This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

1. Total Pigment Extraction de Epinards <ol><li> Homogénéiser une poignée de feuilles d&#39;épinards (~ 20 g) dans 100 ml de tampon de broyage à froid (voir tableau 1) en utilisant un mélangeur pendant 20 secondes. </li><li> Filtrer la solution à travers deux couches d&#39;un tissu en nylon avec un diamètre de pores de 20 um et centrifuger le filtrat à 1500 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Reprendre le culot contenant les chloroplastes avec un pinceau doux artistes dans 1 ml de tampon de lavage à froid (voir tableau 1). Une fois le culot est remis en suspension, ajouter 50 ml de tampon de lavage et centrifuger la solution à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le culot en douceur (thylakoïdes) dans 50 ml de tampon de lavage (voir Tableau 1). </li><li> Centrifuger la solution à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant complètement. À ce stade, effectuer les étapes suivantes dans l&#39;obscurité, pour éviter l&#39;oxydation des pigments. </li&gt; <li> Ajouter ~ 20 ml d&#39;acétone à 80% tamponné avec du Na 2 CO 3 (voir tableau 1) pour extraire les pigments. Laissez la solution sur de la glace pendant 10 min, vortex de temps en temps. </li><li> Pellet les composants cellulaires par centrifugation à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. NOTE: Si les pigments sont pas complètement extractibles, le culot aura une couleur verte et l&#39;étape 1.6 doit être répété. </li><li> Récupérer le surnageant dans une ampoule à décanter. Ajouter 0,4 volumes de diéthyléther, agiter vigoureusement et ouvrir le robinet pour évacuer le gaz. </li><li> Ajouter 0,8 volume de 0,33 M de NaCl et mélanger vigoureusement. Autoriser ~ 10 min pour les couches se séparer. La phase éther sur le dessus contient les pigments extraits. Retirer la phase inférieure claire. REMARQUE: Si la séparation n&#39;est pas claire, geler et dégeler la solution pour améliorer la séparation de phase. </li><li> Enlever l&#39;éther en le versant du haut de l&#39;entonnoir de séparation dans un récipient en verre approprié. Sec en ajoutant une cuillerée de grandu sulfate de sodium anhydre parti-. Agiter la solution et de permettre ~ 5 min pour le déshydratant pour absorber l&#39;eau de l&#39;éther. REMARQUE: Répétez cette étape si le sulfate de sodium apparaît complètement agglutinées; il devrait y avoir quelques cristaux flottants lorsque l&#39;éther est suffisamment séché. Si la formation d&#39;une couche d&#39;eau, retirer ce avec une pipette Pasteur supplémentaire avant l&#39;addition de sulfate de sodium anhydre. </li><li> Décanter l&#39;éther à un nouveau récipient en verre, en laissant le sulfate de sodium solide derrière. </li><li> Evaporer l&#39;éther dans un speedvac rotatif ou sous un courant de N2. </li><li> Dissoudre les pigments complètement dans 10 ml d&#39;acétone à 100%. </li><li> Diluer une petite quantité (~ 3 ul) dans 1 ml d&#39;acétone à 80% et à mesurer les spectres d&#39;absorption et de déterminer la chlorophylle a / b rapport de la concentration de Chl et avec la méthode décrite par Porra et al. (1989) 15. </li><li> Aliquote et sécher les pigments dans un speedvac rotatif ou sous N 2 jusqu&#39;à ce que le flux de l&#39;acétone estcomplètement évaporée. Conserver les pigments secs à -80 ° C. </li></ol> 2 Extraction des caroténoïdes de épinards <ol><li> Suivez les étapes 1.1 à 1.5. À ce stade, effectuer les étapes suivantes dans l&#39;obscurité, pour éviter l&#39;oxydation des pigments. </li><li> Reprendre le culot dans thylacoïdes ~ 50 ml d&#39;éthanol à 96% tamponné avec du Na 2 CO 3 (voir tableau 1) pour extraire les pigments. Laissez la solution sur de la glace pendant 5 min. </li><li> Pellet les composants cellulaires par centrifugation à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. NOTE: Si les pigments