RVS est pris en charge par l&#39;enquêteur nouvelle fonds de démarrage d&#39;Albert Einstein College of Medicine de l&#39;Université Yeshiva.

1. Perfusion des animaux et de dissection Cervelet <ol><li> Fonction de la protéine, la perfusion peut être essentiel pour 1,2 coloration réussie. Perfusion transcardiaque est un invasive, non-survie procédure qui exige l&#39;utilisation appropriée d&#39;anesthésiques. Une formation correcte, l&#39;approbation institutionnelle, et l&#39;approbation du IACUC sont toutes nécessaires avant de tenter la procédure. Il ya toujours une bonne idée de consulter des vétérinaires de l&#39;institution à obtenir de l&#39;aide dans l&#39;identification des exigences expérimentales et d&#39;acquérir la formation appropriée. Avant la procédure, l&#39;animal devrait être profondément anesthésiés et ne répond pas à des stimuli tels que la fièvre ou pincement de la queue. L&#39;aide de ciseaux faire une coupe dans la peau de l&#39;abdomen et la paroi musculaire, puis continuer à ouvrir la cage thoracique en coupant juste à côté du sternum de chaque côté. En outre, l&#39;expérimentateur peut créer un plus grand espace de travail interne en coupant le fascia entourant le diaphragme. En soulevant la paroi abdominale et thoracique SuperIOrly, le cœur va maintenant être exposée. Faire une petite incision dans l&#39;oreillette droite pour permettre au sang de s&#39;écouler et immédiatement insérer l&#39;aiguille de perfusion dans le ventricule gauche. Une pompe hydrostatique de base est préférable de fournir les solutions de perfusion (voir le tableau 1 pour plus de détails). Premièrement, rincer le sang avec une solution saline tamponnée de phosphate 0,1 M (PBS, voir tableau 3) jusqu&#39;à ce que le liquide soit claire. Ensuite, éteignez la pompe hydrostatique, passer rapidement le tube de distribution de solution à un conteneur de paraformaldéhyde 4% (PFA, voir tableau 3) dilué dans du PBS, puis tourner la pompe de retour sur de livrer le fixateur. L&#39;utilisation d&#39;une pompe n&#39;est pas nécessaire: la pratique, deux seringues rempli du PBS et 4% en PFA peut être utilisé pour fournir les solutions lentement. </li><li> Il est essentiel de bien disséquer le cerveau du crâne sans introduire de lésions aux tissus. Même petites lacérations au cerveau lors de la dissection va progressivement s&#39;étendre dans les crevasses visibles queanticorps de piégeage et de provoquer une coloration artéfactuelle au cours du traitement du tissu (par exemple des astérisques rouges dans la figure 2). Pour les dissections cérébelleux, il est typique de couper la peau vers le bas au milieu de la tête et puis doucement taquiner les volets à part pour exposer le crâne. Couper le crâne d&#39;avant en arrière le long de la ligne médiane dorsale, et également latéralement le long des deux côtés du crâne. Ne pas couper au-delà du bregma que cela risque d&#39;entailler le cervelet. En utilisant des pinces soulevez doucement le front du crâne loin du cerveau en faisant attention de ne pas arracher les tissus du cerveau qui est attaché aux méninges. Sever les nerfs crâniens sur la face ventrale du cerveau. </li><li> Séparation du cervelet du reste du cerveau est importante pour deux raisons. Premièrement, elle permet l&#39;exploration des profils d&#39;expression dans les lobules antérieurs, qui sont cachés à la vue par le colliculi in situ. La seconde est que la séparation du tissu en plus petites, les régions isolées permet de mla fixation du minerai complète, ce qui peut faciliter la coloration de certaines protéines. Tout au long de cette étape de dissection finale, il faut prendre soin de ne pas toucher le cervelet avec les conseils de la pince. Insérez les pointes d&#39;une paire de pince dans le milieu des colliculi supérieures et inférieures. Avec une deuxième série de pince lentement taquiner l&#39;écart de la colliculi inférieure du cervelet. Ensuite, jeter