Cette technique de production de PP viral grippal et de détermination de son infectiosité peut simplifier la recherche sur le virus de la grippe dans une ville BSL-2. Nous avons normalisé le PPS pour les infections basé sur des données qRT-PCR de PPS. Deux plasmides d’expression glycoprotéine sont codés, ce qui peut simplifier la recherche sur le réassortment du virus.
Un jour après l’ensemencement cellulaire, vérifiez la morphologie et la densité cellulaires au microscope à lumière inversée. Idéalement, la cellule devrait être environ 85% confluent à la transfection. Remplacer le milieu par un millilitre de DMEM sans sérum par puits, et remettre la plaque dans l’incubateur.
Pour que chaque puits de cellules soit transfecté, diluer huit microlitres du réaccélésseur de transfection à un volume de 150 microlitres avec milieu de sérum réduit. Mélanger délicatement la solution et la laisser reposer à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant ce temps, diluer 2,5 microgrammes d’ADN plasmide en 158 microlitres de sérum moyen réduit.
Après l’incubation de cinq minutes, mélanger l’ADN dilué avec le réaccente de transfection diluée, mélanger délicatement la solution et la laisser à température ambiante pendant 15 minutes. Ajouter le complexe lipidique de l’ADN aux puits correspondants avec les cellules dans un milieu sans sérum. Mélanger ensuite délicatement l’assiette en faisant des allers-retours.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre à six heures. Après l’incubation, retirer le milieu et le remplacer par deux millilitres de DMEM par puits. Puis l’incuber pendant encore 36 à 48 heures.
Ensemencer chaque type de cellule sensible à 10 000 cellules par puits et une plaque de puits de 96. Ensuite, laissez la plaque pendant la nuit dans un incubateur de 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Le troisième jour après la transfection, vérifiez la couleur du milieu qui devrait rose clair ou légèrement orange et examinez les cellules avec un microscope biologique florescent inversé sous la longueur d’onde de 440 à 460 nanomètres.
À 38 à 48 heures après la post-transfection, récoltez les particules pseuotypées ou PPS en les passant à travers un filtre à membrane fluorure polyvinylidene de 0,45 micromètre pour éliminer les débris cellulaires, puis divisez-les en petits volumes aliquots et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour quantifier le PPS, transférez 30 microlitres des particules virales purifiées à un tube sans RNase de 1,5 microlitre et ajoutez un microlitre de Benzonase Nuclease. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant une heure pour éliminer toute contamination par l’ADN et l’ARN.
Après l’incubation, congeler l’échantillon à moins 70 degrés Celsius pour activer la nucléase et ajouter deux microlitres de Proteinase K.Incuber le mélange pendant 30 minutes pour digérer les protéines de l’enveloppe et libérer l’ARN CMV-GFP. Puis inactif le Proteinase K à 100 degrés Celsius pendant trois minutes. Quantifier le PPS avec la transcription quantitative inverse RTPCR à l’aide de la sonde universelle One-Step RT-qPCR Kit dans les amorces et les sondes spécifiées dans le manuscrit du texte.
Normalisez le SPP à quatre fois 10 à 5 copies d’ARN par millilitre. Ajoutez ensuite la trypsine TPCK à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre dans le PPS qui abrite l’hémagglutinine H7N9. Incuber le PPS à 37 degrés Celsius pendant une heure pour former les sous-units fonctionnels HA1 et HA2.
Mélangez le PPS normalisé avec le milieu DMEM à un rapport un pour un, puis apportez la plaque contenant des cellules sensibles à l’armoire de biosécurité. Aspirer le supernatant et laver les cellules une fois avec 100 microlitres de PBS préchauffé. Ajouter 100 microlitres de mélange PPS-DMEM dans chaque puits, en triplicant les tests d’infectiosité de chaque type de SPP à une lignée cellulaire sensible.
Incuber la plaque pendant quatre à six heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, aspirez le supernatant et remplacez-le par 100 microlitres de DCM Incuber la plaque pendant encore 24 à 36 heures avant la détection d’infectiosité. Nos résultats sont PPS sont considérés maintenant infectieux pour les gens.
Il est donc recommandé de prendre les procédures de protection sécuritaires nécessaires, comme le port d’un masque et l’exécution des analyses d’infectiosité dans une armoire de biosécurité. Ce protocole a été généré pour générer 10 types de particules pseudotypées ou PPS avec deux hémaglutinines groupées et neuraminidase virus de stomatite vésiculaire G glycoprotéine ou pas d’enveloppe glycoprotéines. Le PPS ont été imaged avec la microscopie électronique de transmission et leur infectiosité ont été évaluées dans deux lignes cellulaires, A549 et MDCK.
Dans le groupe PPS abritant H5, l’infectiosité de H5N1, H5 plus N9 et H5 était d’environ 90%18% et 10% pour la lignée cellulaire A549 et 40%5% et 5% pour MDCK, respectivement. Dans le groupe PPS hébergeant H7, l’infectiosité de H7N9, H7 plus N1 et H7 était d’environ 10%7%et 1% pour la lignée cellulaire A549 et 8%4% et 1% pour MDCK, respectivement. L’infectiosité du virus vésiculaire de stomatite G glycoprotein PP était environ 21% pour A549 et 16% pour des cellules de MDCK.
Tandis que l’enveloppe delta glycoprotéines PP n’a montré aucune infectiosité. Il est essentiel de se rappeler que les cellules HEK-293T/17 productrices de PP constituent le fondement de cette procédure. Ainsi, la croissance optimale nous enseigner HEK-293T/17 cellules est le plus important.
Suite à cette procédure ou à un autre test tel que le réceptif L2, l’analyse de dingation peut être effectuée. Cet essai peut presque donner débarrassé des particularités biologiques de la préférence de récepteur et le modèle révélera le tropisme du PPS. Depuis qu’ils ont pris les glycoprotéines du virus de la grippe sont clonés en deux plus max.
Ha et les protéines NA peuvent être étudiés séparément de sorte que nous réassortment entre eux. Les mutants et les effets matures peuvent être explorés.
