Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch (1) das Verteidigungsministerium Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Activity) preis # W81XVVH-10-1-0781 LAL und VE, und (2) die Susan G. Komen Foundation Grant IR122224446 Lal und VE. Pathologie Unterstützung und Gewebehochrechnungs wurde freundlicherweise von Inova Fairfax Pathologie-Abteilung, Dr. Hassan Nayer, Dr. Gita A. Menezes, und Dr. Charles Bechert vorgesehen. Patienteneinwilligung und Probenbeschaffung wurde fachmännisch von Inova Fairfax Hospital klinischen Forschungskoordinatoren Holly Gallimore, Heather Huryk und Emil Kamar geführt.

Menschlichem Brustgewebe wurde von Patienten in einer Forschungsstudie eingeschrieben, mit schriftlicher Einwilligung erhoben, nach Department of Defense, George Mason University, und genehmigte Protokolle Inova Health System Institutional Review Board. 1. Bereiten Nährstoff reiches Medium mit Wachstumsfaktoren und Antibiotika <ol><li> Stammlösungen von Insulin, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Streptomycinsulfat und Gentamicinsulfat. <ol><li> Rekonstitution in sterile Insulin gefilterte Wasser auf eine Endkonzentration von 10 mg / ml. Saugen Sie 10 ml Typ 1 analysenreinem Wasser in einem sterilen 10 ml Einwegspritze. Bringen Sie einen 0,22 um Polyethersulfon-Filter an der Spritze. Verzichten die sterile gefilterte Wasser in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> 10 ml steril filtriert Wasser zu einer 100 mg Ampulle von Insulin. Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Halten Sie das Insulinfläschchen auf Eis. Dispense 450 ul der Insulinstammlösungention in beschriftete, sterile Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. Insulin-Stammlösung ist bis zum Verfallsdatum auf dem Fläschchen stabil. </li><li> Bereiten Stammlösung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF): In 500 ul sterilem Wasser auf 500 ug EGF (Lager 1 ug / ul). Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Halten Sie den EGF Fläschchen auf Eis. <ol><li> Bereiten Sie eine Arbeitsstammlösung von EGF: 100 l des Aktien EGF-Lösung bis 900 &amp; mgr; l Nährmedium (Arbeits Aktie 0,1 ug / ul sein). Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Geben Sie 50 ul der EGF Arbeitsstammlösung in beschriftete, sterile Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C. HINWEIS: EGF-Stammlösung (1 ug / ul) ist für 1 Jahr stabil bei -80 ° C; Arbeitsstammlösung (0,1 ug / ul) ist 2 Monate bei -80 ° C stabil. </li></ol></li><li> Wiegt 40 mg Streptomycinsulfat auf einer Analysenwaage. Legen Sie die Streptomycinsulfat intoa sterile 15 ml konischen Röhrchen. 4 ml Nährmedium. Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Die Lösung sollte leicht rosa sein. Lagerung bei 4 ° C lichtgeschützt lagern. Streptomycinsulfat-Lösung ist für 7 Tage stabil. </li><li> Wiegt 20 mg Gentamicinsulfat auf einer Analysenwaage. Legen Sie die Gentamycinsulfat in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen. 2 ml Nährmedium. Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Die Lösung sollte gelb sein. Lagerung bei 4 ° C lichtgeschützt lagern. Gentamicin-Sulfat-Lösung ist für 7 Tage stabil. </li></ol></li><li> Vorbereitung zwei 200 ml Chargen Nährmedium mit humanem rekombinantem EGF ergänzt (10 ng / ml Endkonzentration.), Insulin (10 ug / ml Endkonzentration.), Streptomycinsulfat (100 ug / ml Endkonzentration.) Und Gentamicinsulfat (20 ug / ml Endkonzentration.). <ol><li> In 200 ml Nährmedium mit einer Vakuumfilterkolben mit 0,2 um Polyethersulfon Filterkolben ausgestattet und einem 250 ml Auffangflasche. In 20 &amp;# 181; l Arbeitsstamm EGF, 200 ul Lager Insulin, 2 ml Stammstreptomycinsulfat und 400 ul Lager Gentamycinsulfat zum 200 ml Nährmedium. Die Filterkolben anbringen zu einem Vakuum. Filtern Sie die Medium. Entsorgen Sie den Filter und den Kolben als &quot;nährstoffreichen Medium&quot; zu kennzeichnen. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 14 Tage. </li></ol></li></ol> 2. Die Gewebeerfassung und Hochrechnung <ol><li> Im Operationsbereich, pflegen steriler Technik nach Beschaffung des Brustgewebes. Legen Sie das Brustgewebe in einem sterilen Tablett und decken das Tablett mit sterilen Plastikfolie. <ol><li> Transportieren Sie das Gewebe in der überdachten Fach Radiologie / Pathologie, wie durch Ihre Institution erforderlich. Das Fach nicht öffnen. Transportzeiten variieren innerhalb der Institutionen. Gewebe kann in diesem überdachten Fach bei RT bis zu 45 min nach Exzision lebensfähig bleiben. , Schnelle Verarbeitung des Gewebes in nährstoffreichen Medium bietet jedoch optimale Bedingungen für die anschließende Organoid Kultur. </li></ol></li><li> Gross Gewebedissektion die mit Bereichen von DCIS innerhalb des Brustgewebes zu identifizieren: Verwenden Sie sterile Handschuhe, Klingen, Skalpelle, Gewebemarkierungsfarbstoffe und Essig während Gewebedissektion um Gewebe Sterilität aufrechtzuerhalten. <ol><li> Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol oder 1% Bleichmittel. Öffnen Sie die sterile Handschuhe und setzen Sie den Handschuh-Wrapper auf die Arbeitsfläche. Legen Sie das sterile Innere des Handschuhs Wrapper Gesicht. Setzen Sie auf die sterile Handschuhe. <ol><li> Reinigen der Oberfläche des Probenbehälters mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Plastikfolie von der Gewebeprobenbehälter und legen Sie die Probe auf dem Handschuh-Wrapper. </li></ol></li><li> Tauchen Sie zwei Wattestäbchen Abstriche in das Gewebe Markierungsfarbstoff. Anwendung des Farbstoffs an der Oberfläche des Gewebes durch Walzen die Tupfer über die Gewebeoberfläche. Hinweis: Jeder Pathologie hat einen standardisierten Farbstoff Farbe / Gewebeorientierung Protokoll. Gewebe mit Farbstoff markiert, um das Gewebe in Bezug auf seine Position in dem Patienten orientieren. Der Farbstoff wird ausgelöscht oderauf das Gewebe lackiert. Füllen Sie nicht den Farbstoff über das Gewebe. Gießen der Farbstoff kann bewirken, dass der Farbstoff in das Gewebe Ritzen so verwirrend die Ausrichtung der operativen Margen führen / Tropf. Tissue Orientierung bietet dem Chirurgen und Pathologen mit anatomischen Merkmalen, um a) eine Beschreibung der Gewebeprobe und b) bestimmen die Lage der operativen Margen in Bezug auf den Tumor. </li><li> Gießen destilliertem weißen Essig (5% Essigsäure) auf steriler Gaze-Pads. Tupfen Sie das gefärbte Gewebe mit dem Essig getränkten Gaze. Entsorgen Sie die Gaze. Essig wird die Markierung im Gewebe Farbstoffe zu fixieren. </li><li> Schneiden Sie das Brustgewebe in vertikale Scheiben ca. 5 mm dick. Schneiden Sie nicht den ganzen Weg durch das Gewebe (Abbildung 2). Beobachten / ertasten das Gewebe für Bereiche der Verkalkung. Identifizieren DCIS Läsionen durch ihre charakteristische Firma, blasse Erscheinung durch rötliche umgeben, gummi Grenzen, die kiesigen fühlen (wegen Calcium spicules). HINWEIS: In einigen Fällen kann Mitesser (Pickel-like) Gebietenals weißen Punkten, die nekrotischen Material von großem Durchmesser DCIS Läsionen gesehen. </li><li> Schnitten Bereiche DCIS / verkalkt Brustgewebe, einschließlich einer geringen Menge umgebenden Brustgewebe. Legen Sie das Brustgewebe in ein steriles 50 ml Röhrchen mit 20-30 ml nährstoffreichen Medium in Schritt 1 vorbereitet. <ol><li> Mischen Sie das Gewebe und Medium durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Entsorgen Sie das Medium und fügen frisches Medium. Das Röhrchen wird das Gewebe und Medium, das in einem isolierten Behälter und Transportieren des Gewebes an den Gewebekulturlabor. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Gewebekultur <ol><li> Arbeiten in einem biologischen Sicherheitsschrank, gießt das Gewebe und eine kleine Menge des Nährmediums in eine sterile Petrischale. Mit einem sterilen Skalpell weggeschnitten und entsorgen Sie die Fasergewebe. Schneiden Sie das Brustgewebe in Stücke (Organoiden) ca. 3 mm 2 (1C-D). Versuchen Sie, das Gewebe zu schneiden, so dass jedes Organoid mindestens eine erkennbare Kanalabschnitt mit umgebenden Stroma. </li><li> Öffnen Sie den Deckel der Zellkulturflasche. Mit einer sterilen Pinzette oder Zange, legen Sie die Organoiden in den Kolben. Schließen Sie den Deckel. Entsorgen Sie die Petrischale. </li><li> Hinzufügen 11 ml serumfreien nährstoffreichen Medium (hergestellt in Schritt 1) ​​zu der Zellkulturflasche. Das Gefäß verschließen und den Kolben wirbeln so die Organoiden und mittlere gleichmäßig über die