sont pas complètement extractibles, le culot aura une couleur verte et l&#39;étape 2.2 doit être répété. </li><li> Récupérer le surnageant et ajouter 0,1 volume de 80% de KOH (p / v) pour initier la saponification. </li><li> Laisser la solution à 4 ° CO / N, fermé hermétiquement et à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Recueillir la solution dans une ampoule à décanter. Ajouter 1 volume d&#39;éther diéthylique et mélanger doucement. </li><li> Ajouter 0,8 volumes de 0,33 M de NaCl et mélanger doucement. Autoriser ~ 10 min pour les couches se séparer. La phase éther d&#39;orange sur le dessus contient les caroténoïdes saponifiés. Retirer la phase inférieure vert par drainage à travers le robinet d&#39;arrêt de l&#39;entonnoir. </li><li> Ajouter 3 volumes d&#39;eau et mélanger doucement pour enlever l&#39;hydroxyde de potassium. Laisser les couches se séparer. REMARQUE: Si la phase supérieure est trouble, ajouter une petite quantité de NaCl (par exemple, 3 g de NaCl dans 200 ml de solution) et agiter doucement pour dissoudre. </li><li> Retirer la phase inférieure par égouttage à travers le robinet d&#39;arrêt de l&#39;entonnoir. </li><li> Suivez les étapes 1.10 à 1.13. </li><li> Diluer une petite quantité (~ 3 ul) dans 1 ml d&#39;acétone à 80% et à mesurer le spectre d&#39;absorption à 440 nm de 80% d&#39;acétone. Pour déterminer la concentration, utiliser l&#39;extinction de coefficient moyen pour les caroténoïdes (ε = 440 255) 16 dans la formule suivante: Voiture [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (trajet optique) = 1 cm. </li><li> Aliquote et sécher le carotenoids dans un speedvac ou sous courant de N2 jusqu&#39;à ce que tout le diéthyléther a été évaporé. Conserver les pigments secs à -80 ° C. </li></ol> 3. total Pigment et caroténoïdes Extraction de Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Cultivez C. reinhardtii sur milieu TAP solide 17 dans une boîte de Pétri en étalant une petite quantité de culture liquide sur la surface. Croître sous continu flux d&#39;illumination de 20 pmol de photos PSA m -2 s -1 jusqu&#39;à une couche verte de cellules est visible. </li><li> En utilisant une boucle d&#39;inoculation stérile, récolter une petite quantité de C reinhardtii à partir du milieu solide de TAP et de mettre les cellules dans 500 ml de milieu TAP 17 dans une fiole de 1 L. Cultiver la culture à 25 ° C avec 170 tours agitation sous un flux d&#39;illumination continue de 20 pmol de photos PSA m -2 s -1. </li><li> Après 5-6 jours, la culture doit atteindre la fin de la phase logarithmique (6 x 10 6 cellules / mlou 2-2,5 densité optique à 750 nm). Centrifuger la culture à 4000 g pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Pour l&#39;extraction totale en pigments, suivez les étapes 1.6 à 1.15. </li><li> Le rendement de l&#39;extrait total de pigment à partir de 500 ml de culture de pleine croissance de C. reinhardtii est d&#39;environ 5 ml de solution à une concentration de 0,5 mg chl a + b / ml. </li><li> Pour l&#39;extraction des caroténoïdes, suivez les étapes 2.2 à 2.12. </li></ol> 4. Purification de corps d&#39;inclusion <ol><li> Clonage de la séquence codante de la protéine d&#39;intérêt LHC dans un vecteur d&#39;expression qui se traduit par un C-terminal His fusionnés à l&#39;aide de procédures standards de biologie moléculaire. Transformez cette construction dans E. coli souche hôte telle que BL21 (DE3). </li><li> Préparer le tampon de lyse, tampon détergent, Triton tampon TE (tableau 1), M 1-isopropyl β-D 1-thiogalactopyranoside (IPTG) et du milieu LB 18 avec les antibiotiques appropriés. </li><li> Choisissez un single E. colonie coli contenant le clone d&#39;expression à partir d&#39;une plaque fraîchement striée ~ dans 5 ml de milieu LB avec les antibiotiques appropriés à l&#39;aide des procédures standard 6. Croître à 37 ° C avec 220 tours