Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch (1) das Verteidigungsministerium Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Activity) preis # W81XVVH-10-1-0781 LAL und VE, und (2) die Susan G. Komen Foundation Grant IR122224446 Lal und VE. Pathologie Unterstützung und Gewebehochrechnungs wurde freundlicherweise von Inova Fairfax Pathologie-Abteilung, Dr. Hassan Nayer, Dr. Gita A. Menezes, und Dr. Charles Bechert vorgesehen. Patienteneinwilligung und Probenbeschaffung wurde fachmännisch von Inova Fairfax Hospital klinischen Forschungskoordinatoren Holly Gallimore, Heather Huryk und Emil Kamar geführt.

Menschlichem Brustgewebe wurde von Patienten in einer Forschungsstudie eingeschrieben, mit schriftlicher Einwilligung erhoben, nach Department of Defense, George Mason University, und genehmigte Protokolle Inova Health System Institutional Review Board. 1. Bereiten Nährstoff reiches Medium mit Wachstumsfaktoren und Antibiotika <ol><li> Stammlösungen von Insulin, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Streptomycinsulfat und Gentamicinsulfat. <ol><li> Rekonstitution in sterile Insulin gefilterte Wasser auf eine Endkonzentration von 10 mg / ml. Saugen Sie 10 ml Typ 1 analysenreinem Wasser in einem sterilen 10 ml Einwegspritze. Bringen Sie einen 0,22 um Polyethersulfon-Filter an der Spritze. Verzichten die sterile gefilterte Wasser in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> 10 ml steril filtriert Wasser zu einer 100 mg Ampulle von Insulin. Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Halten Sie das Insulinfläschchen auf Eis. Dispense 450 ul der Insulinstammlösungention in beschriftete, sterile Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. Insulin-Stammlösung ist bis zum Verfallsdatum auf dem Fläschchen stabil. </li><li> Bereiten Stammlösung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF): In 500 ul sterilem Wasser auf 500 ug EGF (Lager 1 ug / ul). Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Halten Sie den EGF Fläschchen auf Eis. <ol><li> Bereiten Sie eine Arbeitsstammlösung von EGF: 100 l des Aktien EGF-Lösung bis 900 &amp; mgr; l Nährmedium (Arbeits Aktie 0,1 ug / ul sein). Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Geben Sie 50 ul der EGF Arbeitsstammlösung in beschriftete, sterile Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C. HINWEIS: EGF-Stammlösung (1 ug / ul) ist für 1 Jahr stabil bei -80 ° C; Arbeitsstammlösung (0,1 ug / ul) ist 2 Monate bei -80 ° C stabil. </li></ol></li><li> Wiegt 40 mg Streptomycinsulfat auf einer Analysenwaage. Legen Sie die Streptomycinsulfat intoa sterile 15 ml konischen Röhrchen. 4 ml Nährmedium. Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Die Lösung sollte leicht rosa sein. Lagerung bei 4 ° C lichtgeschützt lagern. Streptomycinsulfat-Lösung ist für 7 Tage stabil. </li><li> Wiegt 20 mg Gentamicinsulfat auf einer Analysenwaage. Legen Sie die Gentamycinsulfat in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen. 2 ml Nährmedium. Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Die Lösung sollte gelb sein. Lagerung bei 4 ° C lichtgeschützt lagern. Gentamicin-Sulfat-Lösung ist für 7 Tage stabil. </li></ol></li><li> Vorbereitung zwei 200 ml Chargen Nährmedium mit humanem rekombinantem EGF ergänzt (10 ng / ml Endkonzentration.), Insulin (10 ug / ml Endkonzentration.), Streptomycinsulfat (100 ug / ml Endkonzentration.) Und Gentamicinsulfat (20 ug / ml Endkonzentration.). <ol><li> In 200 ml Nährmedium mit einer Vakuumfilterkolben mit 0,2 um Polyethersulfon Filterkolben ausgestattet und einem 250 ml Auffangflasche. In 20 &amp;# 181; l Arbeitsstamm EGF, 200 ul Lager Insulin, 2 ml Stammstreptomycinsulfat und 400 ul Lager Gentamycinsulfat zum 200 ml Nährmedium. Die Filterkolben anbringen zu einem Vakuum. Filtern Sie die Medium. Entsorgen Sie den Filter und den Kolben als &quot;nährstoffreichen Medium&quot; zu kennzeichnen. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 14 Tage. </li></ol></li></ol> 2. Die Gewebeerfassung und Hochrechnung <ol><li> Im Operationsbereich, pflegen steriler Technik nach Beschaffung des Brustgewebes. Legen Sie das Brustgewebe in einem sterilen Tablett und decken das Tablett mit sterilen Plastikfolie. <ol><li> Transportieren Sie das Gewebe in der überdachten Fach Radiologie / Pathologie, wie durch Ihre Institution erforderlich. Das Fach nicht öffnen. Transportzeiten variieren innerhalb der Institutionen. Gewebe kann in diesem überdachten Fach bei RT bis zu 45 min nach Exzision lebensfähig bleiben. , Schnelle Verarbeitung des Gewebes in nährstoffreichen Medium bietet jedoch optimale Bedingungen für die anschließende Organoid Kultur. </li></ol></li><li> Gross Gewebedissektion die mit Bereichen von DCIS innerhalb des Brustgewebes zu identifizieren: Verwenden Sie sterile Handschuhe, Klingen, Skalpelle, Gewebemarkierungsfarbstoffe und Essig während Gewebedissektion um Gewebe Sterilität aufrechtzuerhalten. <ol><li> Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol oder 1% Bleichmittel. Öffnen Sie die sterile Handschuhe und setzen Sie den Handschuh-Wrapper auf die Arbeitsfläche. Legen Sie das sterile Innere des Handschuhs Wrapper Gesicht. Setzen Sie auf die sterile Handschuhe. <ol><li> Reinigen der Oberfläche des Probenbehälters mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Plastikfolie von der Gewebeprobenbehälter und legen Sie die Probe auf dem Handschuh-Wrapper. </li></ol></li><li> Tauchen Sie zwei Wattestäbchen Abstriche in das Gewebe Markierungsfarbstoff. Anwendung des Farbstoffs an der Oberfläche des Gewebes durch Walzen die Tupfer über die Gewebeoberfläche. Hinweis: Jeder Pathologie hat einen standardisierten Farbstoff Farbe / Gewebeorientierung Protokoll. Gewebe mit Farbstoff markiert, um das Gewebe in Bezug auf seine Position in dem Patienten orientieren. Der Farbstoff wird ausgelöscht oderauf das Gewebe lackiert. Füllen Sie nicht den Farbstoff über das Gewebe. Gießen der Farbstoff kann bewirken, dass der Farbstoff in das Gewebe Ritzen so verwirrend die Ausrichtung der operativen Margen führen / Tropf. Tissue Orientierung bietet dem Chirurgen und Pathologen mit anatomischen Merkmalen, um a) eine Beschreibung der Gewebeprobe und b) bestimmen die Lage der operativen Margen in Bezug auf den Tumor. </li><li> Gießen destilliertem weißen Essig (5% Essigsäure) auf steriler Gaze-Pads. Tupfen Sie das gefärbte Gewebe mit dem Essig getränkten Gaze. Entsorgen Sie die Gaze. Essig wird die Markierung im Gewebe Farbstoffe zu fixieren. </li><li> Schneiden Sie das Brustgewebe in vertikale Scheiben ca. 5 mm dick. Schneiden Sie nicht den ganzen Weg durch das Gewebe (Abbildung 2). Beobachten / ertasten das Gewebe für Bereiche der Verkalkung. Identifizieren DCIS Läsionen durch ihre charakteristische Firma, blasse Erscheinung durch rötliche umgeben, gummi Grenzen, die kiesigen fühlen (wegen Calcium spicules). HINWEIS: In einigen Fällen kann Mitesser (Pickel-like) Gebietenals weißen Punkten, die nekrotischen Material von großem Durchmesser DCIS Läsionen gesehen. </li><li> Schnitten Bereiche DCIS / verkalkt Brustgewebe, einschließlich einer geringen Menge umgebenden Brustgewebe. Legen Sie das Brustgewebe in ein steriles 50 ml Röhrchen mit 20-30 ml nährstoffreichen Medium in Schritt 1 vorbereitet. <ol><li> Mischen Sie das Gewebe und Medium durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Entsorgen Sie das Medium und fügen frisches Medium. Das Röhrchen wird das Gewebe und Medium, das in einem isolierten Behälter und Transportieren des Gewebes an den Gewebekulturlabor. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Gewebekultur <ol><li> Arbeiten in einem biologischen Sicherheitsschrank, gießt das Gewebe und eine kleine Menge des Nährmediums in eine sterile Petrischale. Mit einem sterilen Skalpell weggeschnitten und entsorgen Sie die Fasergewebe. Schneiden Sie das Brustgewebe in Stücke (Organoiden) ca. 3 mm 2 (1C-D). Versuchen Sie, das Gewebe zu schneiden, so dass jedes Organoid mindestens eine erkennbare Kanalabschnitt mit umgebenden Stroma. </li><li> Öffnen Sie den Deckel der Zellkulturflasche. Mit einer sterilen Pinzette oder Zange, legen Sie die Organoiden in den Kolben. Schließen Sie den Deckel. Entsorgen Sie die Petrischale. </li><li> Hinzufügen 11 ml serumfreien nährstoffreichen Medium (hergestellt in Schritt 1) ​​zu der Zellkulturflasche. Das Gefäß verschließen und den Kolben wirbeln so die Organoiden und mittlere gleichmäßig über die Flaschenoberfläche (1E-F) verteilt. </li><li> Der Kolben wird bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten 5,0% CO 2 -Atmosphäre für 2 Tage. Sie nicht den Kolben während dieser Zeit bewegen. </li><li> Am Tag 2 nach der Inkubation, entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator, um für potenzielle Bakterien / Pilzbefall zu überprüfen. Vermeiden Sie plötzliche, heftige Bewegungen oder Verwirbelung des Kolbens. Den Kolben in einem inversen Mikroskop Bühne. <ol><li> Beachten Sie das Medium für Bakterien, Hefen und / oder