Flaschenoberfläche (1E-F) verteilt. </li><li> Der Kolben wird bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten 5,0% CO 2 -Atmosphäre für 2 Tage. Sie nicht den Kolben während dieser Zeit bewegen. </li><li> Am Tag 2 nach der Inkubation, entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator, um für potenzielle Bakterien / Pilzbefall zu überprüfen. Vermeiden Sie plötzliche, heftige Bewegungen oder Verwirbelung des Kolbens. Den Kolben in einem inversen Mikroskop Bühne. <ol><li> Beachten Sie das Medium für Bakterien, Hefen und / oder Pilzbefall. Wenn keine Verunreinigungen festgestellt wird, wird der Kolben zurück in den Inkubator für eine Zusatzitional Tag. Wenn eine Kontamination festgestellt wird, entsorgen Sie die Kolben und der Inhalt in einen geeigneten Behälter. </li></ol></li><li> Am Tag 3 nach der Inkubation, ersetzen Sie das konditionierte Medium mit frischem Medium. <ol><li> Platzieren 11 ml Medium in einem sterilen Röhrchen bei 37 ° C für 20-30 min. Die Zellkulturflasche aus dem Inkubator entfernen. Ohne die Organoiden stören, entfernen und entsorgen Sie das Medium in den Kolben mit einer sterilen serologischen Pipette. </li><li> Mit Hilfe einer neuen sterilen serologischen Pipette 11 ml des vorgewärmten frisches Medium. Sehr sanft drehen Sie den Kolben, um das Medium über die Flaschenoberfläche zu verteilen. </li><li> Der Kolben wird bei 37 ° C in einer befeuchteten 5,0% CO 2 -Atmosphäre inkubiert. </li></ol></li></ol> 4. Wartung von Gegründet Organoide / Epithelzellen Kolonien <ol><li> Bereiten Sie frisches Medium alle 2 Wochen und ersetzen Sie die Medien in der Zellkulturflasche 3-mal pro Woche. <ol><li> Platzieren 11 ml Medium in einem sterilen Behälter in 37° C für 20-30 min. Die Flasche aus dem Inkubator entfernen. Mit einem sterilen serologischen Pipette, entfernen und entsorgen Sie die konditionierte Medium aus dem Kolben, wobei Sie darauf achten, nicht die Organoiden stören. </li><li> Mit Hilfe einer neuen sterilen serologischen Pipette 11 ml des vorgewärmten frisches Medium. Sehr sanft drehen Sie den Kolben, um das Medium über die Flaschenoberfläche zu verteilen. Der Kolben wird bei 37 ° C in einer befeuchteten 5,0% CO 2 -Atmosphäre inkubiert. </li></ol></li><li> Nach von 10 - 14 Tagen in Kultur, entfernen alle Gewebestücke in der Kulturflasche, die nicht adhärenten sind. <ol><li> Periodisch Ernten der Zellen und / oder Organoide aus dem Kolben für eine Ausbreitung in neue Kulturflaschen für Xenograft-Transplantation oder zur phänotypischen und / oder molekulare Analyse. </li><li> Die Zellkulturflasche aus dem Inkubator entfernen. Sprühen Sie den Kolben, der mit 70% Ethanol. Wischen überschüssiges Ethanol zu dem Kolben mit einem sauberen Papiertuch, das mit 70% Ethanol besprüht wurde. </li><li> Organoid Vermehrung: &lt;ol&gt; <li> Öffnen Sie den Deckel der Flasche und legen Sie den Deckel offen in der biologischen Sicherheitsschrank. Unter mikroskopischer Visualisierung, suchen Sie die Organoid (n), geerntet werden. Verwenden Sie sterile Pinzette oder Zange zu Pick-up ein organoides. </li><li> Um die Organoid in einem neuen Kulturflasche zu propagieren, setzen Sie den Organoid im neuen Kolben. In 11 ml frischem, warmem Medium. Inkubieren bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre wie in den Schritten 3.3 - 3.6.3. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium in der Zellkulturflasche dreimal pro Woche. </li></ol></li><li> Ernten der Zellen: <ol><li> Unter direkte mikroskopische vixualization, vorsichtig abkratzen und saugen Zellen und mammospheres mit einem 1000 ul Pipette mit sterilen Einweg-Pipettenspitzen. Saugen Sie die Zellen und umgebenden Medium. Verzichten die Zellen / Medium in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> Dreh die Zellen kurz in einem Mini-Zentrifuge bei 12.100 xg für 5 sec. Entfernen und entsorgen Sie das Medium. &lt;ol&gt; <li> Zur DNA-Analyse, sofort gefrier das Zellpellet auf Trockeneis in einem kleinen Mediumvolumen (10 ul), mit langfristiger Lagerung bei -80 ° C. </li><li> Zur Proteomanalyse, lysieren die Zellen in 10 ul 8 M Harnstoff für die Massenspektrometrie oder 2x SDS Tris-Glycin-Puffer für Western Blot / Umkehrphasen-Protein-Microarrays. Alternativ drehen Zellen