Agradecemos a la Sociedad Max Planck, la Human Frontier Science Program (HFSP) y el Boehringer Ingelheim Fonds para su financiación y apoyo.

1. Preparación de materiales <ol><li> Preparación de tubos de FEP <ol><li> Limpie el tubo de FEP (Figura 2 A) por el lavado líquidos (en los pasos indicados a continuación) a través del tubo y usando una jeringa conectada a una cánula de punta roma (Figura 2B) Nota 1:.. Utilizar guantes durante todo el procedimiento Nota 2: Se recomienda cortar el tubo en piezas de aprox. 1 m de longitud y la limpieza de aquellos en paralelo. <ol><li> Primero enjuagar la sonda con NaOH 1 M repetidamente. A continuación, transferir el tubo a un tubo de centrífuga de 50 ml llena con 0,5 M de NaOH y se ultrasonicate durante 10 min. </li><li> Transferir el tubo de polímero a una pequeña cuenca con ddH 2 O. Enjuague bien el tubo primero con ddH 2 O y luego con EtOH al 70%. </li><li> Posteriormente transferir el tubo FEP a un tubo de centrífuga fresco con EtOH al 70%. Una vez más ultrasonicate este tubo de centrífuga durante 10 min. </li></ol></li><li> Corte el tubo FEP limpiado en pedazosde unos 3 cm (una longitud típica para el uso en el montaje de pez cebra y la imagen) y enderezar si es necesario. Guarde los tubos de FEP limpiados en un tubo de centrífuga de 50 ml fresco lleno de ddH2O (Figura 2C). </li></ol></li><li> Preparación de la solución madre tricaína <ol><li> Preparar la solución de stock tricaína 0,4% disolviendo 400 mg tricaína (MS-222) en 97,9 ml ddH 2 O. Después de que el polvo se haya disuelto por completo, ajustar el pH a 7,0 usando 2,1 ml de Tris 1 M (pH 9,0). Proteja la solución de la luz. Alícuotas Almacenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Preparación de 3% de metilcelulosa <ol><li> Preparar solución de metilcelulosa al 3% para el recubrimiento interior de los tubos de FEP tal como se describe a continuación. Calentar E3 11 en una botella de vidrio de aproximadamente 60 a 70 ° C y añadir la cantidad apropiada de polvo de metilcelulosa. Añadir una barra de agitación y se agita a 4 ° C. Tan pronto como la solución se enfría hasta por debajo de 30 ° C, añadir solución tricaína a un final Concentration de 100 mg / L. Mantener la agitación a 4 ° C durante la noche. </li></ol></li><li> Preparación de 1,5% y 0,1% de agarosa en E3 <ol><li> Disolver la cantidad apropiada de bajo punto de fusión en polvo de agarosa en un volumen definido de E3 en un matraz de vidrio. Calentar la mezcla en un horno de microondas y agitar de vez en cuando, hasta que aparezca homogénea la solución de agarosa, sin cristales restantes. </li><li> Preparar alícuotas de 1 ml de solución de agarosa al 0,1% en 1,5 ml de tubos de reacción. Las alícuotas se pueden almacenar a 4 ° C. </li><li> Use la solución del 1,5% para cubrir un plato de plástico Petri. El espesor de la capa de agarosa debe ser ca. 2 mm. Después de que se solidifica la agarosa, se añade medio de E3 en la parte superior de la capa para evitar que se seque. El plato recubierto se puede almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparación de pez cebra <ol><li> Mantenga pez cebra (Danio rerio) adultos y embriones a 28,5 ° C y manejarlos de acuerdo a los protocolos establecidos 11,12. </li><li> Configure los peces machos y hembras de la tarde y separarlos utilizando un divisor. Retire el separador de la mañana siguiente en cuando el apareamiento de los peces. </li><li> Recoger los embriones en un plato lleno de E3 y examinarlos utilizando un microscopio estereoscópico. </li><li> A las 24 HPF (o la etapa de desarrollo de su interés), seleccionar el embrión de pez cebra para la expresión de fluorescencia y transferencia de los positivos a un nuevo plato con E3 fresco. </li><li> Dechorionate cuidadosamente los embriones utilizando dos pinzas cortantes (Figuras 2D y 2E). Utilice las primeras pinzas para agarrar y sostener el corion y el segundo fórceps rasgarlo abierto y llevarlo a cabo Nota 1:. Realice este paso con la ayuda de un microscopio estereoscópico. </li></ol></li></ol> 2. Multicapa de montaje <ol><li> Revestimiento del tubo de FEP <ol><li> Conecte una cánula extremo romo a una jeringa. Inserte la cánula cuidadosamente durante aproximadamente 3 mm en un extremo de un limpiado y cortar el pedazo de. Tubo de FEP (Figuras 2F y 2G) Nota 1: Usar guantes y evitar cualquier flexión