Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et la Fondation George E. Hewitt bourse (AP).

L&#39;électrophorèse sur gel Note technique: Avant de commencer la procédure, vous avez votre échantillons de protéines prêt. Durant cette première étape, les protéines de l&#39;échantillon sont séparés selon leur poids moléculaire en utilisant électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (PAGE). Le Tampon NuPAGE ® échantillon LDS chargé avec dodécyl sulfate de lithium (LDS) maintient polypeptides dans un état ​​dénaturé fois l&#39;échantillon de protéine a été chauffé à 70 ° C pendant 10 minutes. Un agent réducteur fort est utilisé en conjonction d&#39;enlever la structure secondaire et tertiaire (TNT, pour rompre les liaisons disulfure). En outre, les protéines de l&#39;échantillon se recouvrent dans la LDS chargés négativement et donc passer à travers les mailles du gel d&#39;acrylamide vers l&#39;électrode chargée positivement. Cela permet leur séparation en fonction du poids moléculaire (mesurée en Daltons kilo, kDa). Détaillées étape par étape, des protocoles pour la préparation de l&#39;échantillon et la procédure page se trouve sur le site Invitrogen 2, ou dans le guide NuPAGE technique 3. Conseils techniques <ol><li> Dans le système d&#39;Invitrogen NuPAGE Bis-Tris discontinue tampon, la mobilité électrophorétique des protéines et la gamme séparation ultérieure du gel dépend de deux facteurs: i) la concentration d&#39;acrylamide du gel (avec une plus grande concentration d&#39;acrylamide résultant en une meilleure résolution de la baisse des poids moléculaire des protéines) et ii) l&#39;ion de fuite de la mémoire tampon de la course, MOPS ou MES. Pour choisir la combinaison appropriée pour la gamme de séparation que vous voulez atteindre, se référer au tableau migration du gel 1. L&#39;épaisseur du gel et du nombre de puits dépendra du volume et la quantité d&#39;échantillons que vous envisagez de charge, respectivement. </li><li> Lorsque vous chargez vos échantillons dans les puits du gel, au moins une voie est réservée pour un marqueur de poids moléculaire (ou échelle). Ces normes de protéines sont disponibles commercialement auprès de plusieurs entreprises et sont généralement constitués d&#39;un mélange de protéines colorées avoir défini poids moléculaire, de manière à former des bandes visibles qui vous permettent de suivre la progression de la migration. Choisissez une gamme de poids moléculaire qui est compatible avec la résolution de votre gel. </li><li> Pour parvenir à un modèle de migration de Nice et même, nous recommandons de charger tous les puits de votre gel avec un volume similaire de l&#39;échantillon ou du tampon 1X échantillon LDS. </li></ol> Transfert Note technique: Avant de commencer l&#39;étape de transfert, de préparer le tampon de transfert (1X avec du méthanol à 10%) et de pré-refroidir à 4 ° C dans une chambre froide. Afin de rendre les protéines accessibles à la détection d&#39;anticorps, ils sont transférés par électrotransfert du gel sur une membrane de nitrocellulose. La liaison aux protéines est basée sur des interactions hydrophobes, ainsi que des interactions de charges entre la membrane et les protéines. (Polyfluorure de vinylidène (PVDF) peut également être utilisé comme une alternative. Dans ce cas, la membrane de PVDF doit être pré-humide dans le méthanol au moins 30 secondes avant l&#39;utilisation.) Un détail, étape par étape, le protocole de la procédure de transfert peut être trouvée dans la référence 4 si vous utilisez le Bio-Rad Mini Trans-Blot cellule de transfert électrophorétique, ou dans les références 2-3 si votre laboratoire est équipé de l&#39;Invitrogen XCell II ™ Blot Module. En conséquence de ce processus, les protéines sont exposées sur une mince couche de surface et prêt pour la détection. L&#39;efficacité globale de l&#39;uniformité et le transfert de protéines à partir du gel à la membrane peut être vérifiée par une coloration de la membrane réversibles Ponceau S colorant. La procédure de coloration Ponceau S (facultatif): <ol><li> Après le transfert des protéines, placer la membrane dans un bac d&#39;incubation (protéines vers le haut). </li><li> Ajouter suffisamment de coloration Ponceau S pour couvrir la membrane et incuber au moins 30 secondes avec une légère agitation. </li><li> Rincer la membrane avec de l&#39;eau distillée jusqu&#39;à ce que le fond est clair. </li><li> Décolorer la membrane avec beaucoup d&#39;eau distillée pendant 2-3 minutes. </li><li> Placer