Les auteurs remercient le Dr Wolf-Dieter Stalz, le Dr Arnaud Remy, le Dr Anton Posch, la Dre Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi et Jeff Durban pour leur examen critique et leur édition de ce manuscrit. Les auteurs remercient également Allison Schwartz pour son soutien technique.

1. Préparation de l’échantillon de protéines
(Une procédure typique pour extraire des protéines de la culture cellulaire est décrite)
<ol><li>Placez le plat de culture cellulaire HeLa dans de la glace et lavez les cellules avec une solution saline tamponnée tris glacée (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM).</li>
	<li>Aspirer le TBS, puis ajouter 1 ml par tampon RIPA glacé de 100 mm (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% de désoxycholate de sodium, 0,1% SDS) complété par des inhibiteurs de la phosphatase et de la protéase.</li>
	<li>Gratter les cellules adhérentes du plat à l’aide d’un grattoir à cellules en plastique froid; transférer doucement la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation pré-cool.</li>
	<li>Maintenir une agitation constante pendant 30 min à 4 °C sur un rotateur.</li>
	<li>Tourner à 16 000 x g pendant 20 min dans une centrifugeuse pré-recolée à 4 °C.</li>
	<li>Retirez délicatement le tube de la centrifugeuse et placez-le sur de la glace. Transférer le surnageant dans un tube frais conservé sur la glace et jeter le culot.</li>
	<li>Retirer un petit volume (10-20 μl) de lysat pour effectuer un dosage protéique. Déterminer la concentration en protéines pour chaque échantillon à l’aide de la trousse d’analyse RC DC.</li>
	<li>Si nécessaire, aliquotez les échantillons de protéines pour un stockage à long terme à -20 °C. Les cycles répétés de gel et de dégel provoquent la dégradation des protéines et doivent être évités.</li>
	<li>Prélever environ 20 μg de chaque échantillon, ajouter un volume égal de 2x tampon d’échantillon Laemmli (4 % de FDS, 10 % de 2-mercaptoéthanol, 20 % de glycérol, 0,004 % de bleu de bromophénol, 125 mM de Tris-HCl, pH 6,8).</li>
	<li>Chauffer chaque lysat cellulaire dans un tampon d’échantillon à 95 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Centrifuger à 16 000 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 min.</li>
</ol>2. Électrophorèse sur gel avec des gels sans taches (~ 30 min)
<ol><li>Prenez un critère TGX Tout gel préfabriqué sans tache KD (un gel au format midi), retirez le peigne et le ruban adhésif du bas de la cassette.</li>
	<li>Placer la cassette dans la cellule Criterion et remplir la chambre tampon supérieure intégrée avec un tampon de fonctionnement de 60 ml (Tris 25 mM, glycine 190 mM, SDS à 0,1%, pH 8,3). Rincez les puits avec un tampon en cours d’exécution.</li>
	<li>Remplissez chaque moitié du réservoir tampon inférieur avec un tampon de fonctionnement de 400 ml jusqu’à la ligne de remplissage marquée.</li>
	<li>Chargez les échantillons de protéines et les marqueurs protéiques appropriés.</li>
	<li>Placez le couvercle sur le réservoir, en alignant les bouchons banane à code couleur avec les prises correspondantes sur le couvercle.</li>
	<li>Exécutez le gel pendant ~ 30 min à 200 V ou 20 min à 300 V.</li>
</ol>3. Imagerie en gel sans tache à l’aide du système Chemidoc MP pour vérifier la qualité de la séparation des protéines (~ 5 min)
<ol><li>Retirez la cassette de gel de la cellule. Utilisez l’outil d’ouverture de la cassette de gel dans le couvercle de Criterion Cell pour ouvrir la cassette et libérer le gel.</li>
	<li>Appliquez quelques millilitres d’eau au centre du plateau d’échantillonnage UV de l’imageur ChemiDoc MP. Soulevez soigneusement le gel de la cassette et placez-le sur le plateau.</li>
	<li>Lancez le logiciel Image Lab et capturez l’image de gel sans tache (Figure 1A) avec les paramètres suivants : Application: gel sans taches Temps d’activation du gel: 1 min Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image : optimisé automatiquement pour les bandes les plus intenses</li>
	<li>Retirez le gel du bac à échantillons et passez immédiatement à l’étape de transfert.</li>
</ol>4. Transfert de protéines avec le système Turbo Trans-Blot (~ 10 min)
<ol><li>Ouvrez un Pack de transfert Pvdf Turbo Midi Trans-Blot; placez la pile inférieure (qui comprend la membrane) sur la base de la cassette de transfert.</li>
	<li>Placez le gel sur le dessus de la membrane, placez la pile supérieure sur le gel et déroulez des bulles.</li>
	<li>Placez le couvercle sur la base de la cassette et tournez le cadran pour le verrouiller.</li>
	<li>Insérez la cassette dans la baie du buvard.</li>
	<li>Démarrez le transfert en sélectionnant un programme Turbo prédéfini et en choisissant la taille de gel Criterion (midi), puis appuyez sur EXÉCUTER. Une course typique ne prend que 7 min.</li>
	<li>Lorsque le transfert est terminé, démontez le sandwich buvard et placez le transfert et le gel dans un récipient contenant de l’eau désionisée.</li>
</ol>5. Imagerie gel et tache sans tache à l’aide du système Chemidoc MP pour vérifier l’efficacité et la qualité du transfert de protéines (~ 5 min)
<ol><li>Placez le gel post-transfert sur le plateau d’échantillonnage de l’imageur ChemiDoc MP.</li>
	<li>Lancez le logiciel Image Lab et capturez l’image sans tache du gel post-transfert (Figure 1B) avec les paramètres suivants : Application: gel sans taches Temps d’activation du gel: aucun Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image: identique au temps d’exposition pour l’image de gel prétransfert</li>
	<li>Retirez le gel du bac d’échantillonnage, puis imaginez la tache(Figure 1C)avec les réglages suivants. Gardez la tache humide avec quelques gouttes d’eau ou TBST lors de l’imagerie. Application: tache sans taches Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image : optimisé automatiquement pour les bandes les plus intenses</li>
	<li>Retirez la membrane buvarde du bac d’échantillonnage et placez-la dans un récipient contenant tbst (0,1% Tween 20 dans tbs).</li>
</ol>6. Incubation des anticorps
<ol><li>Bloquer en plaçant la tache dans une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 3% dans TBST à température ambiante pendant 1 heure.</li>