o compresión del tubo. </li><li> Sumergir el extremo libre del tubo de FEP en 3% de metilcelulosa y llenar el tubo con la solución. </li><li> Suelte lentamente el metilcelulosa empujando en la jeringa. Deseche la solución. </li><li> Repetir los pasos 2.1.2 y 2.1.3 usando E3 Nota 1:. Los tubos recubiertos necesitan ser utilizado para el montaje de inmediato. </li></ol></li><li> Transferencia del pez cebra para la agarosa <ol><li> Calentar una alícuota de 0,1% de agarosa a 70 ° C en un bloque de calor. Vórtice brevemente el tubo de reacción y la transfiere a un bloque de calor ajustado a 38 ° C (Figura 2H). </li><li> Tome el tubo de reacción desde el bloque de calor y deje que se enfríe brevemente. Añadir tricaína a una concentración final de 133 a 200 mg / L y de vórtice de nuevo (Figura 2I). </li><li> Seleccione uno de los embriones de pez cebra dechorionated y transfe. r al tubo de reacción con el precalentado 0,1% de agarosa utilizando una pipeta Pasteur de vidrio (Figuras 2J y 2K) Nota 1: Trate de transferir el menor E3 adicional posible. </li></ol></li><li> Montaje del pez cebra <ol><li> Recoger el embrión con el tubo FEP jeringa adjunta (Figura 2L). . El tubo debe ser llenado completamente con un 0,1% de agarosa, con el embrión situado cerca de uno de los extremos del tubo y con la cabeza apuntando hacia la abertura del tubo Nota 1: Asegúrese de tomar un poco de agarosa antes de tomar el pescado. Nota 2: Tire muy suavemente en la jeringa para evitar burbujas Nota 3:. Mantener el tubo en una orientación horizontal para evitar la fuga de su contenido (Figuras 2M y 2N). </li></ol></li><li> Al conectar el tubo <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. De múltiples capas de montaje para los embriones de pez cebra. A) de etileno propileno fluorado (FEP) tubos en un tambor de cable antes de la preparación. B) Una jeringa con una cánula de extremo romo adjunto. C) Un limpiado y cortar tubo de FEP. D, E) Dechorionation de 24 HPF embriones de pez cebra. F) Colocación del tubo de la cánula de extremo romo. G) La jeringa con cánula y el tubo adjunto. H) Una alícuota de 0,1% de agarosa en el interior de un tubo de reacción durante la transferencia a un bloque de calor. I) vórtex del fundido de agarosa. J) La captación de un embrión dechorionated usando una pipeta de vidrio. K) de transferencia del embrión en la agarosa fundida. L) de admisión del embrión y la zona de agarosa en el tubo de FEP. M, N) El embrión de pez cebra en el interior del tubo de FEP . <strong&gt; O) Q cortar el tubo entre el espécimen y la cánula. P) Conectar el tubo por el uso de un plato de agarosa-recubierto.) El embrión en el interior del tubo enchufado. R) La preparación de la muestra final en un soporte de metal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <ol><li> Utilice una hoja de afeitar para cortar el tubo de la cánula (Figura 2O). </li><li> Lentamente pegar el extremo del tubo que contiene el pescado a través de toda la capa de 1,5% de agarosa en el plato de plástico para tapar el tubo (Figura 2P) Nota 1:. Evitar la formación de burbujas y tratar de obtener una superficie enchufe recto manteniendo la . tubo exactamente perpendicular a la superficie de agarosa Nota 2: Gire el tubo ligeramente para obtener un tapón agradable. </li><li> Mantenga la muestra montada en un tubo de reacción de 1,5 ml con E3 para evitar la desecación. La muestra es now listo para ser fotografiado. Antes de las imágenes, comprobar si el pescado está sentado a la derecha en la parte superior del tapón (figuras 2Q y 2R). Asegúrese de añadir también tricaína al medio dentro de la cámara de formación de imágenes en la misma concentración como en el medio de montaje. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Técnicas avanzadas de microscopía tales como microscopía de lámina de luz nos permiten grabar datos de imagen con alta resolución temporal y espacial en el transcurso de varios días, pero también requieren técnicas de montaje de la muestra para mejorar. Se presenta un protocolo detallado de montaje para la hoja de microscopía óptica de desarrollo del pez cebra multicapa. El método es sencillo de implementar y la usamos en nuestro laboratorio sobre una base diaria. Los tubos de FEP Los componentes clave de nuestra estrategia de montaje son tubos hechos del etileno fluorado polímero de propileno (FEP). Hemos decidido utilizar la FEP sobre todo debido a su índice de refracción de 1,338, que es similar a la del agua y por lo tanto ideal para la microscopía de lámina de luz con los objetivos de inmersión de agua y muestras que requieren medios acuosos. Los tubos con 0,8 mm de diámetro interior y 0,4 mm de espesor de pared ajustarse el pez cebra en desarrollo muy bien, se pueden utilizar con soportes de muestra típicos adecuados para 1,6 mmcapilares y son nuestra primera opción para el método de montaje presentado. Los probamos a fondo en nuestras configuraciones de fabricación casera, así como en el sistema comercial &quot;Lightsheet Z.1&quot; de Carl Zeiss Microscopía y encontramos que los tubos de FEP ofrecer estabilidad a largo plazo, tienen un impacto mínimo en el rendimiento óptico y son no fluorescente 10. Ellos son, sin embargo, no es adecuado para aplicaciones con muestras que requieren un índice de refracción diferente, por ejemplo, borra espécimen. Tubos así como láminas de FEP están disponibles en una variedad de diámetros y espesores. Además, FEP se puede fundir a 260 ° C y por lo tanto ofrece prácticamente infinitas posibilidades de soportes de montaje de la muestra medida. Los tubos de polímero tienden a ser suministrados sin esterilizar, por lo que el protocolo de limpieza incorpora varias medidas para garantizar la mejor calidad óptica. El recubrimiento con metilcelulosa se asegura de que ninguna parte de la creciente embrión de pez cebra se pega al polímero. La decisión de un 0,1% de agarosa se ​​basa en extensas pruebas de tasa de crecimiento y la inmovilidad en diferentes concentraciones de agarosa y metilcelulosa 10. Concentraciones superiores a 0,1% de agarosa ya mostraban un severo impacto en la tasa de crecimiento de 24 HPF pez cebra. Además utilizamos dosis bajas del fármaco tricaína anestesiante. Potenciales bloques tricaína de acción, por lo tanto, inhibe la transmisión de señales entre el cerebro y los músculos, y suprime las contracciones musculares 16. Una concentración de 133 a 200 mg / l asegura la inmovilización suficiente de pez cebra entre 24-72 HPF. Sin embargo, tricaína y otras drogas anestésicas que probamos espectáculo dosis efectos secundarios dependientes tales como edema cardíaco. Además, la dosis requerida de tricaína varía con la etapa de desarrollo del embrión. Por ello, recomendamos reducir la concentración tricaína a la cantidad necesaria para las etapas de desarrollo que están incluidas en la imagen. Para asegurar el mejor performance y prevenir la formación de subproductos tóxicos, solución madre tricaína preparado fresco o descongelado se debe utilizar, protegido de la luz y no se calienta por encima de 30 ° C. La incrustación en tubos de FEP también permite una fácil modificación del medio de montaje para dar cuenta de las necesidades específicas. Para time-lapse del corazón, se recomienda utilizar 3% de metilcelulosa y 100 mg / L tricaína en lugar de 0,1% de agarosa y 200 mg / L para el montaje. Metilcelulosa es más viscoso que el 0,1% de agarosa proporcionando así mayor inmovilidad en su propia y menos tricaína necesita ser utilizado para asegurar el confinamiento del embrión. Tricaína es sensible a temperaturas superiores a 30 ° C y también se puede diluir por el medio en la cámara de formación de imágenes, que conduce a una disminución del rendimiento y la posible contracciones del embrión. Por lo tanto, asegúrese de usar tricaína también en el medio de la imagen en la que se encuentra inmersa la muestra montada. Si sus experimentos requieren el uso de más altotemperaturas, se recomienda el intercambio de medio en la cámara de formación de imágenes, ya sea constantemente mediante el uso de un sistema de perfusión o de forma manual con un tubo y una jeringa entre dos puntos de tiempo. Los pasos críticos Los pasos críticos durante el proceso de montaje de la muestra son la ingesta de la muestra en el tubo y la inserción de la clavija de agarosa. La ingesta define la posición inicial del embrión, que es engorroso para cambiar después. Múltiples muestras deben estar a disposición de montar y la calidad de montaje deben ser vigilados con un microscopio estereoscópico. Si la orientación de la muestra no es satisfactoria, la alteración de la velocidad de la elaboración de la muestra y evitando movimientos posteriores