Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire McMahon pour leur aide et leur soutien. Cette recherche a été financée par des subventions de R01 CA176839-01 NIH / NCI (à MM) et une bourse de recherche institutionnelle et académique de développement de carrière (IRACDA JS).

Une. Préparation des lysats cellulaires de culture cellulaire <ol><li> Placez des boîtes de culture de cellules sur la glace et ajouter du PBS froid avec 5 mM d&#39;EDTA (de par exemple 5 ml de PBS avec 5 mM EDTA/10 cm 2 plaque). Éliminer les cellules adhérentes de la boîte à l&#39;aide d&#39;un grattoir à cellules et ensuite transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml conique froid. </li><li> Pellet les suspensions cellulaires par centrifugation à basse vitesse à 1000 rpm (230 x g) pendant 5 min à 4 ° C. Placez tubes coniques sur la glace et aspirer délicatement le surnageant sans perturber le culot. </li><li> Laver le culot avec 1 ml de PBS avec de l&#39;EDTA 5 mM et transférer la suspension de cellules à 1,5 ml d&#39;un tube de centrifugation à froid. Suspension de spin rapide à 13000 rpm (13 226 xg) pendant 10 secondes pour sédimenter les cellules. Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot et place des tubes sur la glace. </li><li> Reprendre le culot dans 25 à 200 ul (en fonction de la taille de la pastille, c&#39;est-à 3 x 10 6 cellules ~ ajouter 150 ul de tampon RIPA) enUn tampon RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, NaF 10 mM, SDS à 0,1%, désoxycholate de sodium à 0,5%, 1% de NP-40) contenant la protéase fraîchement ajoutée et les inhibiteurs de la phosphatase à une concentration finale 2x. En bref vortex chaque tube et incuber la suspension pendant 20-30 min sur la glace. Remarque: il existe plusieurs tampons de lyse qui peuvent être utilisés pour extraire les protéines, qui diffèrent dans leur capacité à solubiliser les protéines et leur force de détergent dénaturant (SDS-dire, le Triton X-100, ou de NP-40). Tampon RIPA est utile pour préparer des lysats de cellules entières et de perturber les interactions protéine-protéine. </li><li> Pour créer une fraction post-nucléaire, lysats de centrifugation à 14000 rpm (15 339 xg) pendant 5 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube sans perturber le culot et place des tubes nucléaires enrichi sur la glace. Remarque: le culot nucléaire enrichi peut également détacher du tube lors de l&#39;extraction du surnageant. Pour éviter de recueillir le culot nucléaire enrichi, placez le bout de la pipette directement into le culot nucléaire enrichi visqueux et dessiner avec la pipette afin d&#39;en disposer. </li><li> Déterminer les concentrations en protéine de chaque échantillon, conformément aux instructions du fabricant en utilisant de tels essais de quantification en tant que protéine BCA ou Bradford. </li></ol> 2. Préparation des échantillons et électrophorèse <ol><li> Préparer chaque échantillon selon le tableau suivant décrit ci-dessous. Comme une alternative, β-mercaptoéthanol peut également être utilisé à une concentration finale de 2,5%. Cependant, l&#39;agent réducteur doit être ajouté à chaque échantillon jusqu&#39;à une heure avant le chargement du gel. Les comptes de volume total des variations de pipetage avec seulement 20 ul de chaque échantillon préparé chargés par puits. <table border="1"><tbody><tr><td> REACTIF </td><td> Échantillon réduit </td></tr><tr><td> Protéine échantillon </td><td> X ul </td></tr><tr><td> 4x LDS tampon d&#39;échantillon </td><td> 6 pi </td></tr><tr><td> 500 nM TNT RougeAgent ucing </td><td> 2,4 pl </td></tr><tr><td> Eau désionisée </td><td> Jusqu&#39;à 15,6 pi </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 24 pi </td></tr></tbody></table></li><li> Des échantillons de la chaleur à 70 ° C pendant 10 min. Bien que les échantillons sont le chauffage, préparer 1000 ml de MES ou MOPS 1x tampon de course (50 ml 20x MES ou MOPS cours tampon plus de 950 ml d&#39;eau déminéralisée). Tampon MOPS course décide protéines de taille moyenne entre 14-200 kDa, alors que MES cours Tampon décide protéines de petit poids moléculaire entre 2-200 kDa avec un pKa inférieur, ce qui permet aux MES Courir tampon de courir plus vite que les MOPS 4. Ainsi, ces deux mémoires tampon sont contrastés effets sur la migration des ions à l&#39;intérieur du gel d&#39;empilement qui conduit à des différences dans la séparation des bandes de protéines 4. Mettez de côté et de combiner 200 ml de MES 1x ou MOPS cours tampon avec 500 pi de Antioxydant, qui seront utilisés pour remplir la Chambre haute du mini tamponunité d&#39;électrophorèse i-Cell. </li><li> Une fois les échantillons chauffage, des échantillons de spin rapides finis avant de les placer sur la glace. </li><li> Pour le montage des gels Bis-Tris préfabriqués dans l&#39;unité Mini-Cell pour l&#39;électrophorèse de suivre les instructions du fabricant. Remarque: assurez-vous que chaque gel est orienté de telle façon que le plus court (plus petit) Cassette de chaque gel tournée vers l&#39;intérieur vers le tampon de base et les gels sont de niveau et bien appuyé contre le tampon de base pour éviter les fuites de la Chambre haute du tampon. </li><li> Remplissez la Haute Chambre tampon avec les 200 ml de MES ou MOPS cours Buffer contenant l&#39;antioxydant et la Chambre Basse tampon de l&#39;unité Mini-portable avec environ 600 ml de MES ou MOPS cours tampon 1x 1x. Les supplémentaires 200-300 ml de tampon de migration peuvent être sauvegardés pour une utilisation ultérieure. Cependant, il n&#39;est pas recommandé de recycler le tampon utilisé au cours de l&#39;exécution de l&#39;électrophorèse selon le pH et la qualité de la mémoire tampon peuvent être modifiés. </li><li> Charger 20 pi de chaque samp des protéinesle dans chaque puits. Si la coupe de la membrane dans différentes bandes afin de sonder pour plusieurs anticorps (soit plus de 2), il est fortement recommandé de charger 2-5 pi de la protéine de référence Prestained dans les premier et dernier puits de chaque gel comme cela servira des guides de coupe pour séparer les différentes sections de la membrane sans affecter la formation d&#39;image des bandes de protéines. </li><li> Gels fonctionner à 200 V constante pendant 35 min avec un courant attendu de 110 à 125 mA / gel au début et 70 à 80 mA par gel à la fin. L&#39;électrophorèse est terminée lorsque le colorant de suivi migre vers le fil de platine le long de la tranche de base. </li></ol> 3. Protéine de transfert Utilisation du système Blot iBlot sec <ol><li> Séparer complètement les mini-gels en brisant les côtés collés de la cassette (cela peut produire un bruit de crépitement). Jeter la (petite) plaque courte et transférer soigneusement le gel de la plus longue (fendue) plaque dans un récipient avec de l&#39;eau déminéralisée etenlever la partie épaisse pieds du gel situé au fond. Remarque: sur de rares cas, le gel peut fixer à la plaque inférieure, au lieu de la plus fendue plaque. Dans ce cas, jetez le, plaque fendue plus et retirer la partie épaisse pieds du gel situé au fond. Ensuite, transférer soigneusement le gel de la plaque inférieure à l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Assembler les anodes et de cathodes de