	<li>Incuber la tache pendant une nuit à 4 °C dans la solution contenant de l’anticorps primaire de souris élevé contre la première protéine cible et de l’anticorps primaire de lapin élevé contre la deuxième protéine cible.</li>
	<li>Versez la solution contenant l’anticorps primaire. Ensuite, lavez la tache en agitant dans 20 ml de TBST pendant 5 min. Répétez 4x pour un total de 5 lavages.</li>
	<li>Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans la solution d’anticorps secondaire contenant un anticorps conjugué Dylight 650 goat-anti-mouse et un anticorps conjugué Dylight 549 goat-anti-rabbit.</li>
	<li>Versez la solution contenant l’anticorps primaire. Ensuite, lavez la tache en agitant dans 20 ml de TBST pendant 5 min. Répétez 4x pour un total de 5 lavages.</li>
</ol>7. Imagerie et analyse des données par le logiciel Image Lab - Normalisation des protéines totales (~ 5 min)
<ol><li>Acquérir une image fluorescente multiplexante du transfert(Figure 1E)en ouvrant un nouveau protocole multicanal, configurer trois canaux fluorescents et exécuter le protocole. Canal 1 : Application: blot Dylight 650 Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image : optimisé automatiquement pour les bandes les plus intenses Canal 2 : Application: tache Dylight 549 Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image : optimisé automatiquement pour les bandes les plus intenses Canal 3 : Application: tache sans taches Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image: optimisé automatiquement pour les bandes les plus intenses</li>
	<li>Cliquez sur l’icône Normalisation dans la zone Outil Analyse (Analysis Tool Box) et cliquez sur Oui pour détecter les voies et les bandes.</li>
	<li>Sélectionnez et utilisez « Outils voies et bandes » pour apporter des ajustements aux voies et aux bandes au besoin.</li>
	<li>Sélectionnez l’image sans tache comme canal de normalisation.</li>
	<li>Sélectionnez Outils d’analyse MW et attribuez les voies standard MW en cochant les cases en dessous.</li>
	<li>Pour afficher les volumes normalisés, cliquez sur la table d’analyse dans la barre d’outils. Tous les calculs seront effectués automatiquement par le logiciel, y compris le facteur de normalisation et les volumes normalisés. Les valeurs d’intensité de la bande protéique cible sont maintenant ajustées pour tenir compte de la variation de la charge protéique. Cela permettra des comparaisons précises des protéines cibles parmi les échantillons.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls:+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting.">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li><li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia.">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li><li>Casta&#241;o, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+Proteins:+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation.">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li><li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2++signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle.">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li><li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li><li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+human+skeletal+muscle+fibers.">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li><li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney.">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+proteins:+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies.">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+genes;+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells.">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li><li>G&#252;rtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis.">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li><li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis.">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li><li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage.">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li><li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta:+general+protein+stains+are+the+benchmark.">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li><li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+temperature,+oxidative+stress,+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers.">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li><li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY&#913;A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian.">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRY&#913;A Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li><li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting.">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats.">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li><li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+of+troponin+I+(fast)+increases+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans.">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li><li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li><li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+Data+are+not+created+Equal.">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li><li>P&#233;rez-P&#233;rez, R., L&#243;pez, J. A., Garc&#237;a-Santos, E., Camafeita, E., G&#243;mez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fern&#225;ndez-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity.">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls:+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development.">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Romero-Calvo, I., Oc&#243;n, B., Mart&#237;nez-Moya, P., Su&#225;rez, M. D., Zarzuelo, A., Mart&#237;nez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots.">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li><li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro.">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).</li><li>Welinder, C., Ekblad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+staining+as+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).</li><li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins:+application+to+corneal+disease.">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li></ol>