del émbolo puede ayudar, ya que con frecuencia se tuerce el embrión. El tapón de agarosa al 1,5% es necesario para evitar fugas de la agarosa 0,1%. La superficie de la clavija en el interior del tubo debe ser plana para no influir en la orientación de la muestra durante el desarrollo. Para lograr un buen surfas, diferentes espesores de las capas de agarosa necesitan ser probado y el tubo tiene que ser puesto en la agarosa normal a la superficie. Al girar el tubo un poco y sacar el tubo libera cuidadosamente el enchufe de la antena. La calidad del montaje se debe comprobar con un microscopio estereoscópico antes de exponer. Imágenes Multiview Una de las principales ventajas de la microscopía de lámina de luz es la imagen Multiview, la capacidad de rotar la muestra, adquirir z-pilas desde múltiples ángulos y, posteriormente, registrar y fusionarlas. Un método establecido para registrar los z-pilas en el espacio 3D es el registro basado en perlas utilizando cuentas fluorescentes que rodean la muestra como marcadores fiduciarios 17. Este método, sin embargo depende de un medio de montaje sólido, tal como 1,5% de agarosa y por lo tanto parece ser incompatible con el montaje de múltiples capas presenta aquí. Pero varias soluciones alternativas funcionan dependiendo de la aplicación. En primer lugar, las perlas fluorescentes puedeser incorporado en el tapón de agarosa, que tiene que estar en el campo de visión durante la adquisición. En segundo lugar, las posiciones de la etapa pueden ser calibrados antes de los experimentos reales utilizando una columna de agarosa al 1,5% con perlas fluorescentes. En tercer lugar, los marcadores alternativos, tales como núcleos fluorescentes se pueden utilizar para identificar la posición de los z-pilas respecto a la otra. Evaporación Típicas configuraciones de microscopía de lámina de luz utilizan una cámara de muestra abierta, lo que conduce inevitablemente a la evaporación del medio. Puesto que el medio es esencial para la supervivencia de la muestra, para restringir la evaporación del medio de montaje y para el índice de refracción correcta entre la óptica y la muestra, se recomienda tomar una o más de las siguientes medidas para evitar la evaporación. En primer lugar, el medio en la cámara puede ser intercambiada constantemente por un sistema de perfusión. En segundo lugar, el medio se puede rellenar manualmente. En tercer lugar, la cámara se puede cubrir con una tapa o una lámina flexible. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; El suministro de oxígeno El FEP polímero fue desarrollado para soportar una gran variedad de productos químicos y es por lo tanto robusto, químicamente inerte y no permeable al gas. En el caso del oxígeno montaje multicapa sólo puede penetrar a través del tapón de agarosa y la interfaz de agarosa al aire, pero aún no se ha demostrado si el suministro de oxígeno en el montaje de múltiples capas está muy inferior en comparación con el montaje en el 1,5% de agarosa sin apoyar tubo de polímero. Sin embargo, como el montaje en 1,5% de agarosa sólo se puede utilizar durante aproximadamente dos horas antes de la morfología de pez cebra se ve afectada montaje de múltiples capas parece ser la solución superior en general para la formación de imágenes a largo plazo. Imaging etapas tempranas del desarrollo Multicapa de montaje se ha convertido en nuestra técnica de incrustación estándar para microscopía de lámina de luz lapso de tiempo de pez cebra mayores de 24 HPF. Además de eso, también utilizamos los tubos de polímeros para obtener imágenes de los embriones en etapas más tempranas. El correombryos permanecen en sus corion y están montados en un tubo FEP con un diámetro interior de 1 mm y se llenan con E3. El pez cebra puede desarrollar libremente dentro del corion y todavía se pueden obtener imágenes bien mediante microscopía de lámina de luz. Perspectiva El montaje de la muestra multicapa presentado desata todo el potencial de la microscopía de lámina de luz de la biología del desarrollo en tiempo real con el pez cebra. Puede ser fácilmente adoptado para otras técnicas de microscopía tales como la tomografía óptica de proyección (OPT) y otros organismos. Creemos que los tubos de FEP de tamaño estándar son sólo los primeros pasos hacia técnicas de montaje de la muestra a medida para necesidades específicas.

