Ringraziamo il Max Planck Society, il Programma Human Frontier Science (HFSP) e la Boehringer Ingelheim Fonds per il finanziamento e il sostegno.

1. Preparazione del materiale <ol><li> Preparazione dei tubi FEP <ol><li> Pulire il tubo FEP (Figura 2A), tramite iniezione di liquidi (nelle fasi sotto riportate) attraverso il tubo e l&#39;utilizzo di una siringa collegata con una estremità cannula smussa (Figura 2B) Nota 1:.. Utilizzare guanti durante l&#39;intera procedura Nota 2: Si consiglia di tagliare il tubo in pezzi di ca. 1 m di lunghezza e pulizia quelle in parallelo. <ol><li> Prima sciacquare il tubo con 1 M NaOH ripetutamente. Quindi trasferire il tubo di un tubo da centrifuga da 50 ml riempito con 0,5 M NaOH e ultrasonicate per 10 min. </li><li> Trasferire il tubo di polimeri ad un piccolo bacino con DDH 2 O. Lavare il tubo prima con DDH 2 O e poi con il 70% EtOH. </li><li> Successivamente trasferire il tubo FEP una provetta da centrifuga fresca con il 70% EtOH. Ancora una volta ultrasonicate questo tubo centrifugare per 10 min. </li></ol></li><li> Tagliare il tubo FEP pulito in pezzidi circa 3 cm (una lunghezza tipica per l&#39;uso in zebrafish montaggio e di imaging) e raddrizzarli se necessario. Conservare le provette FEP puliti in una fresca 50 ml tubo da centrifuga riempito con DDH 2 O (Figura 2C). </li></ol></li><li> Preparazione della soluzione madre Tricaine <ol><li> Preparare 0,4% soluzione Tricaine magazzino sciogliendo 400 mg Tricaine (MS-222) in 97,9 ml DDH 2 O. Dopo che la polvere è completamente sciolto, regolare il pH a 7,0 con 2,1 ml 1M Tris (pH 9,0). Proteggere la soluzione dalla luce. Conservare aliquote a -20 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione del 3% metilcellulosa <ol><li> Preparare la soluzione di metilcellulosa 3% per il rivestimento interno dei tubi FEP come descritto di seguito. Riscaldare E3 11 in una bottiglia di vetro a circa 60-70 ° C e aggiungere la quantità appropriata di metilcellulosa polvere. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare a 4 ° C. Appena la soluzione è raffreddata a temperatura inferiore a 30 ° C, aggiungere la soluzione Tricaine ad un c finaleoncentration di 100 mg / L. Continuate a mescolare a 4 ° C durante la notte. </li></ol></li><li> Preparazione del 1,5% e 0,1% agarosio in E3 <ol><li> Sciogliere la giusta quantità di agarosio a basso punto di fusione della polvere in un volume definito di E3 in un pallone di vetro. Riscaldare la miscela in un forno a microonde e agitarla di tanto in tanto, fino a quando la soluzione di agarosio appare omogenea, senza i cristalli rimanenti. </li><li> Preparare 1 ml aliquote di soluzione di agarosio 0,1% in 1,5 ml provette di reazione. Le aliquote possono essere conservati a 4 ° C. </li><li> Utilizzare la soluzione 1,5% per rivestire un piatto di plastica Petri. Lo spessore dello strato di agarosio dovrebbe essere ca. Mm 2. Dopo l&#39;agarosio si è solidificato, aggiungere E3 medio sulla parte superiore dello strato per evitare che si secchi. Il piatto rivestito può essere conservato a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione di zebrafish <ol><li> Tenere Zebrafish (Danio rerio) adulti e gli embrioni a 28,5 ° C e gestirli secondo i protocolli stabiliti 11,12. </li><li> Impostare il pesce maschio e femmina nel pomeriggio e separarli con un divisore. Rimuovere il divisore la mattina seguente in volta l&#39;accoppiamento del pesce. </li><li> Raccogliere gli embrioni in un piatto pieno di E3 ed esaminare utilizzando uno stereomicroscopio. </li><li> Al 24 hpf (o lo stadio di sviluppo di tuo interesse), selezionare l&#39;embrione di zebrafish per l&#39;espressione di fluorescenza e trasferire quelli positivi per un nuovo piatto con E3 fresca. </li><li> Dechorionate attentamente gli embrioni utilizzando due pinze taglienti (figure 2D e 2E). Utilizzare le prime pinze per afferrare e tenere premuto il corion e la seconda pinza a strappare aprirlo e tirarlo fuori Nota 1:. Eseguire questo passaggio con l&#39;aiuto di uno stereomicroscopio. </li></ol></li></ol> 2. Multistrato di