Les auteurs, Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond et Ning Liu sont des employés de Bio-Rad Laboratories, Inc.

Le protocole V3 sans taches décrit ci-dessus est pour multiplexer le buvard occidental fluorescent. Il peut également être appliqué dans le western blotting en utilisant la détection chemiluminescente. Dans le protocole western de tache fluorescent multiplex, les images de tache-libre de tache sont acquises à deux points de temps : 1) juste après le transfert de protéine ; 2) à l’étape d’imagerie fluorescente multiplex après incubation d’anticorps. La première image sans tache est utilisée pour calculer l’efficacité de transfert et la seconde image sans tache est utilisée comme contrôle de chargement. Lorsque la méthode chemiluminescente est appliquée, il n’est pas possible de prendre une image multiplex pour les signaux sans tache et les protéines cibles, car le signal chimioluminescent apparaîtra également dans le canal sans tache. Dans ce cas, nous recommandons d’utiliser l’image sans tache prise juste après l’étape de transfert de protéine pour le contrôle de chargement et l’analyse de normalisation.
Le flux de travail western V3 offre les avantages uniques suivants par rapport au flux de travail western blot traditionnel qui utilise des protéines de gestion interne comme contrôles de chargement :
Tout d’abord, le flux de travail V3 fournit un contrôle de chargement pratique, pratique et plus fiable pour valider les changements dans le niveau de la protéine d’intérêt. Le protocole V3 utilise un contrôle de charge totale en protéines pour normaliser le niveau de la protéine d’intérêt mesurée dans chaque échantillon. Il évite deux pièges de l’utilisation des protéines d’entretien ménager comme contrôles de charge: immunodétection saturée et niveaux d’expression de protéines de ménage incohérents parmi les échantillons dans certaines conditions expérimentales. Il n’est plus nécessaire de décaper et de réprouiller les étapes avec des anticorps dirigés contre l’entretien ménager. En utilisant la technologie sans tache, il n’est pas nécessaire de tacher et de détaper une tache avec des taches telles que Coomassie ou Sypro Ruby pour la mesure des protéines totales. Il ne faut que quelques secondes pour acquérir une image de tache et environ 5 minutes pour effectuer la normalisation totale des protéines à l’aide du logiciel Image Lab.
Deuxièmement, le flux de travail V3 permet aux scientifiques de mieux contrôler la procédure occidentale car il rend la procédure plus transparente et introduit plusieurs points de contrôle pour le contrôle de la qualité. Avec l’aide de la technologie sans taches, les chercheurs peuvent visualiser leurs échantillons de protéines sur le gel et la tache. Les scientifiques peuvent évaluer l’intégrité des échantillons de protéines (dégradées ou non), la qualité de la séparation (précipitée ou non), l’efficacité du transfert et la qualité du transfert (même le transfert ou non). Ces points de contrôle aident les recherches à mettre fin à l’expérience lorsqu’elles voient de gros défauts dans le processus et évitent de perdre du temps sur de mauvais échantillons et des taches. Cette technologie aide également les scientifiques à évaluer s’il y a une quantité importante de perte de protéines après le décapage de la membrane et si le transfert convient pour réprouillar une cible différente 4.
Voici quelques conseils pour garantir une bonne expérience et des données de qualité à l’aide du flux de travail V3 western.
<ol><li>Imagez le gel immédiatement après la course du gel. Ne trempez pas le gel dans un tampon avant la première imagerie de la procédure, car il pourrait laver le composé de coloration.</li>
	<li>Utilisez la même zone d’imagerie pour acquérir toutes les images du protocole. Cela permettra au logiciel de superposer des images pour l’analyse de données telles que la normalisation des protéines totales.</li>
	<li>Gardez le temps d’exposition cohérent lors de l’imagerie des gels prétransfert et post-transfert. Cela permettra au logiciel de mesurer quantitativement l’efficacité du transfert.</li>
	<li>Gardez la membrane humide avec quelques gouttes d’eau ou tbst lors de l’acquisition de l’image de tache. Cela évitera d’éventuels problèmes de fond sales pour la détection des protéines cibles.</li>
	<li>Utilisez une membrane PVDF à faible fluorescent pour multiplexer le buvard occidental fluorescent.</li>
</ol>Il est important de noter que la molécule sans tache après activation UV est irréversiblement liée aux résidus de tryptophane. Cette modification irréversible peut potentiellement affecter la reconnaissance d’antigène lors de l’utilisation d’anticorps monoclonaux si l’épitope contient du tryptophane. Il est peu probable que les anticorps polyclonaux soient affectés parce qu’ils reconnaissent des épitopes multiples sur l’antigène. Les molécules non liées sans tache sont facilement lavées du gel et de la membrane et n’interféreront donc pas avec les interactions anticorps-antigène.
En conclusion, le flux de travail western V3 rend le processus western blot plus rapide, plus transparent, quantitatif et plus fiable. Les chercheurs peuvent maintenant facilement appliquer le contrôle de la charge totale en protéines dans une expérience western blot pour rendre leurs données plus fiables. Le flux de travail sans taches V3 a été adopté par un certain nombre de laboratoires, et leurs publications ont démontré que les revues acceptent les données sans taches comme contrôle de chargement dans western blot22,17,7,8,5,23,18,15.