le cervelet de sorte que sa face antérieure est tournée vers le bas et le tronc cérébral est pointée vers le haut. Insérez la pince dans le quatrième ventricule entre le tronc cérébral et les lobules IX / X du cervelet. Couper les pédoncules en pinçant avec les pinces sur les deux côtés, puis soulevez doucement le cervelet loin du tronc cérébral. Une fois que le cervelet est isolé, il post-fixer par immersion dans 4% PFA à 4 ° C pendant un minimum de 24-48 heures. Le cervelet peut être stocké dans 4% PFA pour une période de temps prolongée. Les méninges doivent être enlevés avant ou après coloration pour une meilleure visibilité des profils d&#39;expression.Si l&#39;expérimentateur choisit d&#39;enlever les méninges avant la coloration il ya une forte possibilité que le cervelet sera entaillé au cours du processus. Éplucher les méninges à la fin de la procédure de coloration est beaucoup plus simple, car ils deviennent plus faciles à localiser après leur acquisition coloration de fond faible et devenir fragile post-traitement. </li></ol> 2. Traitement de la coloration de tissus pour Wholemount Parce que l&#39;approche coloration wholemount dure plus longtemps que la coloration immunohistochimique de coupes de tissus, il est utile de planifier le calendrier de chacune des expériences comme indiqué dans le calendrier par exemple fourni (tableau 2). Avant de commencer, il ya plusieurs choses importantes à garder à l&#39;esprit. 1) Les microtubes contenant le tissu doit être tourné sur un nutator en tout temps, sauf pendant le processus de gel / dégel. 2) Plusieurs solutions doivent être frais pour chaque expérience (voir le tableau 3 pour les recettes en solution). 3)Tout au long du protocole, lors du changement de solutions, verser doucement la solution passe plutôt que de supprimer le cervelet avec une pince, pour éviter de toucher le cervelet. Puis, après mélange de la nouvelle solution dans un autre récipient, utiliser une pipette à ajouter lentement la solution fraîche au tube. 2.1 Jour 1: <ol class="lalpha"><li> Fixer le cervelet en 3 fix Dent à température ambiante pendant 6-8 heures à bascule doucement sur ​​le nutator. Si le méthanol est destructrice pour votre antigène, envisager de remplacer les étapes 2.1a 2.3a travers d&#39;une méthode de récupération de l&#39;antigène. La chaleur et les tampons utilisés pour l&#39;extraction d&#39;antigène aidera à préparer le tissu à la pénétration d&#39;anticorps. </li><li> Bleach le cervelet dans Bleach Dent 3 de la nuit à 4 ° C. </li></ol> 2.2 Jour 2: <ol class="lalpha"><li> Déshydrater le cervelet en deux tours de 100% MeOH à température ambiante pendant 30 min chacun. </li><li> Puis, pour améliorer la pénétration des solutions, sous réservele tissu à une série de cycles gel / dégel. Placez délicatement le tube dans un récipient avec de la glace sèche et le gel pendant 30 min. Ensuite, retirer le tube et le laisser à température ambiante sur le banc pour 15 minutes. L&#39;étape de congélation / décongélation doit être effectuée quatre fois (au moins). </li><li> Après le dernier dégel du tissu, placer le tube dans un congélateur à -80 ° C pendant la nuit. </li><li> Le tissu peut être stocké pendant de longues périodes de temps à -80 ° C, soit immédiatement avant ou après les étapes de congélation / décongélation. Sinon, le protocole doit être poursuivi. </li></ol> 2.3 Jour 3: <ol class="lalpha"><li> Réhydrater le cervelet en le lavant dans 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS, et 100% pour les 60-90 minutes à température ambiante PBS. </li><li> Ensuite, pour les adultes de la souris cervelets, sous réserve du tissu à une digestion enzymatique avec la protéinase K 10μg/ml dans du PBS pendant 2-3 minutes. Aucune étape de digestion est nécessaire pour cervelets d&#39;animaux jeunes (P5 ou moins chez la souris). Plus digestion est proposé pour un plus gros cerveau. Par exemple, la digestion peut