piles de transfert selon les instructions du fabricant. Remarque: les deux nitrocellulose ou PVDF membranes assurent un transfert de haute qualité et efficace de protéines et sont compatibles avec la détection par fluorescence 8. Cependant, la membrane de PVDF a une capacité de liaison plus élevée (240 ug / cm 3) de la nitrocellulose (200 ug / cm 3) 8. </li><li> Retirer délicatement les bulles ou l&#39;air emprisonné entre le gel et la membrane comme cela va éviter toute distorsion des bandes de protéines pendant le transfert. Remarque: ne pas couper la membrane ou le transfer empiler pour s&#39;adapter à la taille de votre gel au risque de provoquer un contact direct entre les anodes et de cathodes des piles. </li><li> Après bien assembler les piles de transfert sur ​​le dispositif de buvard sec, sélectionnez le programme de tension appropriée (c.-à-programme 3: 20 V pour 7 min) et commencer le transfert. Remarque: les protéines de plus de 150 kDa ont tendance migrer plus lentement et peuvent nécessiter un temps de transfert plus long de 8 à 10 min. En outre, l&#39;incubation préalable du gel dans de l&#39;éthanol 20% pendant 5-10 min contribuera également à améliorer l&#39;efficacité du transfert de ces grandes protéines. Une fois le programme de transfert est terminé, l&#39;appareil s&#39;éteint automatiquement le courant. Il est préférable de retirer immédiatement la membrane et de procéder à la procédure de blocage pour assurer une meilleure détection de protéines et éviter le dessèchement de la membrane. </li></ol> 4. Infrarouge de détection de la protéine fluorescente <ol><li> membrane (s) de bloc en un minimum de 0,8 ml / cm 2 de tampon de blocage Odyssey (Ne pas ajouter de Tween-20) pendant 1 heure oupendant une nuit à 4 ° C. Membrane (s) peut également être bloquée avec du lait écrémé en poudre, mais cela peut provoquer fond supérieur et interférer avec la détection de la protéine. </li><li> Incuber la membrane (s) dans l&#39;anticorps primaire à la concentration désirée en tampon de blocage Odyssey avec 0,1% de Tween-20 pendant une nuit à 4 ° C. Pour la détection de deux couleurs, dans lequel deux antigènes différents sont visualisés sur le même blot, les deux anticorps primaires doivent être dérivées de différentes espèces hôtes et ajoutés simultanément à la membrane (s). Remarque: avant l&#39;incubation de la membrane (s) dans l&#39;anticorps primaire, la membrane (s) peut être sectionné en plusieurs morceaux afin de sonder pour plusieurs anticorps (soit plus de 2) sur la même membrane. </li><li> Laver les membrane (s) 3x pendant 10 min dans du TBS plus 0,1% de Tween-20 avec agitation douce. </li><li> Incuber la membrane (s) avec les anticorps secondaires marqués par fluorescence à une dilution de 1:20.000 pour le canal 700 nm et 1:6,000-1:10,000 pour le canal 800 nm dans Odyssey tampon de blocage avec 0,1% de Tween-20 pendant 30 à 60 min (en incubant la membrane (s) pendant plus d&#39;une heure peut augmenter arrière-plan). Protéger la membrane (s) de la lumière. Remarque: les anticorps secondaires doivent être dérivée de la même espèce hôte que chacun des anticorps primaire et marqué avec des fluorophores différents. </li><li> Laver les membrane (s) 3x pendant 10 min dans du TBS plus 0,1% de Tween-20 avec agitation douce. Protéger la membrane (s) de la lumière. </li><li> Membrane (s) peut être séché ou conservé dans du PBS soit TBS ou sans Tween-20 à 4 ° C jusqu&#39;à ce que numérisée et imagé avec un système d&#39;imagerie infrarouge. Signal fluorescent reste stable pendant plusieurs mois si elle est bien protégée de la lumière. </li></ol>