Western blot est une technique très utile9, cependant, il y a deux défis majeurs avec western blotting: processus long et laborieux et la qualité des données. Un protocole traditionnel nécessite environ 2 jours. Il implique de nombreuses étapes, y compris la préparation de l’échantillon, la coulée de gel, l’électrophorèse et le transfert de protéines, le blocage de la membrane suivi de l’incubation d’anticorps, l’imagerie et, bien souvent, le décapage, la réprobation et enfin l’analyse des données. Tout au long de ce processus, il n’y a pas d’outils fiables et flexibles pour le contrôle des processus. En tant que tel, des erreurs peuvent être introduites à chaque étape, et ces erreurs ont le potentiel de générer des artefacts de données ; par conséquent, les contrôles de chargement sont essentiels dans le western blotting pour identifier et corriger les erreurs. Le contrôle de la charge se fait généralement en vérifiant le niveau de protéines d’une protéine de référence dans chaque échantillon pour voir si elle est présentée de manière égale. Les gens utilisent souvent des protéines d’entretien ménager, telles que la β-actine, la β-tubuline, le GAPDH, comme contrôle de la charge. 
La qualité des données sur le transfert western dépend d’un contrôle fiable du chargement. Mais il y a deux préoccupations légitimes lors de l’utilisation de protéines de ménage pour les contrôles de charge : 1) l’immunodétection à base d’anticorps des bandes de protéines de ménage sont souvent saturées et donc on ne peut pas distinguer les différences de charge entre les échantillons30; 2) le niveau d’expression des protéines d’entretien ménager peut varier dans les échantillons dans certaines conditions expérimentales, par exemple, le traitement de l’ARNsi, la mort cellulaire, la différenciation cellulaire, etc.11,28,3,6,10,21. En raison de ces préoccupations, les revues scientifiques exigent maintenant que « pour les comparaisons quantitatives, des réactifs, des contrôles et des méthodes d’imagerie appropriés avec des plages de signaux linéaires devraient être utilisés » (ligne directrice sur la nature). De même, les rédacteurs en chef du Journal of Clinical Investigation demandent des contrôles de chargement plus fiables24. Pour ces raisons, une protéine d’entretien doit être validée afin d’être utilisée comme contrôle de charge. Tout d’abord, il faut s’assurer qu’il est mesuré dans la plage dynamique linéaire de la méthode d’immunodétection14,29. Deuxièmement, il faut s’assurer qu’il est exprimé de manière cohérente dans tous les échantillons26,31,25,19,20.
Une solution alternative à un contrôle de charge fiable consiste à utiliser la mesure des protéines totales à partir de la tache. Certains chercheurs ont taché les taches avec des taches de protéines totales, telles que Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S, et la technologie sans taches, pour mesurer le signal de protéines totales dans chaque voie comme contrôle de charge16,20,13,27,1,4,12. Le contrôle de la charge totale en protéines évite les pièges associés aux protéines d’entretien ménager. Tout d’abord, c’est un reflet fidèle de la quantité de protéines chargée pour chaque échantillon. Deuxièmement, la coloration protéique totale présente une excellente plage dynamique linéaire dans la plage de charge commune pour l’analyse western blot (protéine 10-50 μg d’un lysat cellulaire complexe) et différencie avec précision la différence de charge entre les échantillons12.
La technologie sans tache est une nouvelle méthode de coloration des protéines totales où un composé unique est mélangé dans une solution de gel d’acrylamide et distribué uniformément dans le gel coulé. Une fois l’électrophorèse terminée, le gel est exposé à la lumière UV pendant au moins 1 min afin que le composé de coloration réagisse avec les résidus de tryptophane dans la protéine. Les protéines deviennent excitables sous la lumière UV pour donner un signal fluorescent fort qui peut être visualisé et quantifié dans un imageur sans tache tel que le système ChemiDoc MP. Le composé sans tache lui-même, cependant, n’absorbe pas la lumière UV, ce qui entraîne un faible fond de l’image du gel. La modification des résidus de tryptophane est irréversible et les protéines peuvent être visualisées non seulement dans le gel, mais aussi sur la tache à tout moment après le transfert de protéines.
La technologie sans taches est appliquée dans le flux de travail V3 Western (Figure 1) pour répondre aux principales plaintes concernant le flux de travail traditionnel, en particulier les préoccupations liées à l’utilisation de protéines d’entretien ménager comme contrôles de chargement. En utilisant ce flux de travail, on pourrait: 1) exécuter un gel en environ 20-30 min, 2) vérifier l’intégrité de l’échantillon et la qualité de la séparation des protéines en 5 min après l’exécution du gel; 3) transférer des protéines en 3-10 min; 4) vérifier quantitativement l’efficacité du transfert; et 5) plus important encore, valider les changements dans le niveau de la protéine d’intérêt en utilisant le contrôle de la charge totale en protéines.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>567-8093 </td>
 <td>Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4157 </td>
 <td>Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-5061</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Criterion Cell </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>165-6100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4155</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChemiDoc MP System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-8280</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting

Le western blot est une technique de laboratoire très utile et largement adoptée, mais son exécution est difficile. Le flux de travail est souvent caractérisé comme une « boîte noire » parce qu’un expérimentateur ne sait pas s’il a été effectué avec succès jusqu’à la dernière de plusieurs étapes. De plus, la qualité des données sur le transfert western est parfois mise à l’épreuve en raison d’un manque d’outils efficaces de contrôle de la qualité en place tout au long du processus de western blotting. Nous décrivons ici le flux de travail occidental V3, qui applique la technologie sans tache pour répondre aux préoccupations majeures associées au protocole western blot traditionnel. Ce flux de travail permet aux chercheurs: 1) d’exécuter un gel en environ 20-30 min; 2) visualiser la qualité de séparation de l’échantillon dans les 5 minutes suivant l’exécution du gel; 3) transférer des protéines en 3-10 min; 4) vérifier quantitativement l’efficacité des transferts; et surtout 5) pour valider les changements dans le niveau de la protéine d’intérêt en utilisant le contrôle de la charge totale en protéines. Cette nouvelle approche élimine le besoin de décaper et de réprouillant la tache pour les protéines d’entretien ménager telles que la β-actine, la β-tubuline, le GAPDH, etc. Le flux de travail sans tache V3 rend le processus western blot plus rapide, transparent, plus quantitatif et plus fiable.