la membrane dans une solution de blocage (voir ci-dessous). </li></ol> Conseils techniques: <ol><li> Nous recommandons l&#39;étiquetage de vos membrane avec un crayon avant le transfert de protéines afin de désigner le côté dans laquelle les protéines ont été exposées et l&#39;orientation de vos échantillons. </li><li> Les deux taches Ponceau S et les marqueurs de poids moléculaire peut être utilisé pour couper la membrane après le transfert pour sonder les parties résultant avec différents anticorps </li></ol> Immunodétection: Note technique: Cette procédure immunodétection est fournie uniquement à titre indicatif. L&#39;optimisation peut être exigée pour chaque fourmiiBODY; informations spécifiques peuvent être trouvées dans la plupart des fiches de données de l&#39;anticorps disponibles dans le commerce (par exemple, le travail de dilution, le temps d&#39;incubation, etc.) Pendant ce dernier procédé, la protéine cible sera détecté en utilisant un anticorps spécifique et apparaîtra comme une bande sur le film. La position de la bande dépend du poids moléculaire de la protéine cible, tandis que l&#39;intensité bande dépend de la quantité de protéine présente cible. Typiquement, ceci est réalisé au bout de trois sous-étapes: <ol><li> Blocage: Afin d&#39;éviter des interactions non spécifiques de l&#39;anticorps avec la membrane (l&#39;espace excédentaire sur la membrane est recouverte d&#39;une solution diluée d&#39;une protéine de génériques). </li><li> Sondage: La protéine d&#39;intérêt est détecté par un particulier <a title="L&#39;anticorps primaire" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">d&#39;anticorps primaires</a> . Après l&#39;anticorps primaires non liés est emporté, la membrane est exposée à un anticorps différent lié à la journaliste de <a title="L&#39;enzyme" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">l&#39;enzyme</a> , <a title="Peroxydase de raifort" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">la peroxydase de raifort</a> (HRP). Cet anticorps secondaire est dirigé contre la partie spécifique à l&#39;espèce de l&#39;anticorps primaire (par exemple un anticorps secondaire anti-lapin va se lier à n&#39;importe quel lapin provenant d&#39;anticorps primaires). </li><li> Détection: Un agent de chimiluminescence est utilisé comme un substrat qui luminescence lorsqu&#39;ils sont exposés à l&#39;HRP sur l&#39;anticorps secondaire. Cette réaction produit de luminescence en place et en proportion de la quantité de protéines sondé. La lumière est ensuite détecté par un film photographique. </li></ol> Un générique étape par étape la procédure est fournie ci-dessous. Autres procédures détaillées peuvent être trouvées dans la détection ECL Plus occidentaux manuel d&#39;instruction Blotting Réactifs 5 ou dans la plupart des data-sheet accompagnant les anticorps disponibles dans le commerce. Le temps d&#39;incubation, dilution de l&#39;anticorps, et de blocage et des solutions de lavage doivent être empiriquement optimisés pour chaque anticorps. Procédure d&#39;immunodétection: <ol><li> Bloquer la liaison non-spécifique par incubation avec un volume suffisant de solution de PBS à 1% de caséine bloquant pour couvrir toute la membrane. Placer sur une bascule pour au moins 30 min à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Incuber la membrane avec votre anticorps primaire (spécifique pour la protéine d&#39;intérêt). L&#39;anticorps primaire doit être dilué dans une solution de blocage. Pour la plupart des anticorps, liaison complète est réalisée après 1-2 heures d&#39;incubation à température ambiante sous agitation douce. Alternativement, l&#39;étape d&#39;incubation peut être effectuée durant la nuit à 4 ° C pour augmenter le rapport signal sur bruit. </li><li> Retirer la solution (jeter ou conserver à 4 ° C à -20 ° C pour une utilisation répétée) et laver rapidement la membrane une seule fois. Puis 3X10 minutes avec du PBS, 0,05% de Tween 20 (PBST) à température ambiante avec une agitation vigoureuse. </li><li> Incuber la membrane avec un anticorps secondaire couplé HRP dilué dans une solution de blocage. Choisissez un anticorps qui reconnaît la partie IgG de l&#39;espèce où l&#39;anticorps primaire a été soulevée. L&#39;incubation est réalisée pendant 1 heure à température ambiante sous agitation douce. </li><li> Jeter la solution et laver rapidement la membrane une seule fois. Puis 3X10 minutes avec PBST à température ambiante avec une agitation vigoureuse. </li><li> Procéder à la