agitation pendant au moins 16 heures. </li><li> Ajouter 2,5 ml de l&#39;O / N culture dans une fiole d&#39;Erlenmeyer de 1 litre avec 250 ml de LB supplémenté avec l&#39;antibiotique approprié. </li><li> Cultiver les cellules pendant 2-3 heures (ou jusqu&#39;à ce que la DO 600 est ~ 0,6) à 37 ° C à 220 rpm. </li><li> Ajouter de l&#39;IPTG à une concentration finale de 1 mM. Continuer à cultiver les cellules à 37 ° C avec 220 tours 3-4 h. </li><li> Centrifuger la culture pendant 10 min à 5000 x g à 4 ° C dans un tube préalablement pesé centrifugeuse. Jeter le surnageant soigneusement et déterminer le poids de la pastille en pesant de nouveau et en soustrayant le poids du tube de centrifugation. </li><li> Remettre en suspension le E. coli culot cellulaire dans 0,8 ml / g de tampon de lyse par vortex vigoureuse. NOTE: En variante, le culot de cellules peut être congelé à -80 ° CC pour une utilisation ultérieure. Si à partir d&#39;un culot congelé, décongeler totalement à permettre, avant l&#39;ajout du tampon de lyse. </li><li> Ajouter 2 mg de lysozyme par gramme de cellules et incuber sur de la glace avec des vortex de temps en temps pendant 30 min. </li><li> Ajouter 20 ug / ml de DNAse, 10 mM de MgCl2, 1 mM de NaCl, 20 ug / ml de RNAse. Vortex et de mettre sur la glace pendant 30 min. </li><li> Ajouter 2 ml de tampon froid de détergent par gramme de cellules. Bien mélanger et garder la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Transfert à 2 ml tubes de centrifugation (divisé en deux tubes si nécessaire). Centrifuger pendant 10 min à 12 000 xg à 4 ° C pour sédimenter les corps d&#39;inclusion. </li><li> Ajouter 1 ml de Triton froid tampon et remettre complètement la pastille par sonication (3 impulsions x 5 sec x puissance de 50% avec 20 secondes d&#39;intervalle). NOTE: Avoir le tube dans un petit bécher entourée par l&#39;eau glacée pour le garder froid pendant le traitement aux ultrasons. Dans le cas de plusieurs tubes, mélanger les corps d&#39;inclusion remises en suspension dans un tube après remise en suspension. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 12 000xg à 4 ° C pour sédimenter les corps d&#39;inclusion. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.13 et 4.14 deux fois. </li><li> Remettre en suspension les corps d&#39;inclusion dans 1 ml de TE avec sonication froid pour un lavage final à retirer le tampon Triton. Centrifuger pendant 10 min à 12 000 xg à 4 ° C pour sédimenter les corps d&#39;inclusion. </li><li> Reprendre le culot dans 1 ml de TE froid par sonification. </li><li> Évaluer la concentration de la protéine par des procédés classiques tels que le dosage de Bradford 19. aliquotes de magasins des corps d&#39;inclusion à -20 ° C. </li></ol> 5. Reconstitution Ce protocole donne généralement de 1 à 2 ml de protéine reconstitué avec un diamètre extérieur de 4 lorsque l&#39;absorbance est mesurée dans la région Qy (600-750 nm). Quantité peut être ajusté comme on le souhaite, bien que des précautions doivent être prises pour maintenir les rapports appropriés au cours de la procédure. <ol><li> Préparer les solutions suivantes telles que décrites dans le Tableau 1: 2x Reconstitution Buffer, 20% OG, 2 M de KCl, TE. Effectuer le s suivanteteps en faible lumière. </li><li> Remettre en suspension 800 mg de corps d&#39;inclusion du LHC dans un total de 400 pi de TE dans un tube de centrifugeuse de 2 ml. Ajouter 400 ul de la tampon de reconstitution 2x et brièvement de vortex. </li><li> Ajouter 0,6 ul de β-mercaptoéthanol (actions 14,8 M) pour avoir une concentration finale de 10 mM. Chauffer la protéine pendant 1 min à 98 ° C. brièvement Vortex et le lieu à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Remettre en suspension 500 mg du total des pigments de chlorophylle séchées plus 80 ug pigments caroténoïdes dans 30 ul EtOH à 100% par vortex vigoureusement pendant 