1. Évaluation de l’intégrité de l’échantillon, de la qualité de la séparation des protéines et de l’efficacité du transfert avec des images de gel sans taches.
L’extrait de protéine des cellules de HeLa ont été séparés à 300 V pendant la minute 20 sur un gel sans tache du critère anyKD TGX de 18 puits. Les échantillons de protéines ont été chargés 3 fois à quatre quantités différentes (voies 1-3, 40 μg; Voies 4-6, 30 μg; Voies 7-9, 20 μg; Voies 10-12, 10 μg). Le gel a été activé sous la lumière UV pendant 1 min. La figure 2A montre l’image du gel acquise juste après la séparation des protéines. L’intégrité de l’échantillon de protéines(p. ex. dégradation) et la qualité de la séparation(p. ex. précipitation des protéines) peuvent être évaluées visuellement avec cette image de gel. Les protéines ont ensuite été transférées pendant 7 minutes dans une membrane de nitrocellulose à l’aide de Trans-Blot Turbo. La figure 2B montre l’image sans tache du gel post-transfert. Les deux images ont été acquises avec le même temps d’exposition (6.8 sec). Les voies 3 et 12 ont été choisies pour mesurer l’efficacité du transfert. À l’aide de l’outil de volume du logiciel Image Lab, une boîte rectangulaire (bleue) a été dessinée pour couvrir les voies 3 et 12 sur les deux images de gel. Le calcul basé sur les valeurs de volume de ces boîtes a indiqué que l’efficacité de transfert des deux voies était de 80 %(figure 2C). Dans cette expérience, le gel AnyKD TGX a été sélectionné pour étudier les protéines cibles de petite à moyenne taille et il n’a pas été optimisé pour le transfert de grandes protéines. L’optimisation de l’efficacité du transfert nécessiterait l’utilisation d’un pourcentage de gel inférieur(par exemple 4-20%) et/ou un ajustement du temps de transfert pour faciliter le transfert de grosses protéines. 2. Le contrôle de la charge totale en protéines sans tache est une alternative fiable au contrôle de la charge d’entretien ménager dans le western blotting pour quantifier un petit changement dans le niveau de protéines d’intérêt.
MCM-7 est un facteur de réplication d’autorisation d’ADN dont le niveau diminue de 20-50% dans les lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL) après traitement par irradiation. Dans cette expérience, les lysats (30 μg chacun) de quatre cultures de lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL) témoins et traitées par irradiation ont été séparés sur un gel sans coloration AnyKD TGX à 12 puits. Le gel a été activé pendant 1 minute sous la lumière UV et transféré par Trans-Blot Turbo à une membrane PVDF pour immunoblotting. La protéine d’entretien ménager GAPDH (vert) a été sondée avec un anticorps de lapin (Cell Signaling Technology, Etats-Unis, 1:2.500) et un anticorps conjugué de chèvre-anti-lapin Dylight 549 (Rockland, Etats-Unis, 1:20.000). La protéine d’intérêt MCM-7 (rouge) a été sondée à l’aide d’un anticorps de souris (Abcam, États-Unis, 1:1 000) et d’un anticorps conjugué goat-anti-souris Dylight 649 (Rockland, 1:10 000).
La figure 3A montre une image fluorescente multiplex de protéines totales (bleu), MCM-7 (rouge) et GAPDH (vert) détectées dans quatre échantillons de LCL traités par contrôle et irradiation. La figure 3B est une image sans tache du même transfert montrant les profils de protéines totales dans chaque échantillon (30 μg). Le logiciel de laboratoire d’images a sélectionné les voies d’échantillonnage (boîtes bleues) pour mesurer le MCM-7, le GAPDH et le volume total de protéines dans chaque voie. Les niveaux MCM-7 ont été normalisés contre la mesure totale sans tache de protéine ou contre GAPDH. Les niveaux normalisés de protéine MCM-7 ont été statistiquement analysés et le volume moyen de bande de protéine MCM-7 et l’écart-type (n = 4) sont présentés dans le graphique(Figure 3C). Les deux méthodes de normalisation ont révélé une légère diminution (environ 25 %) dans les niveaux de protéine MCM-7 après traitement d’irradiation. Les données avec la normalisation totale des protéines ont montré un écart-type plus petit que celui avec GAPDH comme contrôle de charge.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> Figure 1. Flux de travail ouest V3. Le flux de travail V3 est représenté dans la colonne de gauche en 4 étapes. Les principaux instruments et réactifs utilisés dans le flux de travail sont indiqués à chaque étape. Le temps estimé pour chaque étape est également inclus. La colonne de droite indique qu’un minimum de 4 images peuvent être générées dans le flux de travail V3. L’utilisation de chaque donnée est décrite. Les images sans tache du gel prétransfert, du gel post-transfert et de la tache (A, B, C) ne peuvent pas être générées facilement avec les techniques occidentales traditionnelles de buvardage; Ces images et données fournissent des informations importantes et des points de contrôle tout au long de la procédure pour améliorer le contrôle et la reproductibilité du flux de travail du transfert western par le scientifique. Les signaux de la protéine cible peuvent être capturés soit sur une image de tache chimiluminescente(D)si un anticorps secondaire conjugué HRP a été appliqué en détection, soit sur une image fluorescente(E)si le bblotting occidental fluorescent multiplexant a été effectué pour détecter plus d’une protéine cible simultanément sur la même tache. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> Figure 2. Images sans tache des gels prétransfert et post-transfert dans le flux de travail V3 western pour évaluer l’intégrité des échantillons, la qualité de la séparation et l’efficacité du transfert. (A) Image sans tache de gel de prétransfert. (B) Image sans tache de gel post-transfert. (C) Mesure de l’efficacité du transfert de protéines.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> Figure 3. Comparaison de la mesure des protéines totales sans taches à l’immunodétection GAPDH en tant que contrôles de charge pour normaliser le niveau de protéine d’intérêt. (A) Image fluorescente western blot. (B) Image de tache sans tache. (C) Niveaux normalisés de protéine MCM-7. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>