Pilzbefall. Wenn keine Verunreinigungen festgestellt wird, wird der Kolben zurück in den Inkubator für eine Zusatzitional Tag. Wenn eine Kontamination festgestellt wird, entsorgen Sie die Kolben und der Inhalt in einen geeigneten Behälter. </li></ol></li><li> Am Tag 3 nach der Inkubation, ersetzen Sie das konditionierte Medium mit frischem Medium. <ol><li> Platzieren 11 ml Medium in einem sterilen Röhrchen bei 37 ° C für 20-30 min. Die Zellkulturflasche aus dem Inkubator entfernen. Ohne die Organoiden stören, entfernen und entsorgen Sie das Medium in den Kolben mit einer sterilen serologischen Pipette. </li><li> Mit Hilfe einer neuen sterilen serologischen Pipette 11 ml des vorgewärmten frisches Medium. Sehr sanft drehen Sie den Kolben, um das Medium über die Flaschenoberfläche zu verteilen. </li><li> Der Kolben wird bei 37 ° C in einer befeuchteten 5,0% CO 2 -Atmosphäre inkubiert. </li></ol></li></ol> 4. Wartung von Gegründet Organoide / Epithelzellen Kolonien <ol><li> Bereiten Sie frisches Medium alle 2 Wochen und ersetzen Sie die Medien in der Zellkulturflasche 3-mal pro Woche. <ol><li> Platzieren 11 ml Medium in einem sterilen Behälter in 37° C für 20-30 min. Die Flasche aus dem Inkubator entfernen. Mit einem sterilen serologischen Pipette, entfernen und entsorgen Sie die konditionierte Medium aus dem Kolben, wobei Sie darauf achten, nicht die Organoiden stören. </li><li> Mit Hilfe einer neuen sterilen serologischen Pipette 11 ml des vorgewärmten frisches Medium. Sehr sanft drehen Sie den Kolben, um das Medium über die Flaschenoberfläche zu verteilen. Der Kolben wird bei 37 ° C in einer befeuchteten 5,0% CO 2 -Atmosphäre inkubiert. </li></ol></li><li> Nach von 10 - 14 Tagen in Kultur, entfernen alle Gewebestücke in der Kulturflasche, die nicht adhärenten sind. <ol><li> Periodisch Ernten der Zellen und / oder Organoide aus dem Kolben für eine Ausbreitung in neue Kulturflaschen für Xenograft-Transplantation oder zur phänotypischen und / oder molekulare Analyse. </li><li> Die Zellkulturflasche aus dem Inkubator entfernen. Sprühen Sie den Kolben, der mit 70% Ethanol. Wischen überschüssiges Ethanol zu dem Kolben mit einem sauberen Papiertuch, das mit 70% Ethanol besprüht wurde. </li><li> Organoid Vermehrung: &lt;ol&gt; <li> Öffnen Sie den Deckel der Flasche und legen Sie den Deckel offen in der biologischen Sicherheitsschrank. Unter mikroskopischer Visualisierung, suchen Sie die Organoid (n), geerntet werden. Verwenden Sie sterile Pinzette oder Zange zu Pick-up ein organoides. </li><li> Um die Organoid in einem neuen Kulturflasche zu propagieren, setzen Sie den Organoid im neuen Kolben. In 11 ml frischem, warmem Medium. Inkubieren bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre wie in den Schritten 3.3 - 3.6.3. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium in der Zellkulturflasche dreimal pro Woche. </li></ol></li><li> Ernten der Zellen: <ol><li> Unter direkte mikroskopische vixualization, vorsichtig abkratzen und saugen Zellen und mammospheres mit einem 1000 ul Pipette mit sterilen Einweg-Pipettenspitzen. Saugen Sie die Zellen und umgebenden Medium. Verzichten die Zellen / Medium in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> Dreh die Zellen kurz in einem Mini-Zentrifuge bei 12.100 xg für 5 sec. Entfernen und entsorgen Sie das Medium. &lt;ol&gt; <li> Zur DNA-Analyse, sofort gefrier das Zellpellet auf Trockeneis in einem kleinen Mediumvolumen (10 ul), mit langfristiger Lagerung bei -80 ° C. </li><li> Zur Proteomanalyse, lysieren die Zellen in 10 ul 8 M Harnstoff für die Massenspektrometrie oder 2x SDS Tris-Glycin-Puffer für Western Blot / Umkehrphasen-Protein-Microarrays. Alternativ drehen Zellen in einem Zytozentrifuge zu Zellabstriche zur immunhistochemischen Analyse zu machen. </li></ol></li><li> Nach dem Ernten von Zellen aus einem Kolben, entfernen und entsorgen Sie die restliche Medium. In 11 ml warmem, frisch nährstoffreichen Medium. Der Kolben wird bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebene Kultursystem stellt ein neues Modell für die Erzeugung leben präinvasiven neoplastischer Brustzellen für die Grundlagenforschung und translationale Forschung Studien. In der Vergangenheit hat prämalignen Brustkrebsprogression typischerweise unter Verwendung von drei verschiedenen Verfahren untersucht. Die erste Methode ist histopathologischen und genetischen Analyse mikrodisseziert gefroren oder festen Proben menschlichen 12-14. Die zweite Methode nutzt Mausmodellen, die hyperplastis...