1 min ou dans un bain sonique pendant 1-2 min. </li><li> Spin le mélange de pigments ~ 30 sec à 15 800 g à 4 ° C et confirmer qu&#39;il n&#39;y a pas de culot. S&#39;il existe une pastille, répéter tourbillonnement et / ou la sonification. IMPORTANT: Après la remise en suspension et de spin, ajouter immédiatement pigment à la protéine, ou il peut agréger et devront être remises en suspension à nouveau. </li><li> Lentement, ajouter le mélange de pigment à la protéine refroidi tout en vortex. Continuer à vortex 5-10 sec et placer le tube sur de la glace. Veillez à ne pas vortex trop vigoureusement que la protéine peut déborder la partie supérieure du tube. </li><li> Ajouter 94 ul de 20% octyl β-D-glucopyranoside (OG) (concentration finale de 2%), brièvement vortex et garder sur la glace 10 min. </li><li> Ajouter 90 ul de KCl 2 M (concentration finale 150-200 mM), vortex brièvement et garder sur la glace 20 min. REMARQUE: Préparation de la colonne (section 6) peuvent être lancées à cette époque. </li><li> Spin pendant 10 min à 15 800 g à 4 ° C. Eliminer le surnageant sans perturber le culot (précipité LDS) à un tube de 10 ml. Réserver au froid et à l&#39;abri de la lumière. </li></ol> Colonne 6 Nickel Purification <ol><li> Préparer les solutions suivantes de la manière décrite dans le tableau 1: tampon de OG, OG tampon de rinçage, un tampon d&#39;élution. </li><li> Connectez une colonne Ni-Sepharose (1 ml) ou l&#39;équivalent d&#39;une pompe péristaltique assurant que l&#39;air ne pénètre à l&#39;intérieur de la colonne au cours de cette étape et les étapes suivantes. </li><li> Réglez la vitesse de til Pompe à 1 ml / min et rincer la colonne avec 5 à 10 ml d&#39;eau pour éliminer la solution de stockage. </li><li> Équilibrer la colonne avec 3-4 ml de tampon OG. </li><li> Ajouter 3-4 ml de tampon OG à l&#39;échantillon de protéine et de la charge de la colonne. REMARQUE: si la protéine a été assis sur la glace pendant plus de 10 minutes après le retrait de LDS, tourner à nouveau à 15 800 g à 4 ° C pendant 1 min pour éliminer toute précipitation LDS supplémentaires. </li><li> Rincer la colonne avec 5 ml de tampon OG. </li><li> Rincer la colonne avec 2 ml de tampon de rinçage OG. </li><li> On élue la protéine liée avec 3 ml de tampon d&#39;élution. Recueillir l&#39;éluat vert qui contient la protéine reconstituée. REMARQUE: Il s&#39;agit généralement d&#39;environ 1 ml au total. </li></ol> 7. gradient de saccharose centrifugation <ol><li> Préparer les solutions suivantes de la manière décrite dans le tableau 1: solution de saccharose, 0,06% de β-DM, HEPES 0,01 M, pH 7,6. </li><li> Remplir des tubes d&#39;ultracentrifugation avec la solution de saccharose et congeler à -20 ° CO / N or à -80 ° C pendant au moins 1 heure. </li><li> Retirer le tube du congélateur et laisser décongeler tranquillement à 4 ° C. REMARQUE: le processus de congélation / décongélation crée un gradient de 0,1 à 1 M de saccharose. Un tube de 15 ml dégèle typiquement en environ 3 heures. </li><li> Retirez délicatement par le haut le même volume que la fraction verte élue de la colonne de Sepharose nickel à l&#39;étape 6.8. Ensuite, charger l&#39;échantillon reconstitué sur le dessus lentement pour éviter de perturber le gradient. </li><li> tubes de l&#39;équilibre et de spin à 200 000 xg à 4 ° C en ultracentrifugation l&#39;aide d&#39;un seau rotor SW-41 ou SW-60 oscillant pendant 18 heures, mis à ralentir l&#39;accélération et l&#39;arrêt sans freins. </li><li> Sortez soigneusement le gradient de support de tube avec une pince. Utiliser une seringue avec une aiguille longue qui présente une ouverture brutale de recueillir la fraction de la partie supérieure. NOTE: En variante, recueillir des fractions à partir du fond du tube par perçage avec une aiguille et en recueillant les gouttes. </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