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V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Le flux de travail V3 est une procédure western blot utilisant des gels sans taches. La technologie sans taches permet aux chercheurs de visualiser la qualité de la séparation des protéines, de vérifier l’efficacité du transfert et, plus important encore, de valider le changement dans la protéine d’intérêt en utilisant la quantification des protéines totales comme contrôle de charge fiable.

Flux de travail sans taches V3 pour un contrôle pratique, pratique et fiable de la charge totale en protéines dans Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K vues.  Bio-Rad Laboratories. Le flux de travail V3 est une procédure western blot utilisant des gels sans taches. La technologie sans taches permet aux chercheurs de visualiser la qualité de la séparation des protéines, de vérifier l’efficacité du transfert et, plus important encore, de valider le changement dans la protéine d’intérêt en utilisant la quantification des protéines totales comme contrôle de charge fiable.

Vidéo: V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Western blot en utilisant l&#39;Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Recherche

Biologie

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to elaborate distinct aspects of motor function and to determine even subtle loss of movement capacity. To enhance efficacy and resolution of testing, tests should permit qualitative and quantitative measures of motor function and be sensitive to changes in performance during recovery periods. The present study describes a new task to assess skilled walking in the rat to measure both forelimb and hindlimb function at the same time. Animals are required to walk along a horizontal ladder on which the spacing of the rungs is variable and is periodically changed. Changes in rung spacing prevent animals from learning the absolute and relative location of the rungs and so minimize the ability of the animals to compensate for impairments through learning. In addition, changing the spacing between the rungs allows the test to be used repeatedly in long-term studies. Methods are described for both quantitative and qualitative description of both fore- and hindlimb performance, including limb placing, stepping, co-ordination. Furthermore, use of compensatory strategies is indicated by missteps or compensatory steps in response to another limb&#x2019;s misplacement. 

The ladder rung walking task is a new test to assess skilled walking and measure both forelimb and hindlimb placing, stepping, and inter-limb co-ordination.

Le barreau d&#39;échelle Marche Tâche: Un système de notation et son application pratique.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: préparation d&#39;échantillons à la détection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Un flux de travail de remise en forme Analyse quantitative

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

Soins et entretien réguliers d&#39;un poisson zèbre (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratoire: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Une méthode pratique et roman d&#39;extraire l&#39;ADN génomique à partir de kits de prélèvement sanguin pour la préservation Plasma Protein

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Un guide pratique pour Phylogenetics pour non-experts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

Le plus rapide de l&#39;Ouest dans la ville: une touche contemporaine sur l&#39;analyse classique western blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...