montaggio <ol><li> Rivestimento del tubo FEP <ol><li> Collegare una cannula punta smussata ad una siringa. Inserire la cannula con cura per circa 3 mm nella un&#39;estremità di un pulito e tagliato pezzo di. Tubo FEP (figure 2F e 2G) Nota 1: Indossare guanti ed evitare qualsiasi o spremitura piegatura del tubo. </li><li> Immergere l&#39;estremità libera del tubo FEP in 3% di metilcellulosa e riempire il tubo con la soluzione. </li><li> Rilasciare lentamente la metilcellulosa spingendo sulla siringa. Scartare la soluzione. </li><li> Ripetere i punti 2.1.2 e 2.1.3 utilizzando E3 Nota 1:. I tubi rivestiti devono essere utilizzati per il montaggio immediatamente. </li></ol></li><li> Trasferire il pesce zebra per l&#39;agarosio <ol><li> Riscaldare un&#39;aliquota di 0,1% agarosio a 70 ° C in un blocco di calore. Vortex brevemente il tubo di reazione e trasferirlo ad un blocco di calore impostato a 38 ° C (Figura 2H). </li><li> Prendete il tubo di reazione fuori dal blocco fuoco e lasciate raffreddare brevemente. Aggiungere Tricaine ad una concentrazione finale di 133-200 mg / L e vortice nuovamente (Figura 2I). </li><li> Selezionare uno degli embrioni dechorionated zebrafish e transfe. r al tubo di reazione con l&#39;preriscaldato 0,1% agarosio utilizzando una pipetta Pasteur di vetro (Figure 2J e 2K) Nota 1: Prova di trasferire il meno supplementare E3 possibile. </li></ol></li><li> Montaggio del zebrafish <ol><li> Raccogliere l&#39;embrione con il tubo FEP siringa allegata (Figura 2L). . Il tubo deve essere riempito completamente con 0.1% agarosio, con l&#39;embrione posizionato vicino a una delle estremità del tubo e con la testa rivolta verso l&#39;apertura del tubo Nota 1: Assicurati di prendere un po &#39;di agarosio prima di prendere il pesce. Nota 2: Tirate delicatamente sulla siringa per evitare le bolle Nota 3:. Tenere il tubo in posizione orizzontale per evitare la fuoriuscita del suo contenuto (Figure 2M e 2N). </li></ol></li><li> Collegare il tubo <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Multistrato di montaggio per embrioni di zebrafish. A) L&#39;etilene propilene fluorurato (FEP) i tubi su un tamburo cavo prima della preparazione. B) una siringa con una cannula punta smussata in allegato. C) A puliti e tagliati FEP tubo. D, E) Dechorionation del 24 hpf embrioni di zebrafish. F) Fissare il tubo alla cannula punta smussata. G) ​​La siringa con cannula e il tubo attaccato. H) Un&#39;aliquota dello 0,1% agarosio all&#39;interno di un tubo di reazione durante il trasferimento ad un blocco di calore. I) vortex del fuso agarosio. J) Uptake di un embrione dechorionated utilizzando una pipetta di vetro. K) Trasferimento dell&#39;embrione in agarosio fuso. L) aspirazione dell&#39;embrione con circostanti agarosio nel tubo FEP. M, N) L&#39;embrione zebrafish all&#39;interno del tubo FEP . <strong&gt; O) Taglio del tubo tra campione e cannula. P) Inserimento del tubo mediante l&#39;uso di un piatto di agarosio rivestita. Q) L&#39;embrione all&#39;interno del tubo inserito. R) La preparazione finale del campione in un supporto metallico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <ol><li> Utilizzare una lama di rasoio per tagliare il tubo largo della cannula (Fig. 2O). </li><li> Lentamente attaccare l&#39;estremità del tubo contenente il pesce attraverso l&#39;intero strato di 1,5% agarosio nel piatto di plastica per collegare il tubo (Figura 2P) Nota 1:. Evitare la formazione di bolle e cercare di ottenere una superficie spina diritta tenendo la . tubo esattamente perpendicolare alla superficie agarosio Nota 2: ruotare leggermente il tubo per ottenere una bella spina. </li><li> Mantenere il campione montati in un tubo di reazione da 1,5 ml con E3 per evitare l&#39;essiccamento. Il campione è now pronto per essere ripreso. Prima della rappresentazione, controllare se il pesce è seduto proprio sulla cima della spina (figure 2Q e 2R). Assicurarsi di aggiungere anche Tricaine al mezzo all&#39;interno della camera di imaging nella stessa concentrazione nel liquido di montaggio. </li></ol></li></ol>