in einem Zytozentrifuge zu Zellabstriche zur immunhistochemischen Analyse zu machen. </li></ol></li><li> Nach dem Ernten von Zellen aus einem Kolben, entfernen und entsorgen Sie die restliche Medium. In 11 ml warmem, frisch nährstoffreichen Medium. Der Kolben wird bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebene Kultursystem stellt ein neues Modell für die Erzeugung leben präinvasiven neoplastischer Brustzellen für die Grundlagenforschung und translationale Forschung Studien. In der Vergangenheit hat prämalignen Brustkrebsprogression typischerweise unter Verwendung von drei verschiedenen Verfahren untersucht. Die erste Methode ist histopathologischen und genetischen Analyse mikrodisseziert gefroren oder festen Proben menschlichen 12-14. Die zweite Methode nutzt Mausmodellen, die hyperplastis...

Proliferation von Epithelzellen innerhalb der Grenzen der Milchgänge und Alveolen (duktale Carcinoma in situ) als obligate Vorläufer invasive duktale und lobuläre Mammakarzinom erkannt. Dennoch sind die molekularen Mechanismen und Zellpopulationsdynamik, die Progression zu einem invasiven Krebs erlauben kaum verstanden. Aufklärung der Überlebensmechanismen von pre-invasiven Brustkrebszellen, oder jede präinvasiven Tumor verwendet wird, kann therapeutische Strategien für das Töten oder sogar verhindern, pre-invasiven Neoplasien 1 offenbaren. Doch einfache Low-Cost-Methoden zur funktions Studium der menschlichen präinvasiven Läsionen haben gefehlt. Obwohl in vitro Monokultur von transformierten Zelllinien ist eine etablierte Labormethode, der Phänotyp und Genotyp dieser immortalisierten Zelllinien nicht die Molekular Status der primären menschlichen Tumorzellen 2 zu wiederholen. Selbst die nicht-tumor MCF-10A Zelllinie, die recapitulates 3-D Brustdrüse Architektur nicht die funktionellen Phänotyp und molekularen Eigenschaften des pre-invasive Brustläsion 3,4 einzelnen Patienten adäquat zu repräsentieren. Zu bestimmen, ob stielartigen neoplastischen Zellen fähig Invasion im duktalen Carcinoma in situ (DCIS) Zellpopulation existiert, eine Methodik entwickelt, die wir für das Sammeln und Kulti sterile menschlichen Brustgewebe zum Zeitpunkt der Operation (1) 5. Unsere ex vivo Brust organoiden Kultursystem nicht auf die enzymatische Gewebe-Zerstörung, Basalmembran-Matrix-Extrakt oder Fibroblasten Verarmungs verlassen, für Isolierung und Vermehrung mammosphere bildenden Zellen aus frischem menschlichen Brustkarzinomgewebe duktalen 6-8. Unser neues System ist auf dem Prinzip der Zelle Streaming / Migrations 5 basiert. Die erkennbaren Milchgänge, und die umliegenden Stroma sind in einem Mindestvolumen von Serum-freien Nährmedium (nur E tauchtnough die Kanalfragmente umfassen), um den Gasaustausch in keiner bestimmten Ausrichtung in den Kolben (1E-F) zu maximieren, mit der Schnittfläche des Kanals in das Kulturmedium ausgesetzt ist, aber. Dieses Kultursystem erlaubt den Zellen, aus dem Kanal und in / auf dem autologen Stroma und Kulturkolben migrieren. Das Nährmedium, nur Epidermal Growth Factor (EGF), Insulin und Antibiotika ergänzt, fördert das Wachstum von gemischten Zellpopulationen aus dem organoiden ausgeht. Die Gewebekulturflasche hat einen abnehmbaren, wiederverschließbaren Deckel, die Organoide und / oder Zellen ohne Unterbrechung der gesamte Kolben oder Nachbar Organoiden geerntet werden können, während eine sterile feuchten Umgebung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A405-P</td>
			<td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water, sterile filtered</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic disposable syringe, sterile</td>
			<td style="width:187px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2&#181;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin, human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11376497001</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GF144</td>
			<td>100&#181;g/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S1567</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G19114</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration flask and filter top, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>0.22&#181;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>4489</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4488</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:353px;">Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td>