Proliferation von Epithelzellen innerhalb der Grenzen der Milchgänge und Alveolen (duktale Carcinoma in situ) als obligate Vorläufer invasive duktale und lobuläre Mammakarzinom erkannt. Dennoch sind die molekularen Mechanismen und Zellpopulationsdynamik, die Progression zu einem invasiven Krebs erlauben kaum verstanden. Aufklärung der Überlebensmechanismen von pre-invasiven Brustkrebszellen, oder jede präinvasiven Tumor verwendet wird, kann therapeutische Strategien für das Töten oder sogar verhindern, pre-invasiven Neoplasien 1 offenbaren. Doch einfache Low-Cost-Methoden zur funktions Studium der menschlichen präinvasiven Läsionen haben gefehlt. Obwohl in vitro Monokultur von transformierten Zelllinien ist eine etablierte Labormethode, der Phänotyp und Genotyp dieser immortalisierten Zelllinien nicht die Molekular Status der primären menschlichen Tumorzellen 2 zu wiederholen. Selbst die nicht-tumor MCF-10A Zelllinie, die recapitulates 3-D Brustdrüse Architektur nicht die funktionellen Phänotyp und molekularen Eigenschaften des pre-invasive Brustläsion 3,4 einzelnen Patienten adäquat zu repräsentieren. Zu bestimmen, ob stielartigen neoplastischen Zellen fähig Invasion im duktalen Carcinoma in situ (DCIS) Zellpopulation existiert, eine Methodik entwickelt, die wir für das Sammeln und Kulti sterile menschlichen Brustgewebe zum Zeitpunkt der Operation (1) 5. Unsere ex vivo Brust organoiden Kultursystem nicht auf die enzymatische Gewebe-Zerstörung, Basalmembran-Matrix-Extrakt oder Fibroblasten Verarmungs verlassen, für Isolierung und Vermehrung mammosphere bildenden Zellen aus frischem menschlichen Brustkarzinomgewebe duktalen 6-8. Unser neues System ist auf dem Prinzip der Zelle Streaming / Migrations 5 basiert. Die erkennbaren Milchgänge, und die umliegenden Stroma sind in einem Mindestvolumen von Serum-freien Nährmedium (nur E tauchtnough die Kanalfragmente umfassen), um den Gasaustausch in keiner bestimmten Ausrichtung in den Kolben (1E-F) zu maximieren, mit der Schnittfläche des Kanals in das Kulturmedium ausgesetzt ist, aber. Dieses Kultursystem erlaubt den Zellen, aus dem Kanal und in / auf dem autologen Stroma und Kulturkolben migrieren. Das Nährmedium, nur Epidermal Growth Factor (EGF), Insulin und Antibiotika ergänzt, fördert das Wachstum von gemischten Zellpopulationen aus dem organoiden ausgeht. Die Gewebekulturflasche hat einen abnehmbaren, wiederverschließbaren Deckel, die Organoide und / oder Zellen ohne Unterbrechung der gesamte Kolben oder Nachbar Organoiden geerntet werden können, während eine sterile feuchten Umgebung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A405-P</td>
			<td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water, sterile filtered</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic disposable syringe, sterile</td>
			<td style="width:187px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2&#181;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin, human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11376497001</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GF144</td>
			<td>100&#181;g/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S1567</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G19114</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration flask and filter top, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>0.22&#181;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>4489</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4488</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:353px;">Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td>
			<td style="width:187px;">CDI</td>
			<td style="width:119px;">MD2000</td>
			<td style="width:365px;">after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cotton tipped applicators, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>23-400-115</td>
			<td>single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Gauze pads, 10x10cm, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td>
			<td style="width:187px;">Samco</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Vinegar, white distilled</td>
			<td style="width:187px;">household use</td>
			<td></td>
			<td style="width:365px;">5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">#10 scalpels, sterile, disposable&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>31-200-32&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">petri dish, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TPP 115cm2 flask, with removable lid</td>
			<td style="width:187px;">MidSci</td>
			<td style="width:119px;">90652</td>
			<td>screw cap with filter</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:353px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>5% CO2, 37 oC, humidified chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">inverted light microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olypmus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">8M urea</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-500</td>
			<td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2X SDS tris-glycine buffer</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>optional, for preparing cell smears</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

