d&#39;hydrocortisone (800 Qcm 2) ou de l&#39;insuline (1.000 Qcm 2) 4. Des monocouches de Cend cultivées dans le sérum réduit moyenne pendant 21 jours a TEER de 900 Qcm 2 (figure 4). TEER a été mesurée à l&#39;aide d&#39;un ensemblecontenant des électrodes de passage du courant et de la tension de mesure (World Precision Instruments). A titre de comparaison, le premier micro-vasculaire cérébral EC a été signalé à avoir des valeurs TEER de 200-600 Qcm 2 et une lignée de souris disponible dans le commerce cellule bEnd.3 eu TEER valeurs de 100-140 Qcm 2 (pour revue récente, voir Abbé 2005 et Toth et al., 2011 17,18). En outre, le passage des macromolécules, telles que la non-chargé FITC-dextran des masses moléculaires 4, 10, 70 et 500 kDa, ou la fluorescéine (300 Da) à travers la monocouche de cend en milieu de différenciation 2% de SVF plus de 4 heures a diminué par rapport à des cellules témoins maintenues dans un milieu de croissance contenant 10% de FCS: flux paracellulaire a été réduite à 30% de cellules de contrôle de la fluorescéine, de 26% pour FITC-dextran 10 et 70 kDa, et le flux a été réduit à 4,5% des cellules de contrôle de FITC -dextrtan 500 kDa. Semblable à Teer valeurs, la perméabilité était au plus bas niveau dans les cellules cultivées en présence de glucocorticoids (GC) 4. Dans d&#39;autres études, nous avons identifié les gènes cibles des glucocorticoïdes, occludine, la claudine-5 et VE-cadhérine dans l&#39;endothélium vasculaire cérébral 4,7,9. GC traitement conduit à une augmentation de l&#39;expression de ces protéines et à la transposition de la VE-cadhérine au cytosquelette. La médiation directe GC-régulation des protéines des jonctions serrées occludine et la claudine-5 apparaît à travers des éléments de réponse GC dans leurs régions promotrices 4,7,19. En outre, la claudine-5 a été identifié comme une cible oestrogène roman vasculaire 10 endothélium. Sous-tend la dysfonction endothéliale nombreuses maladies différentes. Nous avons cultivé la cend sous oxygène / glucose privation (AMG) conditions. AMG a conduit à la perturbation de la fonction BBB, ce qui pourrait être reconstitué après un traitement combiné avec GC et inhibiteur du protéasome bortezomib 12. Conditions des autres ministères a conduit à une forte augmentation de la captation du glucose et de l&#39;expression des transpor glucosetres dans cerebEND, qui pourrait être atténué par l&#39;ajout de MK801, un inhibiteur non compétitif de l&#39;récepteur NMDA 13. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Figure 1. Morphologie des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (CEND) une semaine après l&#39;isolement. Images de microscopie optique ont été prises dans le cadre du 6x (A) et 15x (B) agrandissement. Les colonies île formés de cellules endothéliales sont visibles. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Figure 2. Morphologie des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (CEND) un mois après l&#39;isolement et l&#39;immortalisation. Images de microscopie optique ont été prises dans le cadre du grossissement 15x. A confluence, monocouche homogène de cellules endothéliales peuvent être observés. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Figure 3. Microvascul cerveau immortaliséar les cellules endothéliales expriment la claudine-5, occludine et VE-cadhérine. cellules ont été cultivées sur Cend collagène IV recouvertes de lamelles et colorées avec des anticorps contre la claudine-5 (A), occludine (B) et VE-cadhérine (C). Les images ont été prises avec un microscope Zeiss Axioscop2 sous le grossissement de 40x. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Figure 4. Mesure de la résistance électrique trans-endothéliale (TEER) de Cend monocouche. CEND ont été cultivées sur des filtres de collagène IV transwell-enduits (taille des pores 0,4 um). Après avoir atteint la confluence, les cellules ont été maintenues dans un milieu contenant 2% de FCS. TEER a été mesurée après 7, 14 et 21 à l&#39;aide d&#39;un ensemble contenant des électrodes de passage du courant et de la tension de mesure.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La procédure décrite peut être utilisée pour l&#39;isolement de complications microvasculaires ECs à partir de souches de souris différentes, ainsi que de différentes souches de souris knock-out pour étudier les changements spécifiques dans la fonction endothéliale vasculaire. En tant que méthode d&#39;immortalisation, nous avons utilisé la transformation avec des polyomavirus murin oncoprotéine, Polyome moyen T antigène. Il se transforme rapidement immatures cellules endothéliales in vivo et in vitro 20,21,22. D&#39;autres méthodes d&#39;immortalisation des contraceptifs d&#39;urgence décrites dans la littérature comprennent par exemple l&#39;immortalisation avec antigène T de SV40 grand nombre de virus simien vacuolisante 40 23, produit du gène E1A d&#39;adénovirus 24 ou la surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase humaine 3. L&#39;immortalisation avec PyMT est spécifique pour le murin EC immatures, ce qui permet d&#39;obtenir une culture homogène CE de souriceaux nouveau-nés dans un court laps de temps. Modifie les propriétés immortalisation des cellules et eles résultats obtenus avec e lignées cellulaires immortalisées devraient être comparés soit avec des cellules primaires ou à des expériences in vivo sur des souris. PyMT immortalisé CE a été décrit pour exprimer des niveaux élevés d&#39;activité fibrinolytique accrue résultant de la production de l&#39;urokinase-type plasminogen activator et une diminution de la production d&#39;inhibiteurs de l&#39;activateur du plasminogène 25. La comparaison directe des PyMT immortalisé bEND5 lignée cellulaire avec primaire ECs a révélé que dans les modèles in vitro BBB sont bien adaptés pour les études d&#39;adhérence cellulaire T 26. Les lignées cellulaires établies conformément à la procédure décrite peut être utilisée au nombre de passages bas afin de maintenir les propriétés de barrière par une expression élevée de protéines BBB et CE de jonction, comme les cellules perdent ces propriétés au cours du vieillissement. Ainsi, après la perte de propriétés de barrière, la préparation d&#39;une nouvelle lignée cellulaire doit être envisagé. Densité de placage cellule doit être élevée pour EC, car cela est essentiel pour la prolifération cellulaire. Ceci doit être pris en compte lors de la procédure d&#39;isolement ainsi que la maintenance de la immortalisé EC. Chaque nouvelle lignée cellulaire doit être testé pour ses propriétés de barrière et de contaminants possibles avec d&#39;autres types cellulaires. Monocouches CE peut être teinté avec l&#39;antigène du muscle anti-galactocérébroside, anti-protéine acide fibrillaire gliale et anti-lisse comme anticorps primaires pour exclure la contamination par les oligodendrocytes, les astrocytes et les péricytes 4,27. Afin d&#39;éliminer la contamination par les vaisseaux meningal, l&#39;expression de la thrombomoduline peut être testée, qui est exprimée dans tous les lits vasculaires, à l&#39;exception du cerveau 28. Fait intéressant, les lignées immortalisées de cellules endothéliales microvasculaires isolées à partir de différentes régions du cerveau diffèrent dans leurs propriétés de barrière et la sensibilité aux stimuli pro-inflammatoires. A titre d&#39;exemple, les cérébraux et cérébelleux Cend lignées cellulaires cerebEND peut citer 4,5. CerebEND a montré, en comparaisonà Cend, baisse des niveaux d&#39;expression des principaux composants des jonctions serrées claudine-1 et occludine. Cependant, les niveaux de claudine-3 et -12 ont été plus élevés dans cerebEND. La fonction de barrière de cellules cerebEND beaucoup plus souffert sous un traitement avec le médiateur inflammatoire, le TNF que les propriétés de barrière de cellules Cend fait 5. Vulnérabilité supérieur du cervelet à des stimuli inflammatoires, peuvent être observés in vivo chez les patients de sclérose en plaques et dans son modèle animal expérimental encéphalomyélite auto-immune 29. Ces résultats intéressants montrent la nécessité de produire et de caractérisation individuelle des modèles in vitro pour les différentes régions du cerveau, afin d&#39;améliorer le ciblage futur médicament dans le cerveau.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Pureté&gt; 98% </td></tr><tr><td> collagène IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 pg / ml dans 50 mM d&#39;acide acétique </td></tr><tr><td> Collagénase / dispase </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modifié Eagle (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal (FCS) </td><td> Laboratoires AAP </td><td> A15110-1333 </td><td> concentration finale 10%, inactivé à la chaleur (30 min à 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Stockage: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Stockage: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-pyruvate </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Néomycine (G418) </td><td> Laboratoires AAP </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Acides aminés non essentiels (AEN) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> Stockage à 4 ° C </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Stockage: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrène (hexadiméthrine bromure) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> 0,8 mg / ml dans du PBS, un stockage à -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, 0,02% d&#39;EDTA dans du PBS </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