			<td style="width:187px;">CDI</td>
			<td style="width:119px;">MD2000</td>
			<td style="width:365px;">after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cotton tipped applicators, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>23-400-115</td>
			<td>single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Gauze pads, 10x10cm, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td>
			<td style="width:187px;">Samco</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Vinegar, white distilled</td>
			<td style="width:187px;">household use</td>
			<td></td>
			<td style="width:365px;">5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">#10 scalpels, sterile, disposable&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>31-200-32&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">petri dish, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TPP 115cm2 flask, with removable lid</td>
			<td style="width:187px;">MidSci</td>
			<td style="width:119px;">90652</td>
			<td>screw cap with filter</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:353px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>5% CO2, 37 oC, humidified chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">inverted light microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olypmus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">8M urea</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-500</td>
			<td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2X SDS tris-glycine buffer</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>optional, for preparing cell smears</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

Breast duktalen Carcinoma in situ (DCIS), per Definition, ist die Proliferation von Tumor Epithelzellen innerhalb der Grenzen des Brustgang, ohne dass der kollagenen Basalmembran. Während DCIS ist eine nicht-invasive obligate Vorläufer Brustkrebs sind die molekularen Mechanismen und Zellpopulationen, die Progression zu einem invasiven Krebs gestatten nicht vollständig bekannt. Zu bestimmen, ob Vorläuferzellen, die Invasion im DCIS Zellpopulation existiert, haben wir eine Methode zum Sammeln und Kulti sterile menschlichen Brustgewebe zum Zeitpunkt der Operation, ohne die enzymatische Zerstörung von Gewebe. Sterile Brustgewebe enthält duktalen Segmente aus chirurgisch entfernt folgende Routine pathologische Untersuchung Brustgewebe geerntet. Tissue enthält DCIS wird in nährstoffreichen, antibiotikahaltigen, serumfreies Medium zur Gewebekulturlabor gebracht und transportiert. Das Brustgewebe wird weiter dissected, die verkalkten Stellen zu isolieren. Mehrere Brustgewebestücke (Organoiden) in einem minimalen Volumen von serumfreiem Medium in einem Kolben mit einem abnehmbaren Deckel und kultiviert in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator gegeben. Epithelialen und Fibroblasten-Zellpopulationen ergeben sich aus der Organoid nach 10-14 Tagen haben. Mammospheres spontan auf und um die epitheliale Zellschicht. Spezifische Zellpopulationen können direkt aus dem Kolben ohne Störung benachbarter Zellen geerntet werden. Unsere nicht-enzymatische Gewebekultursystem zuverlässig verrät zytogenetisch abnormal, invasive Vorläuferzellen aus frischen menschlichen DCIS Läsionen.

Workflow für die Beschaffung und das Kultivieren sterile Brust duktalen Carcinoma in situ Tissue Brustgewebe Sterilität aus dem Operationssaal in die Zellkulturlabor über geringfügige Änderungen in typischen Krankenhauspathologie Workflow (Abbildung 1) gehalten. Gewebe wird in einem sterilen Behälter mit einer Deckfolie, die radiologische Beurteilung ermöglicht unter Beibehaltung der Sterilität Gewebe transportiert. Gross Gewebeverarbeitung einer Brust Lumpekto...

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Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für&gt; 6 Monate.

Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Aufrufe.  George Mason University.  Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für> 6 Monate. 