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	<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy.">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li><li>Swoger, J., Muzzopappa, M., L&#243;pez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies.">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J. Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2011).</li><li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques.">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J. Biophoton. , 1-11 (2012).</li><li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology.">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+scanned+laser+light+sheet+fluorescence+microscopy.">Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb. Prot. 2010 (5), (2010).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+sample+holder+for+single+plane+illumination+microscopy.">A versatile sample holder for single plane illumination microscopy.</a> J. Microsc. 10, (2013).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2002).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Jin, S. -. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -. N., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li><li>Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+histone+variant+H2A.F/Z+and+a+transgenic+H2A.F/Z:GFP+fusion+protein+for+in+vivo+studies+of+embryonic+development.">A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 211 (12), 603-610 (2001).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+on+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tecniche di microscopia avanzata come la microscopia foglio leggero ci consentono di registrare i dati di immagine con alta risoluzione temporale e spaziale nel corso di diversi giorni, ma richiedono anche tecniche di montaggio di esempio per migliorare. Vi presentiamo un protocollo dettagliato di montaggio per la microscopia foglio leggero dello sviluppo zebrafish multistrato. Il metodo è semplice da implementare e lo usiamo nel nostro laboratorio su una base quotidiana. I tubi FEP I componenti chiave della nostra strategia di montaggio sono tubi fatti di etilene propilene fluorurati polimero (FEP). Abbiamo deciso di utilizzare FEP soprattutto a causa del suo indice di rifrazione di 1,338, che è simile all&#39;acqua e quindi ideale per microscopia foglio leggero con obiettivi acqua-immersione e di campioni che richiedono mezzi acquosi. I tubi con 0,8 millimetri di diametro interno e 0,4 mm di spessore montare il pesce zebra in via di sviluppo molto bene, possono essere utilizzati con supporti tipici esempi adatti a 1,6 millimetricapillari e sono la nostra prima scelta per il metodo di montaggio presentato. Li abbiamo testato a fondo nelle nostre configurazioni in casa costruita così come nel sistema commerciale &quot;Lightsheet Z.1&quot; di Carl Zeiss Microscopy verificando che i tubi FEP offrire stabilità a lungo termine, hanno solo un impatto minimo sulle prestazioni ottiche e sono non fluorescente 10. Sono, tuttavia, non adatti per applicazioni con campioni che richiedono un indice di rifrazione diverso, ad esempio eliminato campione. Tubi e lamine in FEP sono disponibili in una varietà di diametri e spessori. Inoltre, FEP può essere fuso a 260 ° C e quindi offre possibilità pressoché infinite di supporti di montaggio del campione su misura. I tubi polimerici tendono ad essere fornito non sterile, motivo per cui il protocollo di pulizia incorpora diverse misure per garantire la migliore