Nous tenons à remercier Patrick C. Wilson pour CR9114 monoclonal d&#39;anticorps. Nous remercions également Jennifer Debeauchamp et Richard Webby pour les plasmides A/Anhui/1/13 originaux. Un soutien partiel pour ce travail a été fourni par l&#39;Institut national de l&#39;allergie et des maladies infectieuses projet financé par Programme de subventions AI097092-01A1 et CEIRS (Centres d&#39;excellence pour la recherche sur l&#39;influenza et de la surveillance, HHSN26620070010C). FK a été soutenue par une bourse de Erwin Schrödinger (J 3232) du Fonds autrichien pour la science (FWF).

Une. Génération de baculovirus recombinant <ol><li> Clonage dans plasmides transfert baculovirus <ol><li> Clone H7 HA et NA N9 ectodomaine (ou tout autre gène HA ou NA) dans des plasmides de transfert pFastBac modifiés (voir introduction). Vecteurs pour HA contenant un domaine de trimérisation C-terminal et une étiquette hexahistidine, ainsi que pour NA contenant un domaine de tétramérisation N-terminal et tag hexa-histidine, ont été décrits 1,10,11,22 (Figure 1) et peuvent être demandées les auteurs. Note explicative: ectodomaines HA exprimées sans un domaine de trimérisation seront pliées de manière incorrecte, conduisant à la perte d&#39;épitopes conformationnels neutralisants, en particulier dans le domaine de la tige. De même, la fonction enzymatique NA s&#39;appuie sur tétramérisation appropriée. </li><li> Génération de bacmides Transformer transfert de baculovirus-plasmides contenant des gènes HA et NA dans des bactéries selon DH10Bac aide d&#39;une expression de baculovirussystème selon les instructions du fabricant. Isoler et purifier bacmides utilisant un kit Midiprep selon les instructions du fabricant (figure 2). </li></ol></li><li> Sauvetage de baculovirus recombinant et de la vérification de l&#39;expression de la protéine Note explicative: Les étapes suivantes doivent être effectuées de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire. Effectuez cette procédure indépendante pour HA et NA (ou tout autre gène d&#39;intérêt). Les cellules d&#39;insectes sont généralement cultivées à 28 ° C sans CO 2. Cellules Sf9 de ce protocole sont cultivées dans des milieux de cellules d&#39;insectes TNM-FH complet supplémenté avec 10% de FBS, 1% de Pen-Strep * et 0,1% de solution de Pluronic F68, sauf indication contraire, et des passages 01h04 deux fois par semaine. Cellules High Five sont cultivées dans des milieux de sérum libre SFX et des passages 01h15 deux fois par semaine. * Ajout d&#39;antibiotiques devrait être considérée comme facultative dans tout le protocole et ajusté selon les pratiques utilisées dans chaque laboratoire. <ol><li> Plate cellules d&#39;insecte Sf9 dans des plaques à 6 puits à une densité de 2 x 10 5 cellules / cm 2 et laisser reposer pendant 20 min dans un incubateur à 28 ° C (sans CO 2). </li><li> Mélanger 2 ug (conc. 0,5 à 2 ug / ul) de bacmide recombinant avec 100 ul de milieu TNM-FH (exempt de sérum, 1% de Pen-Strep). Mélangez 6 pi d&#39;agent de transfection avec 100 pi de milieu TNM-FH (sans sérum, Pen-Strep). Combiner les deux volumes, mélanger délicatement et laisser reposer pendant 20 min à température ambiante (mélange de transfection). Inclure une maquette transfection comme contrôle (Figure 3). </li><li> Retirer le surnageant de cellules Sf9 plaqués (cellules vont maintenant s&#39;en tenir à la plaque) et le remplacer par 2 ml de milieu sans sérum TNM-FH contenant Pen-Strep (1%). Ajouter le volume complet du mélange de transfection (étape 1.2.2) et faites délicatement basculer la plaque de 6 puits pendant 5 sec. Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO 2 pendant 6 heures (figure 3). </li><li> Remplacez le support wimédias ème frais complets TNM-FH (contenant 10% de FBS, 1% de Pen-Strep et 0,1% Pluronic F68). Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO 2 pendant 6 jours. Vérifier de temps en temps les cellules sous un microscope. Les cellules infectées apparaissent généralement plus gros, plus rond, ont élargi noyaux, et commencent à se détacher (Figure 4). </li><li> La récolte de cellules et la confirmation de l&#39;expression de la protéine <ol><li> Récolte des cellules 6 jours après la transfection par centrifugation à 2000 xg pendant 5 min à température ambiante. Le surnageant contient le baculovirus recombinant - il sera utilisé pour générer les stocks de travail tout de suite, ou peut être conservé à 4 ° C pendant des années. </li><li> Pour vérifier l&#39;expression des protéines de recueillir des pastilles et remettre en suspension dans 500 pi de PBS. Mélanger 50 pi de la suspension de 50 pi de tampon SDS-PAGE chargement (contenant un agent réducteur). Exécuter SDS-PAGE et d&#39;effectuer une analyse par Western blot avec un anticorps anti-hexahistidine pour confirmer l&#39;expression des gènes. Inclure les cellules de la maquettetransfection comme témoins négatifs (Figure 3). </li></ol></li><li> Préparation des stocks de travail <ol><li> Planche 5 x 10 5 Sf9 / cm 2 dans un flacon T175 cm 2 et laisser reposer pendant 20 min permettent d&#39;attacher à l&#39;antenne. Remplacer complète médias TNM-FH avec les médias TNM-FH contenant 3% de FBS (et 1% de Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68). </li><li> Infecter les cellules avec 100 pi de surnageant de sauvetage. Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO 2 pendant 6 jours et vérifier de temps en temps si les cellules sont infectées (comme décrit à l&#39;étape 1.2.5.). </li><li> Tourner à 2000 g à la température ambiante pendant 5 min et recueillir le surnageant. C&#39;est maintenant votre P2 actions. Ce stock peut être conservé indéfiniment à 4 ° C. Répétez la procédure de l&#39;infection en utilisant 100 pi de stock P2 pour infecter les cellules. Le stock en résulte est appelé P3 ou stock de travail, qui peut être conservé à 4 ° C ou utilisé directement pour l&#39;expression de la protéine. Le P3 magasin contient généralement 10 &lt;sup&gt; 7 -10 9 unités formant plaque / ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification Note explicative: cellules Sf9 de soutenir la croissance de baculovirus très bien. Cependant, leur capacité à sécréter de grandes quantités de protéine recombinante est limité. Par conséquent, nous utilisons une autre ligne de cellules d&#39;insectes, cellules High Five, pour l&#39;expression de protéines recombinantes sécrétées. Ces cellules ne prend pas en charge la réplication baculovirus à très haute de 13 titres, mais ont une grande capacité de sécrétion. <ol><li> Grandir cellules High Five Cultiver cellules High Five dans SFX milieu de culture de cellules d&#39;insecte en T175 cm2. Passage tous les jours 01h03. Pour une culture de 200 ml d&#39;expression, vous devrez développer des flacons de 5 confluentes. </li><li> Récolte et infecter cellules High Five <ol><li> Détachez cellules High Five de 5 T175 cm2 en appuyant sur ​​les flacons avec votre main. Recueillir le suspe cellulairension et transférer dans des tubes de 50 ml de centrifugation. </li><li> Tourner à 1200 xg pendant 7 min à température ambiante. Retirer le surnageant par décantation et d&#39;unir les pastilles en les remettant en suspension dans 15 ml de P3 actions. </li><li> Laisser reposer pendant 15 min dans la hotte à flux (Figure 5). </li><li> Transférer 200 ml de milieu de culture Hyclone SFX en un, stérile 1000 ml shaker flacon propre (sans buffles, scellé avec une feuille d&#39;aluminium avant l&#39;autoclavage, ne doit pas avoir été utilisé pour les cultures bactériennes avant). </li><li> Transférer la suspension P3/cell dans le ballon à secousses. Sceller avec du papier d&#39;aluminium stérile et transfert ballon dans un shaker. Agiter