détection chimioluminescente selon les instructions du fabricant. Nous utilisons des réactifs de détection ECL Plus occidentaux Blotting de GE Healthcare (voir référence 5 pour des instructions spécifiques). </li><li> Placez votre membrane en saran ou une poche et place à l&#39;intérieur d&#39;une cassette autoradiographie. Assurez-vous de drainer tout excès de liquide et de supprimer toutes les bulles d&#39;air. </li><li> Exposer la pellicule photographique à la membrane dans une pièce sombre. Commencez avec un temps d&#39;exposition 1 minute et ajuster en fonction de l&#39;intensité du signal désiré. </li></ol> Conseils techniques: <ol><li> Blocage de la non-fixation spécifique est réalisé en plaçant la membrane dans une solution diluée de protéines. Nous utilisons généralement caséine à 1%, mais <a title="L&#39;albumine sérique bovine" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">l&#39;albumine sérique bovine</a> (~ 2% de BSA) ou de lait écrémé sec (~ 5%) peut être utilisé comme une alternative. </li><li> Tris-Buffered Saline (SCT) peut être utilisé tout au long de la procédure au lieu de PBS. Nous recommandons l&#39;utilisation du SCT si vous envisagez d&#39;explorer votre membrane avec l&#39;anticorps phosphospecific. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une lueur dans le noir autocollant (par exemple, Stratagene Glogos ® II Marqueurs Autorad) taraudés dans le fond de la cassette autoradiographie vous aidera à harmoniser vos films et vos membrane lors de l&#39;étape d&#39;analyse. </li></ol> Analyse Maintenant que vous avez exposé votre film, vous vous rendrez compte que, en termes pratiques, tous les westerns révèlent que la protéine une seule bande de Nice. Additionales bandes L peut aussi apparaître à cause de la liaison non spécifique des anticorps primaires et secondaires. Ce signal de fond peut être réduite en optimisant la procédure immunodétection. En outre, un contrôle approprié (par exemple, les cellules non transfectées, siARN cellules traitées, etc) sera utile pour déterminer la spécificité de vos anticorps et la localisation exacte de la protéine cible sur la membrane. Après le marquage sur le film de la position des bandes colorées standards de protéines de la membrane, l&#39;intrigue du journal de chaque poids moléculaire des normes de protéines (axe Y) contre leur mobilité relative correspondante (en abscisse). La mobilité relative (Rf) est le terme utilisé pour le ratio de la distance de la protéine a déplacé de son point d&#39;origine (en haut du gel) par rapport à la distance la teinture de suivi ou un marqueur de faible poids moléculaire a déménagé (le front de gel) . Déterminer la droite de régression de la courbe standard pour obtenir des valeurs pour la pente et ordonnée à l&#39;origine. Le poids moléculaire inconnue (de taille) de votre protéine cible est estimée à l&#39;aide de son Rf et l&#39;équation modifiée suivante: log = poids moléculaire (pente) (Rf mobilité ou de la protéine cible) + ordonnée à l&#39;origine (Voir référence 6 pour des instructions détaillées). Approximations niveau d&#39;expression sont prises en comparant l&#39;intensité de bande de la protéine cible à celle d&#39;une protéine de structure (par exemple, la tubuline ou de l&#39;actine) ou un produit du gène de ménage tels que la GAPDH. Ce qu&#39;on appelle le «contrôle de chargement&quot; ne devrait pas changer entre les échantillons et se révèle à l&#39;aide d&#39;un anticorps spécifique primaire. L&#39;image peut être analysée par densitométrie pour évaluer la quantité relative de la coloration des protéines et de quantifier les résultats en termes de densité optique.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Migration+chart:+.">Gel Migration chart: .</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website.">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuPAGE+technical+guide.">NuPAGE technical guide.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+Manual,+Mini+Trans-Blot+Cell.">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction.">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis,+GE+Healthcare+Website.">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , .</li><li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai.">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li><li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3.">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li><li>Penna, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , .</li></ol>