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les étapes essentielles de la génération de haute qualité, des taches quantitatives occidentaux selon ce protocole sont les suivants: 1) la mesure des concentrations de protéines, 2) la préparation des échantillons, 3) le blocage de la membrane et 4) la qualité et le calibre de l&#39;anticorps primaire. La précision de la mesure des concentrations de protéines totales peut avoir un impact majeur sur la quantification des bandes de protéines car la sensibilité exceptionnelle de d?...

<html> La technique de Western blot a été développé entre 1977 et 1979 afin de créer une meilleure méthode pour détecter des protéines en utilisant des anticorps 1-3. Cette procédure utilise un transfert électrophorétique des protéines de membranes à partir de gels SDS-PAGE avec des protéines cibles visualisés en utilisant des anticorps secondaires et détectés par autoradiographie, la lumière UV, ou un produit de réaction de la peroxydase 3. Ainsi, ces mêmes principes de base sont encore largement utilisés dans les protocoles de transfert de Western d&#39;aujourd&#39;hui. Cependant, cette technique de Western blot classique ne présentent de nombreux inconvénients, tels que la lenteur électrophorèse en exclusivité basse résolution et des bandes de protéines artificielles, sensibilité à la dégradation des protéines, et sensibilité limitée ainsi que la mauvaise qualité des données 4. Par conséquent, ce protocole décrit les avancées et des améliorations significatives à la procédure de transfert de Western norme qui génère des données quantitatives et qualitatives plus précises. &quot;&gt; Le système de Laemmli pour séparer une large gamme de protéines en utilisant SDS-PAGE est le système de gel le plus largement utilisé pour Western blot 5. Malgré la popularité de ce système Western blot, cette méthode peut entraîner une distorsion de la bande, la perte de la résolution, et bandes parasites 4. Ceci peut être une conséquence de la désamination et l&#39;alkylation des protéines en raison du pH élevé (9,5) du gel de séparation, la réoxydation des liaisons disulfure réduites en raison de l&#39;état d&#39;oxydo-réduction variable du gel, et le clivage de l&#39;aspartyl-prolyl des liaisons produites par le chauffage de la protéine dans du tampon de Laemmli (pH 5,2) 4,6 peptidiques. Le système de gel Bis-Tris, qui fonctionne à un pH neutre (7,0), fournit des avantages significatifs par rapport au système Lamemmli. Ce système améliore la stabilité de la protéine, minimise modifications des protéines, maintient les protéines dans leur état ​​réduit, empêche aspartyl-prolyl clivage pendant l&#39;électrophorèse, et plus important encore, le temps d&#39;électrophorèse de fonctionner est de 35 min 4,6,7. De plus, tsystème de gel es Bis-Tris produit également plus nettes bandes, une résolution plus élevée et la séparation, et une sensibilité accrue résultant des données plus fiables 4. En conjonction avec le système de gel Bis-Tris, le système buvard sec iBlot utilise la force de champ élevée et courants de réduire considérablement le temps de transfert des protéines à partir de gels sur des membranes dans 7 min 8. Ce système de transfert est basée sur la méthode de buvardage à sec qui génère un transfert plus efficace et plus fiable des protéines 8. Pour une comparaison détaillée de l&#39;efficacité du système de transfert iBlot aux systèmes de transfert classiques s&#39;il vous plaît consulter le site Web suivant: <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Il utilise une anode et cathode pile, qui sont constituées d&#39;une matrice de gel qui contient les tampons de transfert appropriées, qui agissent en tant que réservoirs d&#39;ions 8. Pendant le transfert, l&#39;électrolyse de l&#39;eau permet d&#39;éviter la production d&#39;oxygène à partir de l&#39;anode en cuivre résultant en un transfert plus uniforme de la protéine sans provoquer de distorsion de la bande 8. De plus, ce système de transfert augmente également la vitesse de transfert en réduisant la distance entre les électrodes 8. Bien chimiluminescence est la technique la plus commune et traditionnelle pour la détection de la protéine de transfert de Western analyses, deux couleurs infrarouge de détection fluorescente améliore considérablement la sensibilité, la qualité et l&#39;exactitude des données de Western blot. Cette méthode de détection infrarouge utilise une excitation laser à deux longueurs d&#39;onde optimales, 700 nmet 800 nm, pour générer une image claire de données avec le plus grand rapport signal sur bruit le plus élevé et la sensibilité 9. Ainsi, les deux protéines cibles peuvent être visualisées simultanément sur la même membrane à l&#39;aide de 700 nm et 800 nm fluorescentes canaux de détection. Plus important encore, la linéarité et la gamme dynamique de la fluorescence infrarouge permet une analyse quantitative précise de bandes de protéines à la fois forts et faibles 9. En outre, ce protocole offre des avantages énormes et des améliorations sur la technique du Western blot classique en diminuant la électrophorèse et les temps de transfert de cette expérience sans compromettre l&#39;efficacité de ces processus et en utilisant la détection infrarouge de la protéine fluorescente à produire plus de données de Western blot qualitatives et quantitatives.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