qualità ottica. Il rivestimento di metilcellulosa assicura che nessuna parte della crescente zebrafish si attacca al polimero. La decisione di 0,1% agarosio si fonda su ampie prove di crescita e immobilità in diverse concentrazioni di agarosio e metilcellulosa 10. Concentrazioni superiori allo 0,1% agarosio già mostrato un forte impatto sul tasso di crescita del 24 HPF zebrafish. Inoltre usiamo basse dosi del farmaco Tricaine anestetizzante. Potenziali d&#39;azione blocchi tricaine, inibisce così la trasmissione del segnale tra cervello e muscoli e sopprime contrazioni muscolari 16. Una concentrazione di 133-200 mg / L assicura sufficiente immobilizzazione di zebrafish tra 24-72 HPF. Tuttavia, Tricaine e altre droghe anestetizzante abbiamo testato spettacolo dosi effetti collaterali dipendenti come edema cardiaco. Inoltre, la dose richiesta di Tricaine varia con lo stadio di sviluppo dell&#39;embrione. Si consiglia pertanto di ridurre la concentrazione Tricaine all&#39;importo necessario per le fasi di sviluppo che vengono esposte. Per garantire la migliore prestazioce e prevenire la formazione di sottoprodotti tossici, soluzione stock Tricaine preparata di fresco o scongelato deve essere usato, al riparo dalla luce e riscaldamento non superiore a 30 ° C. L&#39;embedding in tubi FEP consente inoltre di facile modifica del mezzo di montaggio per tenere conto di esigenze specifiche. Per time-lapse imaging del cuore, si consiglia di utilizzare il 3% di metilcellulosa e 100 mg / L Tricaine invece del 0,1% agarosio e 200 mg / L per il montaggio. La metilcellulosa è più viscoso 0,1% agarosio fornendo così maggiore immobilità propria e meno Tricaine deve essere utilizzato per assicurare confinamento dell&#39;embrione. Tricaine è sensibile a temperature superiori a 30 ° C e può anche essere diluito dal fluido nella camera di imaging, conseguente diminuzione delle prestazioni e possibili contrazioni dell&#39;embrione. Pertanto, assicurarsi di utilizzare Tricaine anche nel mezzo di imaging in cui il campione montato è immerso. Se i vostri esperimenti richiedono l&#39;uso di una maggioretemperature, si raccomanda di cambiare il mezzo nella camera di imaging sia costantemente utilizzando un sistema di perfusione o manualmente con un tubo e una siringa tra due punti temporali. Passaggi critici I passaggi critici durante il processo di montaggio del campione sono le aspirazione del campione nella provetta e l&#39;inserimento della spina agarosio. L&#39;assunzione definisce la posizione iniziale dell&#39;embrione, che è ingombrante cambiare dopo. I campioni multipli devono essere disponibili per montare e la qualità di montaggio devono essere monitorati con uno stereomicroscopio. Se l&#39;orientamento del campione non è soddisfacente, alterando la velocità di elaborazione del campione e di evitare successivi movimenti del pistone può aiutare in quanto spesso stravolge l&#39;embrione. La spina agarosio 1,5% è necessario per evitare perdite di agarosio 0,1%. La superficie del tappo all&#39;interno del tubo deve essere piatta per non influenzare l&#39;orientamento campione durante lo sviluppo. Per ottenere una buona navigazioneasso, differenti spessori degli strati di agarosio devono essere testati e il tubo deve essere messo in agarosio normale alla superficie. Ruotando il tubo un po &#39;e tirando il tubo rilascia cautela la spina dal piatto. La qualità del montaggio deve essere verificata con uno stereomicroscopio prima di imaging. Immagini Multiview Uno dei principali vantaggi