à 70 tours par minute à 28 ° C pendant 72-96 h. </li></ol></li><li> La récolte de la protéine recombinante à partir de surnageants de haute Cinq d&#39;expression de cellules <ol><li> 72-96 h post-infection transfert surnageants de culture dans 500 ml seaux de centrifugation. Tourner à 5500 g pendant 20 min à 4 ° C. En attendant rincer les flacons shaker 3x avec de l&#39;eau distillée deux fois(Le trou DDH 2 O). </li><li> Transfert 3 ml suspension Ni-résine dans un tube de 50 ml avec 45 ml de PBS (on avait besoin pour 200 ml de culture). Secouez bien et tourner à 3000 xg à température ambiante pendant 10 min. Décanter le PBS et garder le culot. Mélanger le surnageant de cellules d&#39;insecte avec le culot Ni-résine et les transférer dans des flacons secoueurs déjà rincés. Incuber à 4 ° C pendant 2-4 heures, tout en agitant (Figure 6). </li><li> Mont colonne de 10 ml en polypropylene sur une pince sur un stand de support. Retirer les deux bouchons et placer un bécher sous la colonne pour recueillir l&#39;écoulement à travers (déchets). Prendre le ballon à secousses de l&#39;agitateur et commencer à transférer le mélange surnageant / de suspension sur la colonne, il va conserver la résine Ni-et uniquement le surnageant s&#39;écoule à travers. Passer la totalité du volume au-dessus de la colonne (figure 7). </li><li> Laver 4x la résine avec 15 ml de tampon de lavage (50 mM de Na HCO 3 2, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8). Que toute la vidange de tampon de lavagede la colonne et fermer avec le couvercle (côté inférieur). </li><li> Ajouter 2 ml de tampon d&#39;élution (mM Na 50 2 HCO 3, 300 mM de NaCl, mM imidazole, pH de 8 300) et laisser reposer pendant 5 min. Ouvrez colonne et recueillir l&#39;éluat. Répéter cette opération 3 fois de plus (avec un total de 8 ml de tampon d&#39;élution). Éluat qui contient des concentrations élevées de protéine montre typiquement mousse quand on les secoue (figure 7). Gardez éluat sur de la glace chaque fois que possible. </li></ol></li><li> échange de tampon et la concentration <ol><li> Prespin 15 ml ultrafiltration unités de centrifugation (30 kDa de coupure pour HA / NA, mais peuvent varier en fonction de la taille de la protéine purifiée) avec du PBS (pH 7.4-7.6) à 3000 g à 4 ° C pendant 20 min. Jeter traverser et charge éluat sur la colonne. Remplir avec 5 ml de stérile, glacée PBS et centrifugation pendant 60 min à 3000 g à 4 ° C. </li><li> débit de décharge par nouveau, remplir avec 15 ml de PBS glacé et essorage pendant 60 min à 3000 g à 4 ° C. Répétez cette procédureDure une fois de plus. </li><li> Prenez la colonne de spin-out de la centrifugeuse et recueillir le concentré de tampon échangé (typiquement 200 pi). Ceci est très concentré protéine recombinante. Rincer la colonne de spin avec 400 pi de froid de glace PBS stérile et ajouter ce au concentré. Gardez le concentré sur la glace en tout temps. </li></ol></li></ol> 3. Caractérisation et contrôle de la qualité <ol><li> Mesure de la concentration protéique Prélever une partie aliquote du concentré et de le mesurer à l&#39;aide de votre méthode de quantification de protéine de choix. Régler la concentration en protéine à 1 mg / ml par addition de PBS et de geler petites aliquotes à -80 ° C. Cycles de gel-dégel nuisent à la structure de la protéine et peuvent conduire à l&#39;agrégation. </li><li> SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie Exécutez 500 ng de votre protéine sur un SDS-PAGE et effectuer une coloration de Coomassie. Pour la coloration rapide et pratique utiliser le réactif de Coomassie, en combinaison avec un protocole de micro-ondes. Protéines HA apparaissent généralement à 64kDa alors que les protéines NA doivent fonctionner à une taille d&#39;environ 56 kDa (figures 8A et B). Selon le protocole décrit vous ne devriez pas voir tous les produits de