Para entender los eventos y de las interacciones complejas durante la embriogénesis, la investigación en biología del desarrollo es más móvil y más de microscopía de células individuales y órganos para formación de imágenes in vivo de organismos enteros. Técnicas de microscopía tradicionales normalmente no ofrecen una resolución espacial y temporal de seguir los eventos rápidos durante un largo período de tiempo y, a menudo causan efectos de blanqueo o fototóxicas en la muestra 1. Nosotros y otros encontramos hoja microscopía de luz (Figura 1) que sea la técnica ideal para imágenes in vivo del pez cebra 2-4. La iluminación de la muestra con una fina lámina de luz láser, ortogonal al eje de detección, ofrece seccionamiento óptico rápido con alta resolución espacial, así como reducir al mínimo la foto-toxicidad 5. Al mismo tiempo, debido a esta disposición óptica única, técnicas de montaje tradicionales de muestra utilizando placas de Petri o cámaras de cultivo no son adecuados. En una luz típicamicroscopio hoja de tres motores de traslación y un motor de rotación tienen la muestra, de tal manera que puede ser colocado con precisión, se volvieron y vieron desde cualquier dirección. En los últimos especímenes para microscopía de lámina de luz con frecuencia se han incrustado en el 1-2% de agarosa al interior de un capilar de vidrio de 6,7. En este caso el cilindro de agarosa solidificada con la muestra incrustados se extruye fuera del capilar de vidrio en la cámara de muestra lleno con medio-como el agua para la formación de imágenes. La agarosa tiene un índice de refracción cerca del agua y por lo tanto es ideal para microscopía in vivo de lámina de luz que facilita la óptica de iluminación y detección corregida con el agua. La muestra se limita en la agarosa rígido y se pueden obtener imágenes bien por un corto período de tiempo, pero los cambios morfogenéticos y el crecimiento del embrión se vean afectados fuertemente cuando Imaging para varias horas 7,8. Aunque las soluciones para otras aplicaciones se han desarrollado 9, el pez cebra no invasiva de lapso de tiempo a largo plazo<html> potencial de obtención de imágenes de microscopía de lámina de luz no puede ser explotada mediante el 1,5% de incorporación de agarosa convencional. Por lo tanto, hemos desarrollado una nueva estrategia para el montaje de lámina de luz de microscopía in vivo de embriones de pez cebra 10. La muestra se monta en 0,1% de agarosa con 200 mg / L de tricaína dentro de un tubo hecho de la de polímeros fluorados ópticamente claro de etileno propileno (FEP). El embrión embebido se desarrolla normalmente debido a la baja viscosidad del medio. Al mismo tiempo, el tubo de FEP confina el medio y la muestra para la duración del experimento. Aquí les ofrecemos un protocolo detallado de la nueva técnica de montaje y presentar datos que refleja sus ventajas sobre el protocolo convencional. Demostramos que con nuestro método de desarrollo del pez cebra se puede asociar de forma continua con una alta resolución espacial y temporal durante un período de más de dos días. 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. El principio de la microscopía de lámina de luz. Un pez cebra montado en un tubo hecho de propileno de etileno fluorado (FEP) puede ser traducido y se hace girar a través del plano focal del objetivo de detección. Una fina lámina de luz láser (hoja de luz) es proyectada por el objetivo de iluminación en el plano focal del objetivo de detección e ilumina sólo una sección óptica delgada de la muestra. La señal de fluorescencia emitida es recogida por el objetivo de detección y grabado en un chip de la cámara.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

