Nous remercions le Dr S. Stella et Helen Vuong à contributions pour le protocole d&#39;imagerie de calcium. Nous remercions le Dr K. Feuilles pour filmer les scènes d&#39;entrevue. Nous remercions le Dr Arlene Hirano pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce projet de recherche et développement a été menée par les auteurs à la David Geffen School of Medicine à UCLA et est rendu possible par un accord de contrat qui a été attribué et géré par le Commandement de la recherche médicale et du matériel de l&#39;armée américaine (USAMRMC) et la technologie de télémédecine et avancée Centre de recherche (TATRC), à Fort Detrick, dans le Maryland, sous le numéro de contrat: W81XWH-10-2-0077. Le soutien à ces études sont également venus de NIH EY04067 et un examen du mérite VA (NB). PNE est une carrière chercheur VA.

Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les lignes directrices pour le bien-être des animaux de laboratoire émises par la politique US Public Health Service sur Human Care et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et l&#39;Université de Californie-Los Angeles (UCLA) Comité de recherche animale. Mâle et femelle adultes rats Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre l&#39;âge de 3-5 semaines ont été utilisés. 1. animaux et Préparation des tissus pour Wholemount Retina et le Protocole immunohistochimie <ol><li> Préparer les matériaux et outils suivants: Une loupe binoculaire, 2 pinces avec des pointes très fines, des ciseaux, du papier filtre de cellulose, pipette en plastique et une lame de microscope. </li><li> Euthanasier le rat dans une chambre fermée par anesthésie profondément les animaux avec 1-3% d&#39;isoflurane suivie par décapitation avec une guillotine. Retirez les yeux avec une paire de ciseaux de l&#39;iris et les placer dans une boîte de Petri contenant la solution extracellulaire. Hibernate A, Ames moidium ou solutions physiologiques sont recommandés. </li><li> [Étape facultative si le remblayage des CGR avec Fluo-4 est souhaitée]. Effectuer l&#39;étiquetage Fluo-4 comme décrit dans les étapes 2.3-2.4. </li><li> Utilisation du microscope à dissection (d&#39;intensité lumineuse: 1,6 x 10 8 / mm 2 photons ⋅sec), retirer la cornée en coupant la face du globe oculaire. Retirez l&#39;objectif et vitré de la surface de la rétine interne avec une pince. Pour retirer le corps vitré, stabiliser le globe oculaire en maintenant la sclérotique fermement avec une pince. Retire la base du vitré vers le centre de la rétine de l&#39;autre pince. La préparation à ce stade est appelé l&#39;œilleton, qui est utilisé pour cryosections. Plus de détails sur cryosections peuvent être trouvés dans les références 14,15. </li><li> Retirer la rétine de l&#39;œilleton. Ensuite, faire quatre coupes pour permettre la rétine à plat. Monter doucement la rétine sur une lame de microscope avec le photorécepteur couche vers le haut. Ajouter une goutte de solution de la rétine et mettre CEpapier filtre llulose sur la rétine. Une fois la rétine attache au papier filtre, placer la rétine remise en solution. Si nécessaire, aplatir la rétine avec un pinceau ou une pince. </li><li> Placez les rétines wholemounted dans 4% PFA pendant 10-15 min pour la fixation. </li><li> Laver les rétines wholemounted trois fois pendant 30 minutes dans 0,1 M de tampon phosphate (PB), pH 7,4. Bloquer les rétines avec 5% de sérum normal de chèvre ou de sérum d&#39;âne à 0,1 PB contenant 0,3% de Triton X-100 et 0,1% de NaN 3 à 4 ° C pendant une nuit. Nous recommandons un volume final de 500 pl pour toutes les étapes d&#39;économiser de blocage des solutions et des anticorps. </li><li> Le lendemain, incuber les échantillons entiers de la rétine avec les principaux anticorps 5-7 jours à 4 ° C. Des dilutions optimales doivent être déterminées par l&#39;utilisateur. </li><li> Laver les rétines 3 x 30 min dans 0,1 M de PB et incuber pendant une nuit à 4 ° C dans l&#39;anticorps secondaire conjugué à un fluorophore correspondant qui est dirigé contre l&#39;espèce de l&#39;anticorps primaire (concentration de 1: 1000). </li><li> Après trois derniers lavages de 30 minutes chacun avec PB, monter les rétines dans un milieu de montage. Sceller les lamelles avec du vernis à ongles pour un stockage prolongé. Conserver les échantillons à 4 ° C et protéger de la lumière. </li></ol> 2. marquage des cellules ganglionnaires et des axones à Rat Wholemount rétines avec un colorant indicateur de calcium <ol><li> Préparer 1000 ml de Ringer de mammifère contenant (en mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 de CaCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2, NaHCO 3 25, glucose 10 et barboter avec 95% O 2/5% CO &#173; 2. </li><li> Effectuer la dissection comme décrit dans les étapes 1.2-1.4. </li><li> Pour charger les cellules rétiniennes ganglionnaires (CGR) et leurs axones avec un colorant indicateur de calcium, injecter 0,5 pi de Fluo-4 sel de pentapotassium (40 mM d&#39;achat d&#39;actions en H 2 O) dans le nerf souche optique d&#39;environ 1 mm en arrière du globe oculaire à l&#39;aide d&#39;une seringue . Pour mesurer dynamique augmente dans la cellule de ganglion [Ca 2 + </sup&gt;] i un indicateur avec une forte affinité, tels que Fluo-4 avec sa valeur de Kd de 345 nM, est optimal. Fluo-4 offre l&#39;avantage supplémentaire d&#39;avoir une efficacité quantique très élevée résultant en une augmentation d&#39;émission de&gt; 100 fois lorsqu&#39;il est lié au calcium. </li><li> Placez l&#39;œilleton dans barboter avec 95% de O 2/5% de CO mammifères Ringer &#173; 2 pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li></ol> Protocole d&#39;imagerie 3 de calcium pour les cellules ganglionnaires de la rétine et des axones. <ol><li> Retirer l&#39;œil, le cristallin et vitreux comme décrit dans les étapes 1.1 à 1.4. Isoler la rétine de l&#39;œilleton et la diviser en quadrants. Mont côté des cellules ganglionnaires d&#39;un quadrant sur une lame de verre et d&#39;utiliser une grille harpe de tranche pour le stabiliser. Gardez les autres morceaux adaptés à l&#39;obscurité dans barboter avec 95% de O 2/5% de CO mammifères Ringer &#173; 2 sur de la glace pour une utilisation ultérieure. </li><li> Superfuse la chambre d&#39;enregistrement avec la solution de Ringer et mammifèresmaintenir la solution en continu avec barbotage de 95% O 2/5% CO 2. </li><li> L&#39;image du tissu sous le microscope. Faire des expériences à température ambiante (~ 23 ° C) ou à atteindre des températures physiologiques en chauffant la phase, le chauffage du bain d&#39;eau sous le spécimen ou l&#39;application d&#39;air chaud à la surface de l&#39;échantillon. Remarque: Il est important de noter que de nombreuses fonctions cellulaires sont réglementés par la température, qui joue un rôle clé dans le maintien de l&#39;homéostasie intracellulaire 16. Cependant, l&#39;introduction de mesures de réchauffement peut augmenter le taux de photoblanchiment, l&#39;évaporation de la dérive de la moyenne et de concentration causée par la dilatation thermique 17. L&#39;utilisation de la température ambiante diminue intracellulaire cloisonnement de Fluo-4, 18. </li><li> Effectuer un contrôle de deux impulsions à haute K + appariés en l&#39;absence de médicaments. Dépolariser CGR et RGC axones en augmentant la [K +] o de 3 à 60 mm pour 33 sec pendant chaque impulsion pour activerVGCCs avec un système de surfusion entraînée par gravité huit canaux. Réduire Na + par 57 mM de maintenir isosmolarity dans la solution élevée de K +. </li><li> Évaluer la contribution des différents VGCCs au signal de calcium avec l&#39;utilisation des inhibiteurs généraux ou spécifiques canaux Ca. Par exemple, la réduction du signal de calcium après l&#39;administration d&#39;un bloqueur du canal calcique non-spécifique, de cobalt, à condition d&#39;une mesure semi-quantitative de la contribution des VGCCs au K + élevé du signal de calcium -evoked. </li><li> Acquérir des valeurs d&#39;intensité de fluorescence en plaçant une région d&#39;intérêt (ROI) dans les CGR d&#39;intérêt (Figure 2). </li><li> Normaliser la variation de l&#39;intensité de fluorescence produite par le second pic élevé de K + à la variation produite par le premier pic élevé de K +. Puis, pour tester des inhibiteurs spécifiques des canaux calciques, les médicaments uniquement appliquer pendant la seconde impulsion haute K + et une paire de normaliser cette pointe contrela première valeur de crête. Pour mesurer l&#39;effet du médicament sur ​​le pic élevé de K +, de diviser l&#39;amplitude du second pic K + par celle de la première. L&#39;analyse doit être effectuée sur ces valeurs par rapport à leurs témoins correspondants dérivés de K + haute pics appariés mesurée en l&#39;absence de médicament. </li><li> Acquérir des images à intervalles de 5 secondes. Pour éviter photo-blanchiment, garder l&#39;excitation laser aussi bas que possible. Fournir une excitation par la ligne 488 nm du laser à argon, tandis que le tube photomultiplicateur collecte l&#39;émission de fluorescence au moyen d&#39;un filtre LP 505 nm. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucune divulgation.