dégradation. Si la dégradation se produit, il est généralement un signe de contamination levure / fongique lors de l&#39;expression. Dans ce cas, répétez la procédure et assurez-vous de garder tout stérile. </li><li> Western blot / ELISA Afin de vérifier l&#39;identité des protéines que nous recommandons à faire un Western blot ou ELISA avec un anticorps spécifique. Idéalement, les tests ELISA sont réalisés avec un anticorps qui se lie à des épitopes conformationnels (par exemple des anticorps anti-HA tige 1). L&#39;utilisation d&#39;un tel anticorps du repliement correct de la protéine peut être confirmée (Figure 8C). </li><li> Mesure NA activité Un repliement correct de la NA du virus peut également être déterminée en mesurant l&#39;activité de NA. Nous vous recommandons d&#39;effectuer ce test en utilisant le test NA * STAR disponibles dans le commerce (il suffit de suivre les lignes directrices de l&#39;utilisateur). </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Bien que l&#39;expression de virus de la grippe HA et NA protéines dans des cellules d&#39;insectes en utilisant le système d&#39;expression baculovirus est généralement simple, il ya plusieurs points importants à considérer. Il est important, comme indiqué dans l&#39;introduction, que les ectodomaines de HA et NA sont exprimés en fusion avec la trimérisation ou la tétramérisation des domaines, respectivement. Ces domaines d&#39;assurer le repliement correct des molécules généralement assistée par le doma...

Comme une première réponse à la récente émergence du roman H7N9 grippe souche du virus en Chine, nous avons acquis des plasmides portant les séquences génomiques de l&#39;hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) des gènes des deux premiers isolats. L&#39;utilisation de ces plasmides, nous avons pu construire rapidement des vecteurs d&#39;expression de baculovirus recombinant pour la production de HA et NA dans des cellules d&#39;insectes. Ce système d&#39;expression est bien établi dans notre laboratoire et a prouvé crucial pour bon nombre de nos projets de recherche en cours 1-8. Les cellules d&#39;insectes sont capables de plier correctement et modifier des protéines complexes post-traductionnelle. Ces modifications comprennent la glycosylation N-liée, ce qui est important pour de nombreuses glycoprotéines virales. En tant que tel, il n&#39;est pas surprenant que le système de baculovirus est bien établie pour les virus de la grippe exprimant les antigènes de surface. En fait, la plupart des structures cristallines HA et NA ont été résolus en utilisant cellulaires exprimé protéines d&#39;insectes 9-11. Un autre avantage de l&#39;système réside dans ses fiables des rendements élevés de protéines allant jusqu&#39;à 30 mg de culture de cellules HA / L (sur la base de notre expérience de plus de 50 protéines différentes HA) - une conséquence de virus infection expression entraînée par le promoteur de la polyhédrine forte. L&#39;élimination de l&#39;endodomaine transmembranaire et des protéines HA et NA permet l&#39;expression de versions solubles sécrétées, des protéines et donc facilite grandement le processus de purification. En outre, ces ectodomaines hexahistidine sont marqués et peuvent donc être purifiés en utilisant une Chromatographie d&#39;affinité en utilisant Ni2 +-résine. Les domaines transmembranaires des protéines HA et NA, et contribuent à la formation de homotrimère homotétramère, respectivement. Afin de préserver ces oligomérisations, nous ajoutons un domaine de trimérisation C-terminale de la HA, et un tétramérisation domaine N-terminal de la NA constructions (Figure 1). Nous avons démontré de façon concluante que ce domaine de trimérisation stabilise fonctionnelle, conséquencesrved épitopes conformationnels sur la tige-domaine de HA 1. Le tétramérisation correcte de la NA pourrait