Breast duktalen Carcinoma in situ (DCIS), per Definition, ist die Proliferation von Tumor Epithelzellen innerhalb der Grenzen des Brustgang, ohne dass der kollagenen Basalmembran. Während DCIS ist eine nicht-invasive obligate Vorläufer Brustkrebs sind die molekularen Mechanismen und Zellpopulationen, die Progression zu einem invasiven Krebs gestatten nicht vollständig bekannt. Zu bestimmen, ob Vorläuferzellen, die Invasion im DCIS Zellpopulation existiert, haben wir eine Methode zum Sammeln und Kulti sterile menschlichen Brustgewebe zum Zeitpunkt der Operation, ohne die enzymatische Zerstörung von Gewebe. Sterile Brustgewebe enthält duktalen Segmente aus chirurgisch entfernt folgende Routine pathologische Untersuchung Brustgewebe geerntet. Tissue enthält DCIS wird in nährstoffreichen, antibiotikahaltigen, serumfreies Medium zur Gewebekulturlabor gebracht und transportiert. Das Brustgewebe wird weiter dissected, die verkalkten Stellen zu isolieren. Mehrere Brustgewebestücke (Organoiden) in einem minimalen Volumen von serumfreiem Medium in einem Kolben mit einem abnehmbaren Deckel und kultiviert in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator gegeben. Epithelialen und Fibroblasten-Zellpopulationen ergeben sich aus der Organoid nach 10-14 Tagen haben. Mammospheres spontan auf und um die epitheliale Zellschicht. Spezifische Zellpopulationen können direkt aus dem Kolben ohne Störung benachbarter Zellen geerntet werden. Unsere nicht-enzymatische Gewebekultursystem zuverlässig verrät zytogenetisch abnormal, invasive Vorläuferzellen aus frischen menschlichen DCIS Läsionen.