Dans cet article, nous avons décrit deux techniques différentes: 1) L&#39;immunohistochimie pour afficher Fluo-4 localisation des cellules ganglionnaires de la rétine dans des échantillons entiers, et 2) l&#39;imagerie de calcium pour analyser la dynamique de calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones. L&#39;immunohistochimie en utilisant des échantillons entiers a été utilisé pour révéler la localisation des protéines dans la rétine 20-23</sup...

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) expriment L, N, P / Q et T de type CCAGV tel que déterminé par le blocage pharmacologique de ces composants de la cellule entière canal Ca courant 1,2. CCAGV sont des protéines transmembranaires multimères qui sont impliqués dans la libération du transmetteur, la transcription des gènes, régulation cellulaire et la plasticité synaptique 3,4,5. VGCCs fonctionnels sont constitués d&#39;au moins trois catégories distinctes de sous-unités: grandes, une α transmembranaires formant des pores sous-unités qui établissent des propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal, principalement extracellulaire auxiliaire α 2 δ de sous-unités et sous-unités β intracellulaires. Les deux derniers complexes sous forme de hétéromères avec différentes sous-unités α 1 et modifier la cinétique de déclenchement et le trafic des canaux à la membrane plasmique 6. Au cours des dernières décennies, de nombreuses techniques ont été utilisées pour étudier la protéine expression, comme l&#39;immunohistochimie, dosage immuno-enzymatique, une analyse Western et la cytométrie en flux. Ces techniques nécessitent l&#39;utilisation d&#39;anticorps spécifiques pour la détection d&#39;une protéine d&#39;intérêt donnée et fournissent des outils puissants pour la localisation et la distribution des protéines spécifiques dans différents tissus. Les techniques utilisées pour détecter et quantifier des taux d&#39;une protéine particulière d&#39;expression d&#39;ARNm telles que l&#39;analyse par transfert de Northern, RT-PCR en temps réel quantitative RT-PCR, l&#39;hybridation in situ, des puces à ADNc et essai de protection de ribonucléase offrent une approche alternative lorsque les anticorps ne sont pas facilement disponibles ou si les niveaux d&#39;une protéine particulière d&#39;expression est faible 7. Toutefois, une limitation de l&#39;utilisation de ces techniques moléculaires est l&#39;identification spécifique d&#39;une séquence de gène. Pour localiser les protéines de la rétine, l&#39;immunohistochimie peut être effectuée sur les rétines wholemount. En raison de l&#39;accessibilité des CGR, le wholemountpréparation fournit une excellente plateforme pour étudier la localisation des protéines spécifiques à la soma RGC et leurs axones. En plus de leur localisation, des propriétés fonctionnelles des CGR dans VGCCs peuvent être démontrées par l&#39;utilisation de techniques d&#39;imagerie de calcium. Nous décrivons un protocole d&#39;imagerie du calcium pour marquer sélectivement CGR avec un colorant indicateur du calcium à mesurer la dynamique du calcium intracellulaire. La contribution des différents VGCCs au signal de calcium dans différents compartiments cellulaires peut être isolé à l&#39;aide de bloqueurs des canaux Ca-spécifique de sous-typage. Peut-être l&#39;un des aspects les plus bénéfiques de la technique d&#39;imagerie de calcium décrite ici est la possibilité d&#39;enregistrer en même temps et indépendamment l&#39;un de plusieurs CGR et de leurs axones. Bien que de nombreuses techniques physiologiques, telles que l&#39;enregistrement de l&#39;ensemble de serrage de plaque de cellule, de fournir des enregistrements de haute résolution temporelle des courants membranaires, l&#39;origine somatique ou axonale des thescourants électroniques enregistrées ne peuvent pas être victimes de discrimination et les enregistrements ne peuvent être faites à partir d&#39;un seul neurone à la fois. matrices électrodes multiples (AME) sont capables d&#39;enregistrer en même temps des pointes de nombreuses cellules, mais ne peuvent ni détecter ni discrimination de l&#39;activation, par exemple, les différents sous-types de canaux calciques. Meas préférentiellement enregistrer à partir de cellules qui sont situées à proximité immédiate de l&#39;électrode 8 et enregistrement donné à partir de cellules qui produisent des grandes pointes 9. Méthodes d&#39;imagerie optique fournissent une stratégie alternative pour permettre aux enregistrements simultanés et indépendants des populations entières de cellules qui peuvent être intégrés avec les informations obtenues à partir de micro-électrodes d&#39;une cellule unique et le patch enregistrement de serrage et l&#39;enregistrement de la MEA. Bien que les techniques d&#39;imagerie de calcium décrits ici ont été utilisées pour étudier la dynamique de calcium de CGR, patch clamp et AME peuvent aussi être utilisés en parallèle pour élucider les courants ioniques et les propriétés de dopage de CGR. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Comme les cellules amacrines déplacées représentent environ 60% de la population neuronale dans la couche des cellules ganglionnaires dans la rétine de souris 10, notre objectif était d&#39;utiliser une technique de chargement qui marque sélectivement CGR avec un colorant indicateur de calcium synthétique dans un préparation wholemount. Bien synthétiques colorants indicateurs de calcium fournissent une excellente plate-forme pour l&#39;étude de la dynamique de calcium intracellulaire, son utilisation généralisée a été entravée par l&#39;impossibilité de charger efficacement les populations spécifiques de neurones dans un réseau donné. Beaucoup de techniques telles que le chargement en vrac 11 et l&#39;électroporation 8,12 ont été réalisées pour charger des populations entières de cellules, cependant, ces techniques ne sont pas discriminatoires entre les différents types de cellules spécifiques. Génétiquement codés indicateurs de calcium offrent la possibilité de marquer sélectivement les populations spécifiques de cellules, cependant, de tels procédés exigent la production d&#39;animaux transgéniques 13. Notre technique décrit une méthod étiqueter sélectivement CGR dans la préparation wholemount par fibre injection nerf de la souche d&#39;un colorant indicateur de calcium. Pris ensemble, les techniques structurelles et physiologiques décrites dans cet article fournissent une plate-forme pour étudier la localisation et la contribution des VGCCs au signal de calcium dans les CGR et leurs axones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">14124-G</td>
			<td style="width:229px;">dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Straight Forceps</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501985</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">curved iris scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td>504487</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellulose filter paper</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HABP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hibernate A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=A1247501">A12475-01</a></td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1000&#160;</td>
			<td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp;rct=j&amp;q=&amp;esrc=s&amp;source=web&amp;cd=1&amp;cad=rja&amp;sqi=2&amp;ved=0CC0QFjAA&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;bvm=bv.48705608,d.cGE">Mounting Media for Fluorescence</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4 pentapotassium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-178-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:112px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RBPMS</td>
			<td style="width:112px;">ProSci, Poway, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>A rabbit polyclonal antibody&#160;was generated against the N-terminus of the RBPMS&#160;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina

Dans cet article, nous décrivons les outils, les réactifs et les mesures concrètes qui sont nécessaires pour: 1) la préparation réussie de rétines wholemount pour l&#39;immunohistochimie et, 2) l&#39;imagerie calcique pour l&#39;étude de la tension fermée canal de calcium (CCAGV) signalisation médiée de calcium dans la rétine cellules ganglionnaires. Procédé de formation d&#39;image de calcium, nous décrivons des questions relatives au chargement contourne non spécifique de cellules amacrines déplacées dans la couche des cellules ganglionnaires.

Immunomarquage avec des anticorps spécifiques fournit une plate-forme pour étudier la localisation des protéines d&#39;intérêt particulier dans la rétine et la technique d&#39;imagerie de calcium permet l&#39;étude de la contribution des VGCCs à la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones. En utilisant un anticorps dirigé contre les RBPMS de protéines des cellules ganglionnaires (protéine de liaison de l&#39;ARN avec le raccordement mu...

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Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

protocoles d&#39;immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d&#39;une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d&#39;imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

Immunohistochimie et calcium méthodes d&#39;imagerie dans Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.4K vues.  University of California, Los Angeles.  protocoles d'immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d'une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones. 

Vidéo: Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Imagerie fonctionnelle en calcium développement des réseaux corticaux

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Recherche

Neurosciences

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Immunohistochimie Wholemount de la topographie du cerveau révélatrice complexe

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

Calcium péricyte cérébral et imagerie hémodynamique chez des souris transgéniques in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Imagerie calcique à deux photons et à grand champ dans le colliculus supérieur

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Pleins feux sur l’auteur : Dévoilement du codage neuronal et des mécanismes de traitement visuel dans le colliculus supérieur 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...