Les cellules épithéliales et endothéliales (CE) sont la construction de barrières paracellulaires qui protègent le tissu de l&#39;environnement externe et interne. La barrière hémato-encéphalique (BHE) constituée des CE, astrocytes finaux pieds, péricytes et la membrane basale est responsable de la protection et de l&#39;homéostasie du parenchyme cérébral. Dans les modèles in vitro BBB sont des outils communs pour étudier la structure et la fonction de la BHE au niveau cellulaire. Un nombre considérable de différents modèles in vitro BBB ont été établis pour la recherche dans différents laboratoires à ce jour. Habituellement, les cellules sont obtenues à partir de bovins, porcins, les tissus du cerveau de rat ou de la souris (examinée en détail dans la revue de Wilhelm et al. 1). Échantillons de tissus humains ne sont disponibles que dans un nombre restreint de laboratoires ou d&#39;entreprises 2,3. Alors que les préparatifs de cellules primaires prennent du temps et les cultures communautaires peuvent varier d&#39;un lot à l&#39;autre, la mise en place d&#39;immortalisé CE lines est le centre d&#39;intérêt scientifique. Ici, nous présentons une méthode pour établir un cerveau immortalisé endothéliales des microvaisseaux du cerveau de souris en ligne néonatale. Nous décrivons la procédure étape par étape, la liste des réactifs et des solutions utilisées. La méthode établie par notre laboratoire permet l&#39;isolement d&#39;une ligne homogène de cellules immortalisées endothéliales dans les quatre à cinq semaines. Les lignes de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau appelée Cend 4 (à partir de cortex cérébral) et cerebEND 5 (à partir de cortex cérébelleux), ont été isolées selon cette procédure dans le laboratoire Förster et ont été effectivement utilisés pour l&#39;explication des différents processus physiologiques et pathologiques au Bureau. Utilisation Cend et cerebEND nous avons démontré que ces cellules répondent aux glucocorticoïdes et d&#39;oestrogènes 4,6-9-traitement 10 ainsi que de pro-infammatory médiateurs, comme le TNFalpha 5,8. En outre, nous avons étudié la pathologie de multiples sclerosis 11 et 12,13 hypoxie sur l&#39;échelon communautaire. Le Cend et lignes cerebEND peut être considéré comme un bon outil pour étudier la structure et la fonction de la BHE, les réponses cellulaires d&#39;ECS à différents stimuli ou de l&#39;interaction de la CE avec des lymphocytes ou des cellules cancéreuses.