également contribuer à corriger le pliage et la fonction NA 10. Séquences et des vecteurs baculovirus transfert hébergeant trimérisation ou tétramérisation domaines peuvent être demandés aux auteurs ou à d&#39;autres laboratoires dans le domaine, 9,10,12. Une autre question importante pour l&#39;expression de protéines sécrétées dans des cellules d&#39;insectes est le choix de la lignée cellulaire droite. Alors que Spodoptera frugiperda dérivé des cellules Sf9 en charge la réplication baculovirus très bien et sont généralement utilisés pour le sauvetage de virus et la propagation, ils ont la capacité de sécréter de grandes quantités de protéines limité. Trichoplusia ni dérivé BTI-TN-5B1-4 cellules (communément appelés High Five) avoir une capacité de sécrétion plus élevée et sont de la lignée cellulaire de choix pour l&#39;expression dans ce protocole 13,14. En outre, il est utile pour réduire ou même éliminer le sérum de veau fœtal (FBS) à partir de cultures d&#39;expression. Nous utilisons donc médias réduite (3%) contenu FBS pour la croissance des stocks de roulement de virus, et nous effectuons l&#39;expression de protéines dans des milieux sans sérum. Protéines HA et NA recombinants sont utilisés pour de nombreuses techniques immunologiques. Peut-être la plus commune est dans des tests ELISA pour mesurer la conversion de sérum sur la vaccination chez les humains ou les animaux 4,6,7,15. AN engage et sont également utilisées dans des analyses ELISPOT comme les deux molécules stimulatrices et des réactifs de détection pour les cellules sécrétant l&#39;anticorps 16. Leur utilisation comme amorces moléculaires permet de trier spécifiquement pour plasmoblastes ou d&#39;autres types de cellules B qui peuvent ensuite être utilisés pour isoler des anticorps monoclonaux (thérapeutiques) (Acm). Des molécules de HA et NA recombinants sont ensuite utilisés dans la caractérisation de ces anticorps monoclonaux 8. D&#39;autres exemples comprennent l&#39;étude de la stabilité du pH ou la spécificité du récepteur de a exprimé par différents isolats de virus, ou d&#39;évaluer quantitativement enzymatique spécifique NAl&#39;activité ou de la résistance aux inhibiteurs. En outre, recombinant, HA purifiée peut être utilisée pour normaliser teneur en HA de vaccins inactivés du virus de la grippe. Surtout, AHr (et dans une certaine mesure NA) candidats vaccins sont actuellement testés dans des modèles animaux et des essais cliniques sur des humains avec un candidat vaccin est autorisé par la FDA en 2013 2,17-19. L&#39;avantage de ces nouveaux vaccins est que, en raison de la nature de ces protéines recombinantes, le procédé de génération de virus réassortis de croissance élevés de main-d&#39;œuvre pourrait être évité. Peut-être est d&#39;autant plus pertinente que le fait de leur rendement de HA est élevée et reproductible d&#39;une souche à l&#39;. En outre, étant donné que ces vaccins sont produits dans un système sans oeuf, ils ne contiennent pas de contaminants protéiques qui sont problématiques pour des individus allergiques aux œufs. Ici, nous avons choisi d&#39;exprimer les protéines HA et NA de deux isolats du virus de la grippe roman H7N9 chinois, A / Anhui/1/13 et A/Shanghai/1/13 20,21. Ce sont des exemples rapides, mais le protocole décrit peuvent être utilisés pour l&#39;expression selon l&#39;une quelconque des protéines de la grippe A et B de HA ou de NA et peuvent être adaptés pour exprimer toutes les autres protéines virales ou cellulaires sécrétés. Protéines transmembranaires trimères ou tétramères peuvent être clonées dans les cassettes d&#39;expression utilisées pour HA et NA, respectivement. Toutefois, les protéines cellulaires sécrétées plus solubles, comme les interférons, par exemple, n&#39;ont pas besoin d&#39;un domaine supplémentaire pour la stabilisation et peuvent être exprimés uniquement avec un tag hexa-histidine C-terminal.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