della microscopia foglio leggero è l&#39;imaging MultiView, la possibilità di ruotare il campione, acquisire z-stack da più angolazioni e successivamente registrare e fonderli. Un metodo stabilito per registrare i z-stack in uno spazio 3D è basato bead-registrazione utilizzando perline fluorescenti che circondano il campione come marcatori fiduciari 17. Questo metodo però si basa su un mezzo di montaggio solido come 1,5% agarosio e sembra quindi incompatibile con il multistrato montaggio presentato qui. Ma diverse soluzioni alternative funzionano a seconda dell&#39;applicazione. In primo luogo, le perline fluorescenti possonoessere incorporato nella spina agarosio, che deve essere nel campo visivo durante l&#39;acquisizione. In secondo luogo, le posizioni di fase possono essere calibrati prima degli esperimenti reale utilizzando una colonna di agarosio 1,5% con perline fluorescenti. Terzo, marcatori alternativi come nuclei fluorescenti possono essere usati per identificare la posizione di Z-stack rispetto all&#39;altro. Evaporazione Tipiche configurazioni microscopia foglio leggero usa una camera del campione aperta, che inevitabilmente porta a vaporizzazione del fluido. Poiché il mezzo è essenziale per la sopravvivenza del campione, per limitare l&#39;evaporazione del mezzo di montaggio e per l&#39;indice di rifrazione corretta tra ottica e di esempio, si consiglia di prendere una o più delle seguenti misure per prevenire l&#39;evaporazione. In primo luogo, il mezzo nella camera può essere costantemente scambiato da un sistema di perfusione. In secondo luogo, il mezzo può essere riempito manualmente. Terzo, la camera può essere coperto con un coperchio o una lamina flessibile. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; fornitura di ossigeno Il FEP polimero è stato sviluppato per resistere ad una grande varietà di prodotti chimici ed è quindi robusto, chimicamente inerte e nonpermeable a gas. Nel caso di montaggio multistrato ossigeno può penetrare solo attraverso la spina agarosio e l&#39;interfaccia agarosio-aria, ma resta da dimostrare se l&#39;apporto di ossigeno nel montaggio multistrato è notevolmente inferiore rispetto al montaggio in 1,5% agarosio senza tubo portante polimerica. Tuttavia, come il montaggio in 1,5% agarosio può essere utilizzato solo per circa due ore prima della morfologia zebrafish è influenzato montaggio multistrato sembra essere la soluzione complessiva superiore per l&#39;imaging a lungo termine. Imaging precedenti fasi di sviluppo Multistrato di montaggio è ormai diventata la nostra tecnica incasso standard per la microscopia di zebrafish di età superiore a 24 hpf foglio leggero time-lapse. Oltre a questo, usiamo anche i tubi polimerici per l&#39;imaging dei primi embrioni stadio. L&#39;indirizzo embryos rimangono nelle loro chorions e sono montati in un tubo FEP con diametro interno di 1 mm e riempiti con E3. Il pesce zebra in grado di svilupparsi liberamente all&#39;interno del corion e può ancora essere ripreso anche utilizzando la microscopia foglio leggero. Prospettiva Il montaggio del campione multistrato presentato scatena il pieno potenziale della microscopia foglio leggero in tempo reale biologia dello sviluppo con zebrafish. Può essere facilmente adottata per altre tecniche di microscopia come la tomografia ottica di proiezione (OPT) e di altri organismi. Noi crediamo che i tubi FEP dimensioni standard sono solo i primi passi verso tecniche di montaggio del campione su misura per esigenze specifiche.