être aussi élevé que 5-6 minutes pour les cerveaux de primates 4. </li><li> Après digestion, les laver immédiatement du cervelet dans la PBS trois fois pendant 10 minutes à température ambiante pour enlever la protéinase K. </li><li> Bloquer le tissu en PMT (voir tableau 3) une nuit à 4 ° C. Lait en poudre est souvent le premier choix lors de la sélection d&#39;un agent bloquant pour le travail de protéines, car elle est peu coûteuse, permet de réduire efficacement la coloration de fond, et n&#39;est généralement pas interférer avec fixation de l&#39;anticorps ou l&#39;accès à l&#39;antigène. Sérums animaux peuvent également être utilisés, bien que l&#39;expérimentateur doit être conscient du coût ajouté et doit d&#39;abord tester la qualité de sérum pour une réactivité croisée immunoglobulines et sa capacité à produire un signal optimal par rapport au bruit. </li></ol> 2.4 Jour 4-5: <ol class="lalpha"><li> Incuber le tissu dans les anticorps primaires dilués dans PMT complétées avec du DMSO 5% pendant 48 heures à 4 ° C (larger cervelets nécessitera une augmentation des temps d&#39;incubation). </li></ol> 2.5 Jour 6: <ol class="lalpha"><li> Laver le cervelet 2-3 fois pendant 2-3 heures chacune dans les PMT à 4 ° C pour éliminer les anticorps non liés primaires. </li><li> Puis, incuber le tissu des anticorps secondaires dans une solution contenant PMT avec 5% de DMSO à 4 ° C pendant la nuit (plus cervelets peuvent nécessiter une augmentation des temps d&#39;incubation). </li></ol> 2.6 Jour 7: <ol class="lalpha"><li> Laver le cervelet 2-3 fois pendant 2-3 heures chacune dans les PMT à 4 ° C. </li><li> Donnez le tissu un lavage final avec PBT (voir tableau 3) pendant 1-2 heures. Cette étape supprime excès de lait et améliore la clarté de la coloration. </li><li> Enfin, incuber le tissu en DAB (3,3 &#39;-diaminobenzidine) solution jusqu&#39;à ce que l&#39;intensité de la coloration optimale est atteinte. Le produit de réaction marron doit être clairement visible dans les ~ 10 minutes. Il est préférable d&#39;utiliser DAB dans l&#39;obscurité que la lumière provoque la précipitation d&#39;chromogènete, ce qui peut augmenter la coloration de fond. </li></ol> 2.7 Lorsque l&#39;intensité de coloration optimale est atteinte, arrêter la réaction en plaçant le cervelet dans du PBS avec de l&#39;azoture de sodium 0,04%. Le tissu peut être stocké à long terme dans cette solution. L&#39;azoture de sodium est un inhibiteur puissant de la croissance bactérienne, mais devrait être évitée jusqu&#39;à ce que cette étape car elle inhibe également la peroxydase de raifort. 2.8 procédure d&#39;amplification en option: suivre le protocole normal, mais ces étapes doivent être effectuées en place de mesures 2.5b-2.7 ci-dessus. <ol class="lalpha"><li> Incuber le tissu une nuit à 4 ° C en biotine-anticorps secondaires conjugués à PBST (voir tableau 3) avec 5% de DMSO. </li><li> Rincer le tissu pendant 2-3 heures chacune dans les changements de 3-4 PBST à température ambiante. </li><li> Incuber le cervelet une nuit à 4 ° C dans ABC solution complexe dans le PBST. </li><li> Rincer le tissu pendant 2-3 heures chacun àtempérature ambiante dans les changements de 3-4 PBS. </li><li> Incuber le tissu dans une solution de DAB fraîchement préparés, comme décrit ci-dessus. </li><li> Lorsque la coloration est optimale, arrêter la réaction par un lavage du cervelet dans du PBS avec l&#39;azoture de sodium 0,04%. </li></ol> 3. Imagerie du tissu coloré <ol><li> Images Wholemount peut être capturé par l&#39;aide, par exemple, un Leica DFC3000 FX caméra montée sur un stéréomicroscope Leica MZ16 FA en cours d&#39;exécution Leica Application Suite FX logiciel. Si vous le souhaitez, la microscopie déconvolution peut être utilisé pour acquérir plusieurs images consécutives dans les différents plans focaux, avec chaque image ayant seulement un lobule unique mise au point nette. Puis, les images peuvent être