Le système d&#39;expression de baculovirus est un outil puissant pour l&#39;expression de protéines recombinantes. Ici, nous l&#39;utilisons pour produire des versions correctement repliées et glycosylés de la grippe A virus glycoprotéines de surface - l&#39;hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). A titre d&#39;exemple, nous avons choisi les protéines HA et NA exprimées par le nouveau virus H7N9 qui a récemment émergé en Chine. Cependant le protocole peut être facilement adapté pour HA et NA protéines exprimées par tout autre virus grippal A et les souches de virus B. Recombinant HA (RRS) et NA (ARN) des protéines sont des réactifs importants pour les dosages immunologiques tels que ELISPOT et ELISA, et sont également largement utilisés pour la normalisation des vaccins, découverte d&#39;anticorps, l&#39;isolement et la caractérisation. En outre, les molécules de NA recombinantes peuvent être utilisées pour cribler des inhibiteurs de petites molécules et sont utiles pour la caractérisation de la fonction enzymatique de la Na, ainsi que de sa sensibilité aux antiviraux. Protéines HA recombinées sont également being testés en tant que vaccins expérimentaux dans des modèles animaux, et un vaccin recombinant basé sur HA a récemment été autorisé par la FDA pour une utilisation chez l&#39;homme. La méthode que nous décrivons ici la production de ces molécules est simple et peut faciliter la recherche dans les laboratoires de la grippe, car il permet la production de grandes quantités de protéines rapide et à faible coût. Bien que nous nous concentrons ici sur le virus de la grippe glycoprotéines de surface, cette méthode peut également être utilisé pour produire d&#39;autres protéines virales et cellulaires de surface.

Molécules HA de A/Shanghai/1/13 et A/Anhui/1/13 exprimé bien avec des rendements d&#39;environ 20 mg / L de culture. NA molécules des deux souches ont montré des niveaux d&#39;expression modérés allant de 0,2 mg / L de culture pour A/Shanghai/1/13 à 0,7 mg / L pour A/Anhui/1/13. Tous les quatre préparations de protéines ont très peu ou pas d&#39;impuretés (figures 8A et B) Le fait d&#39;être de pureté supérieur à AN qui peut s&#39;expliquer par le niveau d&#39;expression....

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Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Nous décrivons ici un moyen pour exprimer des antigènes de surface du virus de l&#39;influenza correctement repliés et fonctionnels dérivés du nouveau virus H7N9 chinois dans des cellules d&#39;insectes. La technique peut être adaptée pour exprimer ectodomaines de toutes les protéines virales ou cellulaires superficiels.

L&#39;expression de l&#39;hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l&#39;aide du système d&#39;expression baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K vues.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Nous décrivons ici un moyen pour exprimer des antigènes de surface du virus de l'influenza correctement repliés et fonctionnels dérivés du nouveau virus H7N9 chinois dans des cellules d'insectes. La technique peut être adaptée pour exprimer ectodomaines de toutes les protéines virales ou cellulaires superficiels. 

Vidéo: Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Emballage VIH ou FIV à base de constructions d&#39;expression et de transduction du Lentivector VSV-G pseudotypés particules virales

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Différencier les rôles fonctionnels de l&#39;expression des gènes de cellules immunitaires et non immunitaires dans l&#39;intestin de souris par greffe de moelle osseuse

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d&#39;ADNc

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...