Per capire gli eventi complessi e interazioni durante l&#39;embriogenesi, la ricerca in biologia dello sviluppo è sempre più passando da microscopia di singole cellule e organi di immagini in vivo di interi organismi. Tradizionali tecniche di microscopia tipicamente non riescono ad offrire la risoluzione spaziale e temporale per seguire eventi rapidi per un lungo periodo di tempo e sono spesso causa di sbiancamento o effetti fototossiche nel campione 1. Noi e altri abbiamo trovato microscopia ottica foglio (Figura 1) sia la tecnica ideale per l&#39;imaging in vivo di zebrafish 2-4. L&#39;illuminazione del campione con un sottile foglio di luce laser, ortogonale all&#39;asse di rilevamento, offre sezionamento ottico veloce con alta risoluzione spaziale e minimizzato fototossicità 5. Allo stesso tempo, a causa di questa disposizione ottica unica, tecniche di montaggio tradizionale campione utilizzando piastre Petri o camere di coltura non sono adatti. In una luce tipicamicroscopio foglio tre motori traslazionali e un motore di rotazione tengono il campione, in modo da poter essere posizionato precisamente, trasformate e visualizzati da qualsiasi direzione. Negli ultimi campioni per la microscopia foglio leggero sono stati spesso incorporato nel 1-2% agarosio all&#39;interno di un capillare di vetro 6,7. In questo caso il cilindro agarosio solidificato con il campione incorporate viene estruso dal capillare di vetro nell&#39;apposita camera occupato dal mezzo acquosa per l&#39;imaging. Agarosio ha un indice di rifrazione vicino all&#39;acqua ed è quindi perfettamente adatto per microscopia foglio leggero in vivo che facilita corretta acqua-illuminazione e rilevazione ottica. Il campione viene confinato nella agarosio rigido e può essere ripreso bene per un breve periodo di tempo, ma cambiamenti morfogenetici e crescita dell&#39;embrione sono fortemente compromessa quando l&#39;imaging per diverse ore 7,8. Sebbene siano state sviluppate soluzioni per altre applicazioni 9, la non invasiva a lungo termine time-lapse zebrafish<html> potenziale di imaging della microscopia foglio leggero non può essere sfruttata utilizzando il tradizionale 1,5% agarosio incorporamento. Abbiamo quindi sviluppato una nuova strategia per il montaggio in vivo microscopia ottica di embrioni di zebrafish 10 fogli. Il campione è montato in 0,1% di agarosio con 200 mg / L Tricaine dentro un tubo del otticamente trasparente polimero fluorurato etilene-propilene (FEP). L&#39;embrione incorporato sviluppa normalmente a causa della bassa viscosità del mezzo. Allo stesso tempo, il tubo FEP limita il mezzo e il campione per la durata dell&#39;esperimento. Qui forniamo un protocollo dettagliato della nuova tecnica di montaggio e dati presenti riflettente suoi vantaggi rispetto al protocollo convenzionale. Abbiamo dimostrato che con il nostro sviluppo zebrafish metodo può essere continuamente ripreso con elevata risoluzione spaziale e temporale in un periodo di più di due giorni. 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Il principio di microscopia foglio leggero. A zebrafish montato in un tubo in etilene propilene fluorurato (FEP) può essere tradotto e ruotato il piano focale dell&#39;obiettivo rilevamento. Un foglio sottile di luce laser (foglio leggero) è proiettata dall&#39;obiettivo illuminazione nel piano focale dell&#39;obiettivo rilevamento e illumina solo una sezione ottica sottile del campione. Il segnale di fluorescenza emessa viene raccolta dall&#39;obiettivo rilevamento e registrato su un chip fotocamera.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