Les techniques de Western blot qui ont été initialement établis dans les années 1970 sont encore utilisés activement aujourd&#39;hui. Cependant, ce procédé traditionnel de transfert de Western présente plusieurs inconvénients qui comprennent une faible résolution de la qualité, les bandes parasites, diminution de la sensibilité, et l&#39;intégrité de la protéine pauvre. Des progrès récents ont considérablement amélioré de nombreux aspects du protocole de Western blot standard pour produire des données qualitatives et quantitatives plus élevés. Le système de gel Bis-Tris, une alternative au système classique de Laemmli, génère une meilleure séparation et résolution de protéines, maintient l&#39;intégrité de la protéine, et permet de réduire l&#39;électrophorèse à un moment de l&#39;exécution de 35 min. En outre, le système de blotting sec iBlot, améliore considérablement l&#39;efficacité et la vitesse de transfert de la protéine à la membrane en 7 min, ce qui est en contraste avec les méthodes de transfert de protéines traditionnelles qui sont souvent moins efficace avec de longs temps de transfert. En combinaison avec ces modifications très innovants, des protéines détection en utilisant les résultats d&#39;imagerie de fluorescence infrarouge dans de meilleure qualité, plus précis et des données cohérentes par rapport à la technique de Western blot niveau de chimioluminescence. Cette technologie permet de détecter simultanément deux antigènes différents sur la même membrane en utilisant deux couleurs des colorants proches de l&#39;infrarouge qui sont visualisées dans les différents canaux fluorescents. En outre, la linéarité et la gamme dynamique de l&#39;imagerie de fluorescence permet la quantification précise des bandes de protéines à la fois forts et faibles. Ainsi, ce protocole décrit les améliorations importantes de la méthode Western Blot classique, dans lequel ces avancées augmentent de manière significative la qualité des données, tout en réduisant considérablement le temps d&#39;exécution de cette expérience.

Deux couleurs de fluorescence infrarouge détecte les bandes à la fois forts et faibles sur la même membrane avec une sensibilité accrue et le meilleur rapport signal-sur-bruit pour produire des images claires Western blot. Des résultats typiques générés par la détection de transfert de Western de deux couleurs visualisées à la fois dans les 700 nm et 800 nm canaux fluorescents sont illustrés sur les figures 1 et 2. Le Western blot supérieure de la figure 1 ...

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The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Ce protocole explore les dernières avancées dans l&#39;exécution des analyses Western blot. Ces nouvelles modifications utilisent un système de gel Bis-Tris avec une électrophorèse temps de fonctionnement de 35 min, un système de transfert de buvard sec 7 min, et la détection de la protéine fluorescente infrarouge et l&#39;imagerie qui génère de plus haute résolution, la qualité, la sensibilité et l&#39;amélioration de la précision des données occidentaux.

Le plus rapide de l&#39;Ouest dans la ville: une touche contemporaine sur l&#39;analyse classique western blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.9K vues.  University of California, San Francisco.  Ce protocole explore les dernières avancées dans l'exécution des analyses Western blot. Ces nouvelles modifications utilisent un système de gel Bis-Tris avec une électrophorèse temps de fonctionnement de 35 min, un système de transfert de buvard sec 7 min, et la détection de la protéine fluorescente infrarouge et l'imagerie qui génère de plus haute résolution, la qualité, la sensibilité et l'amélioration de la précision des données occidentau...

Vidéo: The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Western blot en utilisant l&#39;Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Recherche

Biologie

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Induction chirurgicale d&#39;hydrops endolymphatique par oblitération du canal endolymphatique

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: préparation d&#39;échantillons à la détection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imagerie et de reconstruction 3D de structures vasculaires cérébraux embryonnaires poisson zèbre

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Différenciation de la peau de souris nouveau-nés des cellules souches dérivées dans les cellules germinales comme<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Un Guide to Modern quantitative fluorescente Western blot avec des stratégies de dépannage

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Floral-Dip Transformation de lin (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Pour générer transgéniques descendances avec un taux de transformation élevé

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Méthode d&#39;évaluation des effets d&#39;une gamme de longueurs d&#39;onde et des intensités de Luminothérapie Rouge / proche infrarouge sur le stress oxydatif<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Imagerie du trafic intracellulaire de l&#39;APP avec la GFP photoactivable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...