Workflow für die Beschaffung und das Kultivieren sterile Brust duktalen Carcinoma in situ Tissue Brustgewebe Sterilität aus dem Operationssaal in die Zellkulturlabor über geringfügige Änderungen in typischen Krankenhauspathologie Workflow (Abbildung 1) gehalten. Gewebe wird in einem sterilen Behälter mit einer Deckfolie, die radiologische Beurteilung ermöglicht unter Beibehaltung der Sterilität Gewebe transportiert. Gross Gewebeverarbeitung einer Brust Lumpekto...

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Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für&gt; 6 Monate.

Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Aufrufe.  George Mason University.  Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für> 6 Monate. 

Serie: Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

Vorbereitung der gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) als effiziente Ergänzung zum tierischen Serum-freien menschlichen Stammzell-Kulturen

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Elektrospinnen Faserige Polymer Gerüste für Tissue Engineering und Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

Langfristige Culture of Human Breast Cancer Proben und deren Analyse mit Hilfe von optischen Projektion Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Generation und Kultur der Blut Outgrowth Endothelzellen aus menschlichen peripheren Blut-

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca and, in particular, of the granulosa cell layer profoundly change their morphological, physiological, and molecular characteristics and form the progesterone-producing corpus luteum that is responsible for maintaining pregnancy. Cell culture models are essential tools to study the underlying regulatory mechanisms involved in the folliculo-luteal transformation. The presented protocol focuses on the isolation procedure and cryopreservation of bovine GC from small- to medium-sized follicles (&#60; 6 mm). With this technique, a nearly pure population of GC can be obtained. The cryopreservation procedure greatly facilitates time management of the cell culture work independent of a direct primary tissue (ovaries) supply. This protocol describes a serum-free cell culture model that mimics the estradiol-active status of bovine GC. Important conditions that are essential for a successful steroid-active cell culture are discussed throughout the protocol. It is demonstrated that increasing the plating density of the cells induces a specific response as indicated by an altered gene expression profile and hormone production. Furthermore, this model provides a basis for further studies on GC differentiation and other applications.

A long-term culture model of bovine granulosa cells under serum-free conditions is described. This model allows researchers to study the effects of diverse factors and conditions as different plating densities on the characteristics of estrogen-producing bovine granulosa cells.

Ein Tissue Culture Modell der Östrogen-produzierenden primäre Bovine Granulosa Zellen

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...