Microscopía Calderería ligera es la técnica ideal para estudiar el desarrollo embrionario del pez cebra. Debido a la mínima fototoxicidad y blanqueo, es particularmente adecuado para time-lapse a largo plazo durante muchas horas hasta varios días. Sin embargo, se necesita una estrategia adecuada de montaje de la muestra que ofrece tanto el parto y el desarrollo normal de la muestra. Multicapa de montaje, una nueva técnica de incrustación utilizando agarosa de baja concentración en tubos ópticamente transparentes, ahora supera esta limitación y da rienda suelta a todo el potencial de la microscopía de lámina de luz de la biología del desarrollo en tiempo real.

Imaging Multiday de pez cebra Vasculatura Desarrollo Utilizamos 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 pez cebra para demostrar las ventajas de la estrategia de fijación de múltiples capas para la luz de microscopía hoja a largo plazo. El objetivo es la imagen el desarrollo de la vasculatura en todo el pez cebra durante un transcurso de 2 días. El embrión de pez cebra se montó en 0,1% de agarosa en el interior de un tubo de polímero recubierto de metilcelulosa. Aquí, el pez cebra no está restringido por el medio de montaje y puede desarrollarse normalmente. Su cabeza levanta, la cola se extiende y brotación vascular aparece sin obstáculos (Figura 3). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Figura 3. Multidía de formación de imágenes de la vasculatura el desarrollo de pez cebra. La vasculatura de un Multilayer montado 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 pez cebra se desarrolla sin obstáculos en un microscopio de lámina de luz a lo largo de dos días. Una lámina de luz láser de 488 nm excita la fluorescencia y la señal se detectó utilizando 10X/0.3 W objetiva y una cámara EMCCD. Z-pilas fueron adquiridas en cuatro posiciones adyacentes cada 10 min y posteriormente se cosen con Fiji 15. Se muestran las proyecciones de máxima intensidad de un subconjunto de los puntos de tiempo. Barra de escala:. 500 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> Imaging of Early pez cebra Embriogénesis Este sentido, demuestran la capacidad de los tubos de FEP como un soporte de montaje para la hoja de microscopía de luz de principios de la embriogénesis del pez cebra en el primer día después de la fertilización. El 8 HPF Tg (H2A: GFP) 14 embriones de pez cebra se montó con su corion intacta dentro de un tubo lleno de E3 con una idiámetro nner de 1 mm. Eso da lugar a una ligera sujeción del corion. Todos los procesos de desarrollo durante la embriogénesis se ven afectados por el montaje y se pueden visualizar de forma óptima mediante microscopía de lámina de luz. En este ejemplo, se tomó imágenes de la muestra sobre un curso de 12 horas (Figura 4). Cambios en la forma típicos durante la embriogénesis temprana, tales como el aumento de la elongación de la yema y engrosamiento del tejido a lo largo de la línea media, serían oprimidos cuando se utiliza el montaje tradicional sin corion en 1,5% de agarosa. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Figura 4 imágenes de principios de la embriogénesis del pez cebra Una Tg (H2A: GFP). 14 pez cebra pasa a través de la embriogénesis temprana. Se detectó una GFP emocionada 488 nm lámina de luz láser y la señal de fluorescenciacon un objetivo 10X/0.3 W y una cámara EMCCD. Z-pilas de dos ángulos fueron adquiridas cada 3 minutos durante un curso de 12 horas. Se muestran las proyecciones de intensidad máxima normalizada de un subconjunto del time-lapse. El desenfoque de movimiento visible a las 19 HPF resultados de la contracción del embrión durante la adquisición, ya que se utilizaron sin anestesia. Barra de escala:. 150 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>

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Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

El desarrollo de pez cebra se puede seguir durante días con la microscopía de lámina de luz cuando los embriones están inmersos en tubos de polímero ópticamente claros con agarosa de baja concentración.

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

multilayer-mounting-for-long-term-light-sheet-microscopy-of-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K vistas.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  El desarrollo de pez cebra se puede seguir durante días con la microscopía de lámina de luz cuando los embriones están inmersos en tubos de polímero ópticamente claros con agarosa de baja concentración. 

Video: Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A largo plazo de imágenes usando las células de mamíferos Wide-Field Microscopía

Investigación

Biología

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Aplicación de curado con luz Resina Adhesivo Dental para los electrodos de montaje o sondas de microdiálisis en experimentos crónica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Microscopía de luz Hoja de fluorescencia de las raíces de plantas que crecen en la superficie de un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, un método para montar larvas de Drosophila para imágenes de lapso de tiempo a largo plazo

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

Imágenes simultáneas en vivo de múltiples embriones de insectos en microscopios de fluorescencia de hoja de luz basados en cámaras de muestra

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.