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Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Cette méthode décrit comment isoler et d&#39;immortaliser les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris. Nous décrivons un protocole étape par étape à partir de l&#39;homogénéisation du tissu cérébral, phases de digestion, l&#39;ensemencement et l&#39;immortalisation des cellules. Habituellement, cela prend environ cinq semaines pour obtenir un ensemble homogène, immortalisé ligne de cellules endothéliales microvasculaires.

Génération d&#39;une ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle barrière hémato-encéphalique

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

18.7K vues.  University of Wurzburg. Cette méthode décrit comment isoler et d'immortaliser les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris. Nous décrivons un protocole étape par étape à partir de l'homogénéisation du tissu cérébral, phases de digestion, l'ensemencement et l'immortalisation des cellules. Habituellement, cela prend environ cinq semaines pour obtenir un ensemble homogène, immortalisé ligne de cellules endothéliales microvasculaires.

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle expérimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Une évaluation In Vivo de la perturbation de la barrière hémato - encéphalique dans un modèle de Rat d’accident vasculaire cérébral ischémique

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Un modèle préclinique pour évaluer le rétablissement du cerveau après un AVC aigu chez les rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

Explants cochléaires néonatals entiers comme modèle in vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Mesure de la résistance transendothéliale pour évaluer l’intégrité de la barrière cellulaire

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Pleins feux sur l’auteur : Applications de la détection TEER pour évaluer l’intégrité de la barrière cellulaire 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Enregistrement de l’intégrité fonctionnelle de la barrière sur les cellules endothéliales vasculaires bEnd.3 via la détection de résistance électrique transendothéliale

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...