Foglio di microscopia ottica è la tecnica di imaging ideale per studiare lo sviluppo embrionale zebrafish. Grazie alla minima foto-tossicità e sbiancamento, è particolarmente adatto per il lungo termine time-lapse imaging per molte ore fino a diversi giorni. Tuttavia, è necessaria una strategia di montaggio campione adeguato che offre sia il parto e lo sviluppo normale del campione. Multistrato di montaggio, una nuova tecnica di incorporamento con bassa concentrazione di agarosio in tubi otticamente chiaro, ora supera questa limitazione e scatena il pieno potenziale della microscopia foglio leggero in tempo reale biologia dello sviluppo.

Imaging multiday di Zebrafish Vasculature Sviluppo Usiamo 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 zebrafish per dimostrare i vantaggi della strategia di montaggio multistrato a lungo termine microscopio foglio leggero. L&#39;obiettivo è quello di immagine lo sviluppo del sistema vascolare in tutta zebrafish su un percorso di 2 giorni. L&#39;embrione zebrafish è stato montato in 0,1% agarosio all&#39;interno di un tubo polimerico rivestito metilcellulosa. Qui, il pesce zebra non è limitata dal mezzo di montaggio e può svilupparsi normalmente. La testa alza, la coda si estende e germinazione vascolare appare senza ostacoli (Figura 3). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Figura 3. Immagini Multiday dello sviluppo vascolare zebrafish. Vascolarizzazione di un multilayer montato 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 zebrafish sviluppa senza ostacoli in un microscopio foglio leggero nel corso di due giorni. Un foglio di luce laser 488 nm eccitato la fluorescenza e il segnale è stato rilevato utilizzando 10X/0.3 W oggettiva e una fotocamera EMCCD. Z-stack sono stati acquisiti su quattro posizioni adiacenti ogni 10 min e successivamente cuciti con le Figi 15. Sono mostrate proiezioni di massima intensità di un sottoinsieme di punti temporali. Barra della scala:. 500 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> Imaging of Early Zebrafish Embriogenesi Qui, dimostriamo la capacità di tubi FEP come supporto di montaggio per la microscopia leggero foglio di embriogenesi precoce zebrafish durante il primo giorno dopo la fecondazione. L&#39;8 hpf Tg (H2A: GFP) 14 zebrafish è stato montato con il suo corion intatto all&#39;interno di un tubo E3-riempita con idiametro nner di 1 mm. Che si traduce in un leggero bloccaggio del corion. Tutti i processi di sviluppo durante l&#39;embriogenesi non sono influenzati dal montaggio e possono essere visualizzati in modo ottimale utilizzando la microscopia foglio leggero. In questo esempio, abbiamo ripreso il campione su un percorso di 12 ore (Figura 4). Cambiamenti di forma tipici durante l&#39;embriogenesi iniziale, come la maggiore allungamento del tuorlo e ispessimento del tessuto lungo la linea mediana, sarebbero oppressi quando si utilizza il montaggio tradizionale senza corion in 1,5% agarosio. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Figura 4 Imaging di embriogenesi precoce zebrafish Un Tg (H2A: GFP) 14. Zebrafish passa attraverso embriogenesi precoce. È stato rilevato un foglio leggero laser 488 nm GFP eccitato e il segnale di fluorescenzacon una W obiettivo 10X/0.3 e una fotocamera EMCCD. Z-stack da due angoli sono stati acquisiti ogni 3 minuti per un corso di 12 ore. Sono mostrati normalizzati proiezioni di massima intensità di un sottoinsieme del time-lapse. Visibile sfuocatura di movimento a 19 risultati HPF dalla contrazione embrione durante l&#39;acquisizione, in quanto sono stati utilizzati senza anestesia. Barra della scala:. 150 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

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Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Lo sviluppo di zebrafish può essere seguita nel giorni con microscopio foglio leggero, quando gli embrioni sono inserite in tubi polimerici otticamente trasparenti con bassa concentrazione di agarosio.

Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Lo sviluppo di zebrafish può essere seguita nel giorni con microscopio foglio leggero, quando gli embrioni sono inserite in tubi polimerici otticamente trasparenti con bassa concentrazione di agarosio. 

Video: Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

Ricerca

Biologia

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Applicazione della Luce cured resina adesiva dentale per montaggio elettrodi o sonde Microdialisi negli esperimenti cronica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Impostazione di un semplice foglio microscopio ottico per<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt; Sviluppo

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, un metodo per montare la larva della Drosophila per l'imaging time-Lapse a lungo termine

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

Imaging live simultaneo di più embrioni di insetti nei microscopi a fluorescenza a fogli di luce a camera campione

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.