La procédure présentée ici utilise un gel de Bis-Tris avec MES Tampon comme un exemple de dénaturation PAGE en utilisant le système d&#39;Invitrogen NuPAGE électrophorèse Novex. En outre, ce système de pré-gel permet la séparation des protéines fonte sous dénaturation ou conditions non dénaturantes ainsi que peut accueillir une large gamme de poids moléculaire (1 à 200 kDa pour les gels Bis-Tris à 36-400 kDa pour le Tris- des gels d&#39;acétate). Selon votre expérience, vous pouvez choisir de suivre une partie seulement de...

western blotting using the invitrogen nupage novex bis tris minigels

Western Blot (ou immuno-) est une procédure standard de laboratoire permettant aux enquêteurs de vérifier l&#39;expression d&#39;une protéine, de déterminer la quantité relative de la protéine présente dans les différents échantillons, et d&#39;analyser les résultats des expériences de co-immunoprécipitation. Dans cette méthode, une protéine cible est détectée avec un anticorps primaire spécifique dans un échantillon donné d&#39;homogénat de tissu ou de l&#39;extrait. Séparation des protéines selon leur poids moléculaire est réalisé en utilisant dénaturant SDS-PAGE. Après transfert sur une membrane, la protéine cible est sondée avec un anticorps spécifique primaire et détecté par chimioluminescence. Depuis sa première description, la technique de western-blot a subi plusieurs améliorations, dont préfabriqués gels et conviviale de l&#39;équipement. Dans notre laboratoire, nous avons choisi d&#39;utiliser le système NuPAGE commercialement disponible chez Invitrogen électrophorèse. Il s&#39;agit d&#39;un pH neutre, innovant, discontinue SDS-PAGE, préfabriqués mini-système de gel. Ce système présente plusieurs avantages par rapport à la technique traditionnelle de Laemmli notamment: i) une durée de conservation des gels préfabriqués allant de 8 mois à 1 an; ii) une gamme de séparation éventail de poids moléculaires de 1 à 400 kDa selon le type du gel utilisé, et iii) une plus grande polyvalence (gamme de pourcentage d&#39;acrylamide, le type de gel, et la composition ionique du tampon d&#39;exécution). La procédure décrite dans cet article la vidéo utilise le système de tampon Bis-Tris discontinue avec 4-12% de Bis-Tris gels de gradient et MES courir tampon, comme une illustration de la façon d&#39;effectuer un test western blot-en utilisant le système d&#39;Invitrogen électrophorèse NuPAGE. Dans notre laboratoire, nous avons obtenu de bons résultats et reproductible pour diverses applications biochimiques en utilisant cette méthode western-blot.

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Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Cet article technique décrit un standard occidental buvard procédure en utilisant l&#39;électrophorèse commercialement disponibles NuPAGE Mini-Gel du système d&#39;Invitrogen.

Western blot en utilisant l&#39;Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.9K vues.  University of California, Irvine (UCI). Cet article technique décrit un standard occidental buvard procédure en utilisant l'électrophorèse commercialement disponibles NuPAGE Mini-Gel du système d'Invitrogen.

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Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Induction chirurgicale d&#39;hydrops endolymphatique par oblitération du canal endolymphatique

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Recherche

Biologie

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: préparation d&#39;échantillons à la détection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Synthèse en phase solide d&#39;un bis-fonctionnalisé peptide en utilisant &quot;Sécurité Catch&quot; Méthodologie

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Utilisation à haute résolution tomodensitométrie pour visualiser la structure tridimensionnelle et la fonction des vaisseaux sanguins des végétaux

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imagerie et de reconstruction 3D de structures vasculaires cérébraux embryonnaires poisson zèbre

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Différenciation de la peau de souris nouveau-nés des cellules souches dérivées dans les cellules germinales comme<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

Flux de travail sans taches V3 pour un contrôle pratique, pratique et fiable de la charge totale en protéines dans Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

Le plus rapide de l&#39;Ouest dans la ville: une touche contemporaine sur l&#39;analyse classique western blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Un Guide to Modern quantitative fluorescente Western blot avec des stratégies de dépannage

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Méthode d&#39;évaluation des effets d&#39;une gamme de longueurs d&#39;onde et des intensités de Luminothérapie Rouge / proche infrarouge sur le stress oxydatif<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...