compressées en une seule pile et les logiciels rendus à éliminer les distorsions. L&#39;image finale composite illustrent les profils d&#39;expression de surface du cervelet avec tous les motifs visibles dans orientation claire. </li><li> Tissu coloré Wholemount devrait être imagée tout en étant immergé dans du PBS (ou tout autre support qui donnera uneindice de réfraction optimale). Afin de positionner facilement l&#39;wholemount pour l&#39;imagerie, faire un gel d&#39;agar à 1% dans un plat de Petri en plastique. Coupez de petits trous dans le gel. Les trous permettra le cervelet pour être coincée dans l&#39;orientation désirée. </li><li> Les données brutes sont importées dans Adobe Photoshop CS4 et ajusté pour les niveaux de contraste et la luminosité. </li></ol> Animaux Toutes les études animales ont été effectuées en vertu d&#39;un protocole sur les animaux IACUC approuvé conformément aux directives institutionnelles à l&#39;Albert Einstein College of Medicine. Mâle et femelle consanguine suisse Webster (Taconic, Albany, NY) chez la souris ont été maintenues dans notre colonie et utilisé pour toutes les études. Rats adultes euthanasiés ont été aimablement fournies par le Dr Bryen Jordanie (Albert Einstein College of Medicine). Tous les animaux étaient au moins un mois. 4. Les résultats représentatifs Le cervelet est compartimenté par l&#39;expression moléculaire dans quatre zones transversales:la zone antérieure (A à Z: ~ lobules IV), la zone centrale (CZ: ~ lobules VI-VII), la zone postérieure (PZ: ~ lobules VIII-IX dorsale) et la zone nodulaire (NZ: ~ lobules IX et X ventrale ) 5. Chaque zone contient un ensemble unique de parasagittale rayures 1,2,5,6 (Fig. 1). Expression dans les cellules de Purkinje ZebrinII révèle rayures dans le AZ et PZ (Fig. 2) et d&#39;expression uniforme dans la CZ et néo-zélandais (Fig. 2). L&#39;organisation parasagittale des cellules de Purkinje est reflété par la topographie champ terminal de fibres afférentes. Transcription de la cocaïne et les amphétamines-régulée (CART) peptide est exprimé en sous-ensembles de fibres grimpantes (Fig. 3a) que le projet de rayures de dendrites des cellules de Purkinje dans la couche moléculaire du cervelet cortex 7 (Fig. 3b). Avec les modifications appropriées, telles que l&#39;amplification 7, le protocole permet wholemount pour la visualisation de modèles olivocerebellar sans le necD pour une laborieuses, le temps des reconstructions de la consommation des coupes de tissus de coloration (Fig. 3b). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig1.jpg" /> Figure 1. A. ZebrinII / aldolaseC expression révèle des bandes sagittales dans les sections transversales du cervelet. Échelle = 500 um. B. ZebrinII / aldolaseC est exclusivement exprimée dans soma des cellules de Purkinje et les dendrites. Échelle bar = 150μm (gl = couche granulaire; pcl = couche de cellules de Purkinje; ml = couche moléculaire). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig2.jpg" /> Figure 2. Un cervelet wholemount colorées pour ZebrinII / aldolaseC montrant des bandes des cellules de Purkinje dans les images de la partie antérieure (AZ), centrale (CZ) et postérieures (PZ) zones du cervelet. Ici, nous montrons également un exemple de la conséquence négative de entailler le cervelet. La coloration résulte un artefact est indiquéavec des astérisques rouges. La barre d&#39;échelle = 1 mm (LS = simplex lobulus; PML = paramédiane lobule; COP = copule pyramidis). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig3.jpg" /> Figure 3. CART A. est exprimée en escalade terminaux de fibres dans la couche moléculaire. Échelle = 100 um. (Ml = couche moléculaire; pcl = couche de cellules de Purkinje; gl = couche granulaire) B. Wholemount immunohistochimie de l&#39;expression CART dans le néo-zélandais. La barre d&#39;échelle = 2 mm (COP = copule pyramidis; PML paramédian = lobule; PFL = paraflocculus; FL = flocculus).