Les protéines membranaires ne sont pas si faciles à étudier. Isolement des protéines de la membrane d&#39;origine est compliquée par la nécessité de solubiliser la bicouche lipidique avec des détergents, ce qui peut endommager la protéine et éliminer cofacteurs essentiels. Ces protéines peuvent également être présentes à de faibles niveaux dans les membranes biologiques, ou être mélangés avec des protéines étroitement apparentées, comme dans le cas des complexes collecteurs de lumière, qui permet la purification des complexes simples difficiles. Expression de la protéine hétérologue dans E. coli et dans la reconstitution in vitro offre la possibilité d&#39;éviter ces problèmes. reconstitution in vitro et la purification de protéines repliées résultats dans des complexes possédant des caractéristiques très semblables à celles des complexes natifs 20,21,23 et donc peut être utilisé pour étudier des complexes qui ne peuvent être purifiés jusqu&#39;à homogénéité 24 - 27. Cette méthode utilise les épinards, qui est facilement attainable long de l&#39;année, en tant que source pour les pigments caroténoïdes totaux et préparations. Pour certaines reconstitutions de protéines natives pour les algues, l&#39;utilisation de pigments purifiés à partir d&#39;algues est préféré en raison de compositions de pigments différents. La Chl a / b et rapport Chl rapport qualité / voiture reste la même indépendamment de la source de pigment. Il est important de réaliser que l&#39;efficacité de la reconstitution est généralement autour de 35% 28. Ainsi, il est nécessaire d&#39;enlever les pigments non-liés et l&#39;apoprotéine dépliée à partir de la solution après la reconstitution. Un protocole de purification en deux étapes est présenté dans ce protocole (voir aussi des résultats). Cependant, il convient de noter que l&#39;étape de gradient de saccharose ne permet pas la séparation complète de apo et holo-protéine. Pour la plupart des analyses, ce n&#39;est pas un problème, comme l&#39;apoprotéine ne contient pas de pigments et ainsi n&#39;interfère pas avec les mesures fonctionnelles. Toutefois, dans le cas où il est nécessaire de supprimer complètement l&#39;apoprotéine de la frune action contenant le complexe reconstitué (par exemple, pour calculer le pigment de protéine stoechiométrie), une colonne d&#39;échange anionique peut être utilisé (voir Passarini 2009 29 pour plus de détails et al.). La capacité de replier les protéines recombinantes lumière de récolte avec des pigments isolés in vitro donne l&#39;occasion de «manipuler» les complexes en modifiant la reconstitution «environnement» de différentes façons, ce qui modifie les caractéristiques du complexe résultant. Par exemple, en changeant la composition de pigment pendant la reconstitution peut se traduire par un complexe avec la composition de pigment modifiée. Cette fonction peut être utilisée pour étudier l&#39;influence de divers pigments ont sur la structure et la stabilité du complexe. Habituellement, la préparation de pigment obtenue à partir d&#39;épinard a une Chl a / b rapport de 3: 1 et un rapport a / Chl voiture de 2,9: 1. Ce rapport donne typiquement une protéine reconstituée avec les mêmes propriétés que le nAtive un. Cependant, le réglage de la chlorophylle a / b rapport par l&#39;addition d&#39;un ou Chl b purifié peut influencer la liaison de différents pigments en raison de la sélectivité des sites de liaison différents au 30 - 33. Cela est possible parce que la plupart des sites de liaison de pigments ne sont pas totalement sélective pour Chl un ou Chl b, mais peut accueillir à la fois, mais avec des affinités différentes 10,30,34. De la même manière, les sites de liaison de caroténoïdes ont également été présentés pour être en mesure d&#39;accueillir plus d&#39;une espèce de xanthophylle 8,35 - 38. Différentes reconstitutions de CP26, un autre complexe pigment-protéine de plantes supérieures, en utilisant diverses compositions de pigments sont présentés dans le tableau 39 2. Ces reconstitutions ont été utilisés pour évaluer l&#39;affinité des sites de liaison 39 particulier des pigments. Il est intéressant de noter que, pour obtenir un complexe avec le même pigment composition que celui d&#39;origine, la Chl rapport a / b de pigment mélange doit être de 3: 1. Cela semble être le cas pour tous les complexes du LHC de plantes supérieures 20,40. La combinaison de la biologie moléculaire de la technique permet de reconstitution les propriétés d&#39;un complexe de liaison à la chlorophylle être étudiés plus en détail. L&#39;importance des différents domaines protéiques sur la stabilité et le pliage des complexes, ou leur implication dans les interactions protéine-protéine, ont été déterminées en tronquant l&#39;apoprotéine ou effectuer une mutagenèse aléatoire 8,41 - 44. Résidus importants pour la coordination des différents pigments seul acide aminé peuvent être modifiés par mutagenèse dirigée afin d&#39;analyser les propriétés de différents pigments ou d&#39;évaluer leur contribution à la fonction et la stabilité du complexe 10,28,29,45 - 52. Figure 6 montre reconstitués Lhcb4 (CP29) avecune mutation de l&#39;histidine en position 216 53. Une comparaison de la composition de pigment de type sauvage et mutantes de complexes indique que la mutation provoque une perte de la Chl une molécule, ce qui indique que le site ciblé reçoit un Chl un complexe dans le WT. Les différences des spectres d&#39;absorption de WT et mutant, à la normalisation de la teneur en pigment, montre aussi les propriétés d&#39;absorption du pigment perdue. Dans ce cas, la différence peut être vu dans le pic principal à 680 nm, ce qui indique que la Chl a coordonné par His216 absorbe à cette longueur d&#39;onde (pour plus de détails sur ce mutant et les propriétés spectroscopiques voir Mozzo et al., 2008 53). L&#39;analyse des mutations peuvent également être utilisés pour déterminer l&#39;effet de l&#39;environnement sur ​​les propriétés spectroscopiques des pigments 54. En conclusion, les protéines de collecteurs de lumière peuvent facilement être reconstitués in vitro résultant en pigment-protein complexes avec des propriétés très similaires aux complexes indigènes. De cette façon, les difficultés de l&#39;isolement des protéines natives sont éliminées, tout en offrant la préparation de protéine avec un rendement élevé et de pureté pour une étude plus approfondie. L&#39;importance d&#39;un rapport de 3: a / b de la chlorophylle dans une production d&#39;un complexe authentique est souligné, et des exemples de type sauvage reconstitué et SLL mutantes sont fournies pour illustrer les applications de la technique.

L&#39;appareil photosynthétique de plantes et d&#39;algues comprennent des protéines membranaires intégrales qui se lient à la chlorophylle a (chl a), b (chl b) et les caroténoïdes (voiture). Ces complexes protéine pigment sont présentes dans l&#39;énergie de lumière de la récolte et le transfert de l&#39;énergie d&#39;excitation dans les centres de réaction, où il est utilisé pour promouvoir la charge séparation 2. Ils sont également impliqués dans les mécanismes de rétroaction de réglementation qui protègent l&#39;appareil photosynthétique des dommages de la lumière élevée 3,4. Les complexes lumière de récolte (SLL) sont constitués d&#39;une grande famille de protéines apparentées à des plantes et des algues 5. La purification homogène de chaque membre de la famille a été compliquée par les propriétés chimiques et physiques très semblables des complexes. En outre, les procédures de purification entraînent souvent la perte de pigments ou d&#39;autres cofacteurs potentiels tels que les lipides. In vitro représen de reconstitutionts une méthode puissante pour surmonter ces problèmes. Le LHC associé à photosystème II (LHC-II) a été reconstitué premier in vitro par Plumley et Schmidt en 1987 1. Ces chercheurs ont extrait protéine délipidée et pigments séparément à partir de chloroplastes de plantes, et ensuite combiné la protéine dénaturée par la chaleur avec des pigments en présence de lithium dodécyl sulfate (SI), suivie de trois cycles de congélation et décongélation 1. Ils ont montré que les propriétés spectrales des complexes LHC reconstitués étaient très semblables à des complexes purifiés de plantes. La facilité de reconstituer complexes pigment-protéine LHC, probablement en raison d&#39;une caractéristique inhérente à l&#39;auto-assemblage, ainsi que la difficulté d&#39;isoler des complexes purifiés à partir d&#39;organismes, a conduit à l&#39;adoption rapide de la méthode par d&#39;autres chercheurs. La reconstitution de protéines photosynthétiques surexprimé chez Escherichia coli (E. coli) a été obtenue par Paulsen et ses collègues en 1990 6. E. Danscoli, les protéines membranaires surexprimés sont généralement contenues dans des corps d&#39;inclusion, qui leur installations de purification. La reconstitution est réalisée par dénaturation thermique des corps d&#39;inclusion contenant la protéine recombinante en présence de LDS, suivie par l&#39;addition de pigments qui initie le repliement des protéines. Pliage du complexe LHCII est un processus en deux étapes: d&#39;abord, la chlorophylle a est lié en moins de 1 min; deuxième, la chlorophylle b est lié et stabilisé pendant plusieurs minutes 7. En plus de fournir un aperçu de la dynamique de pliage, lors de la reconstitution in vitro combinée à une mutagenèse dirigée a permis d&#39;identifier des acides aminés spécifiques importants pour la stabilité (par exemple, 8,9) ou de coordination d&#39;un pigment (par exemple, 10). Manipulation des conditions en réglant les paramètres tels que la composition de pigment ou de détergents repliement ont également identifié des éléments critical pour le pliage proprement dit, tel que l&#39;exigence de xanthophylles pour la LHCII complexe (par exemple, 1,11). En outre, l&#39;investigation des propriétés de pigments individuels liés à des complexes a été possible en utilisant des complexes reconstitués in vivo (par exemple, 10). La méthode décrite ici commence avec isolement de pigments (chlorophylles et caroténoïdes) de l&#39;épinard et l&#39;algue verte Chlamydomonas reinhardtii. L&#39;expression et la purification d&#39;une protéine de E. LHC coli sous forme de corps d&#39;inclusion est alors détaillée, suivie par la reconstitution de LHC et purification subséquente par colonne d&#39;affinité de Ni. Dans la dernière étape, les complexes reconstitués sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de saccharose à éliminer les pigments libres et apoprotéine déplié. Cette procédure constitue un protocole optimisé comportant plusieurs modifications qui ont été introduites par différents laboratoires surtemps 1,6,10,12 -14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;HisTrap HP</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon cloth&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>20 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft artists paint brush&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NONIDET P-40</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta-DM</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powders</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>O8001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge XL</td>
			<td style="width:115px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAP medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 19</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