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Nous avons décrit les détails techniques nécessaires pour la coloration wholemount succès en utilisant une approche polyvalente immunohistochimique pour l&#39;expression des protéines dans le cerveau révélateur en développement et les adultes. En utilisant cette approche, des motifs complexes moléculaires d&#39;expression peut être analysée et la topographie du cerveau apprécié sans la nécessité de laborieuses et consommatrices de temps les procédures de sectionnement des tissus. <p class="jove_conte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Matériels </td><td> Fonction dans le protocole </td></tr><tr><td> Pompe à perfusion (Fisher Scientific/13-876-2) </td><td> Permet de perfusion constante et lente. </td></tr><tr><td> Sharp-tip Ciseaux (FST/14081-08) </td><td> Utilisation générale de la perfusion et la dissection. </td></tr><tr><td> Blunt-tip forceps (FST/91100-12) </td><td> Pour stabiliser le coeur pour l&#39;insertion de l&#39;aiguille de perfusion. </td></tr><tr><td> Pince (FST par Dumont AA/11210-10) </td><td> Pour utilisation lors de la dissection du cerveau du crâne et de séparer du cervelet du reste du cerveau. Ces éléments sont essentiels parce qu&#39;ils ont une extrémité légèrement arrondie qui permet de minimiser les dommages au cervelet lors de la dissection. </td></tr><tr><td> Nutator (Fisher Scientific) </td><td> Utilisé pour conserver des tissus en mouvement pendant les périodes d&#39;incubation. </td></tr><tr><td> Tube de 1,5 ml (Sarstedt / Vis Micro Tube) </td><td> Toutes les étapes du sontochemistry protocole ont lieu dans ces microtubes. Le fond arrondi assure que le cervelet reste en mouvement. </td></tr><tr><td> Cuillère perforée (FST/10370-17) </td><td> Utilisé pour conserver des échantillons entiers dans les microtubes tout en douceur décantation la solution passé. </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscope </td><td> Utilisé pour examiner la coloration wholemount. </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX caméra </td><td> Utilisé pour capturer des images wholemount. </td></tr></tbody></table> Tableau 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="9"> Calendrier Exemple pour une expérience typique wholemount </td></tr><tr><td> Jour 1 </td><td colspan="4"> Dent de correctifs, la température ambiante, 8 heures </td><td colspan="4"> Dent eau de Javel, 4 ° C, durant la nuit </td></tr><tr><td> Jour 2 </td><td colspan="3"> 100%, MeOH température ambiante, 2x, 30 minutes chacun </td><td colspan="3"> 100% de MeOH, au gel / dégel, 4x, 30 min/15 min </td><td colspa<html> n = &quot;2&quot;&gt; 100% MeOH, -80 ° C, pendant une nuit </td></tr><tr><td> Jour 3 </td><td> 50% MeOH/50% PBS, la température ambiante, 60-90 min </td><td colspan="2"> 15% MeOH / 85% de PBS, la température ambiante, 60-90 min </td><td colspan="2"> 100%, PBS température ambiante, 60-90 min </td><td> 10μg/mL protéinase K dans du PBS, la température ambiante, 2-3 min </td><td> 100%, PBS température ambiante, 3x, 10 min à chaque fois </td><td> PMT, 4 ° C, durant la nuit </td></tr><tr><td> Jour 4-5 </td><td colspan="8"> PMT + 1 ° d&#39;anticorps + 5% DMSO, 4 ° C, 48 h </td></tr><tr><td> Jour 6 </td><td colspan="3"> PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 heures chaque </td><td colspan="5"> PMT + 2 ° anticorps + 5% de DMSO, 4 ° C, 24 heures (ou commencer étapes d&#39;amplification avec ABC complexe) </td></tr><tr><td> Jour 7 </td><td colspan="2"> PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 heures chaque </td><td colspan="3"> PBT, la température ambiante, 2 heures </td><td colspan="3"> Incuber en DAB frais dans du PBS jusqu&#39;à coloration optimale est visualisée </td></tr></tbody></table>_content &quot;&gt; Tableau 2. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Recettes (* = préparer une nouvelle à chaque fois) </td></tr><tr><td> PBS (tampon phosphate salin) </td><td> 0,1 M de tampon phosphate salin dans de l&#39;eau désionisée. pH 7,2 (Sigma comprimés; P4417) </td></tr><tr><td> PFA (paraformaldéhyde) </td><td> Fabriqué et congelés stockés comme une solution à 20%, puis on dilue à 4% dans du PBS pour la solution de travail (Fisher Scientific, T353) </td></tr><tr><td> Fixation de Dent 3 * </td><td> 4 parties de méthanol 1 diméthylsulfoxyde partie (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) </td></tr><tr><td> Dent Bleach 3 * </td><td> 4 parties de méthanol 1 diméthylsulfoxyde partie (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 partie de peroxyde d&#39;hydrogène 30% </td></tr><tr><td> Digestion enzymatique </td><td> 10 pg / ml de protéinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) dans du PBS. </td></tr><tr><td> PBST </td><td> PBS contenant: 0,1% de Tween-20 (Fisher scientifique, BP337; Triton peut également être utilisé à la place de Tween-20 dans tous les cas). </td></tr><tr><td> PMT 25 * </td><td> PBS contenant: 2% de poudre écrémé lait écrémé (Carnation préféré) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) </td></tr><tr><td> PBT 25 * </td><td> PBS contenant: 0,2% de sérum albumine bovine (Sigma; B9001S) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) </td></tr><tr><td> DAB * </td><td> Dissoudre un comprimé de 10 mg de 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) dans 40 ml de PBS. Ajouter 10 ul de peroxyde d&#39;hydrogène à 30% pour initier la réaction). </td></tr><tr><td> ABC solution complexe </td><td> Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc; PK-4000) </td></tr></tbody></table> Tableau 3.

wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography

L&#39;architecture répétée et bien compris cellulaire du cervelet en font un système modèle idéal pour explorer la topographie du cerveau. Sous-tend son cytoarchitecture relativement uniforme est un ensemble complexe de domaines parasagittales de gène et l&#39;expression des protéines. Le cloisonnement moléculaire du cervelet est reflétée par l&#39;organisation anatomique et fonctionnelle des fibres afférentes. Pour apprécier pleinement la complexité de l&#39;organisation du cervelet que nous avons déjà une approche affinée coloration wholemount pour l&#39;analyse à haut débit de défauts de structuration dans le cervelet de souris. Ce protocole décrit en détail les réactifs, des outils, et des mesures pratiques qui sont utiles pour réussir à révéler des modèles d&#39;expression de protéines dans le cervelet de souris adulte en utilisant immunomarquage wholemount. Les étapes mis en évidence ici démontrer l&#39;utilité de cette méthode en utilisant l&#39;expression de zebrinII / aldolaseC comme un exemple de la façon dont la topographie fine de la cerveau peut être révélé dans sonnatif conformation tridimensionnelle. Sont également décrits des adaptations apportées au protocole qui permet la visualisation de l&#39;expression des protéines dans les projections afférentes et cervelets grande pour des études comparatives de la topographie moléculaire. Pour illustrer ces applications, les données de coloration afférente du cervelet de rat sont inclus.

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Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Les circuits neuronaux sont topographiquement organisée en compartiments fonctionnels avec des profils spécifiques moléculaires. Ici, nous fournissons les étapes pratiques et techniques pour révéler la topographie du cerveau planétaire grâce à une approche polyvalente wholemount coloration immunohistochimique. Nous démontrons l&#39;utilité de la méthode utilisant la cytoarchitecture bien compris et les circuits du cervelet.

Immunohistochimie Wholemount de la topographie du cerveau révélatrice complexe

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

wholemount-immunohistochemistry-for-revealing-complex-brain-topography

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K vues.  Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University. Les circuits neuronaux sont topographiquement organisée en compartiments fonctionnels avec des profils spécifiques moléculaires. Ici, nous fournissons les étapes pratiques et techniques pour révéler la topographie du cerveau planétaire grâce à une approche polyvalente wholemount coloration immunohistochimique. Nous démontrons l'utilité de la méthode utilisant la cytoarchitecture bien compris et les circuits du cervelet.

Vidéo: Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

La zone sous-ventriculaire Fr-face: Coloration Wholemount et Flow épendymaire

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Recherche

Neurosciences

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

Révéler la topographie des circuits neuronaux dans les multi-couleur

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Immunohistochimie et calcium méthodes d&#39;imagerie dans Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Spinal Cord Injury complète et cerveau Protocole Dissection pour Wholemount suite<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans des larves de la lamproie marine

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Préparation du Primat tissu cérébral non humain pour immunohistochimie pré-enrobage et microscopie électronique

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Implantation chronique d’ensemble-corticale Electrocorticographic tableau dans l’ouistiti commun

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Préparation de la souris Retinal Cryo-sections pour l'immunohistochimie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Évaluation de l'induction à long terme de dépression dans les tranches de cérévelateur adultes

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Combinaison de l’hybridation in situ par fluorescence multiplex avec l’immunohistochimie fluorescente sur des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées ou fixes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...