Chez les plantes et les algues vertes, de la lumière est captée par les complexes collecteurs de lumière (SLL), une famille de protéines membranaires intégrales qui coordonnent les chlorophylles et caroténoïdes. In vivo, ces protéines sont repliées avec des pigments pour former des complexes qui sont insérées dans la membrane des thylakoïdes du chloroplaste. La grande similitude des propriétés chimiques et physiques des membres de la famille, ainsi que le fait qu&#39;ils peuvent facilement perdre pigments lors de l&#39;isolement, rend leur purification à l&#39;état natif difficile. Une autre approche pour obtenir des préparations homogènes de SLL a été développé par Plumley Schmidt en 1987 et 1, qui a montré qu&#39;il était possible de reconstituer ces complexes in vitro à partir de pigments purifiés et des apoprotéines dépliées, résultant en des complexes avec des propriétés très similaires à celles du native complexes. Cela a ouvert la voie à l&#39;utilisation de protéines recombinantes exprimées bactériennes pour in vitro </em&gt; reconstitution. Le procédé de reconstitution est puissant pour diverses raisons: (1) des préparations pures de complexes particuliers peuvent être obtenus, (2) la composition de pigment peut être commandé afin d&#39;évaluer leur contribution à la structure et de la fonction, (3) les protéines recombinantes peuvent être mutées pour étudier la fonction rôle des résidus individuels (par exemple, les sites de liaison de pigment) ou domaine de protéine (par exemple, l&#39;interaction protéine-protéine, pliage). Ce procédé a été optimisé dans plusieurs laboratoires et appliquée à la plupart des complexes collecteurs de lumière. Le protocole décrit ici en détail la méthode de reconstitution des complexes collecteurs de lumière in vitro utilisés actuellement dans notre laboratoire, et des exemples qui décrivent des applications du procédé sont fournis.

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In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Reconstitution in vitro de complexes collecteurs de lumière de plantes et d&#39;algues vertes

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.0K vues.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Vidéo: In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Molécules simples à l&#39;imagerie du transport nucléaire

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Recherche

Biologie

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Reconstitution biochimique des récepteurs stéroïdiens • complexes de protéines Hsp90 et la réactivation de la liaison du ligand

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

L&#39;analyse in vitro de PDZ-dépendants complexes macromoléculaires CFTR de signalisation

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

La cartographie sur-AFM des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions Subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Reconstitution de β-caténine dégradation dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrait des oeufs

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Mesure spatiale et temporelle Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de plantes d&#39;Arabidopsis

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validation d&#39;un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

Mise en place d’une Culture clonale d’algues unicellulaires de conjugaison

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...