Bu çalışma ile kısmen desteklenmiştir (1) Savunma Bakanlığı Meme Kanseri Araştırma Programı (US Army Medical Research Toplama Aktivitesi) # LAL için W81XVVH-10-1-0781 ve VE ödül ve (2) Susan G. Komen Vakfı hibe IR122224446 Lal ve VE etmek. Patoloji destek ve doku grossing nazik Inova Fairfax Patoloji Anabilim Dr. Hasan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, Dr. Charles Bechert&#39;in tarafından sağlandı. Hasta rızası ve örnek ihale ustalıkla Inova Fairfax Hastanesi&#39;nde klinik araştırma koordinatörleri Holly Gallimore Heather Huryk ve Emil Kamar tarafından yönlendiriliyordu.

İnsan meme dokusu Savunma Bölümü, George Mason University, ve Inova Sağlık Sistemi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından kabul protokollerini takip, bilgilendirilmiş yazılı onayı ile, bir araştırma çalışmasına dahil hastalardan toplanmıştır. 1. Büyüme Faktörleri ve Antibiyotikler Besin Zengin Orta hazırlayın <ol><li> Insülin stok çözeltileri, epidermal büyüme faktörü (EGF), streptomisin sülfat ve gentamisinsülfat hazırlayın. <ol><li> 10 mg / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar steril filtre edildi su içinde insülin sulandırın. Steril 10 ml tek kullanımlık şırınga Tip 1 reaktif dereceli su aspire 10 ml. Şırıngaya 0.22 mikron polietersülfon filtre takın. Steril bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine steril filtrelenmiş su koyun. </li><li> Insülin 100 mg&#39;lık bir şişeye, steril filtre edilmiş su, 10 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Buz üzerinde insülin flakon tutun. Insülin stok Solu 450 ul dağıtmak-20 ° C&#39;de etiketli, steril mikrosantrifüj tüpleri ve deposuna yon. İnsülin stok solüsyonu şişenin üzerindeki son kullanma tarihine kadar stabildir. </li><li> Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve bir stok çözelti hazırlayın: 500 ug, EGF (stok 1 mg / ml) 500 ul steril su ekle. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Buz üzerinde EGF şişesini tutun. <ol><li> EGF çalışan bir stok solüsyonu hazırlayın: 900 ul besin ortamında (çalışma stok / ul 0.1 ug olacaktır) için stok EGF çözüm 100 ul ekleyin. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. -80 ° C de, EGF çalışma stoğu etiketli, steril mikrosantrifüj tüpleri içine çözeltisi ve mağaza 50 ul koyun. Not: EGF stok çözeltisi (1 ug / ul) -80 ° C&#39;de 1 yıl stabildir; stok çözeltisi (0.1 ug / ul) çalışma -80 ° C &#39;de, 2 ay boyunca stabildir. </li></ol></li><li> Bir analitik terazi üzerinde streptomisin sülfat, 40 mg tartılır. Streptomisin sülfat int yerleştirinoa steril 15 ml konik tüp. Besleyici ortam 4 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Çözelti, hafif pembe olmalıdır. 4 ° C&#39;de saklayın ışıktan korunmalıdır. Streptomisin sülfat çözeltisi 7 gün süreyle stabildir. </li><li> Bir analitik terazi üzerinde gentamisin-sülfat ve 20 mg tartılır. Steril bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine gentamisin sülfat yerleştirin. Besleyici ortam 2 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Çözelti sarı olmalı. 4 ° C&#39;de saklayın ışıktan korunmalıdır. Gentamisin sülfat çözeltisi 7 gün süreyle stabildir. </li></ol></li><li> (20 (. 100 ug / ml nihai konsantrasyon), (. 10 ug / ml nihai kons), (. 10 ng / ml nihai kons) streptomisin sülfat insülin, insan rekombinant EGF ile takviye edilmiş bir besleyici ortam içinde iki adet 200 ml&#39;lik toplu hazırlayın ve gentamisinsülfat ug / ml final kons.). <ol><li> 0.2 um polietersülfon filtre şişesi ile donatılmış bir vakum filtre şişesi ve 250 ml&#39;lik bir alıcı şişeye 200 mi besin ortamı ilave edin. Ekleme 20 ve181. l çalışma stoğu, EGF, 200 ul stok insülin, 2 ml stok streptomisin sülfat ve besleyici ortam içinde 200 ml 400 ul stok gentamisin sülfat. Bir vakum filtre balon takın. Orta Filtre. Filtreyi atın ve &quot;zengin besin ortamı&quot; olarak şişesi etiket. 14 güne kadar, 4 ° C&#39;de depolayın. </li></ol></li></ol> 2. Doku Toplama ve Çok Satılan Uygulamalar <ol><li> Ameliyathanede, meme dokusu sağlandıktan sonra steril tekniği korumak. Steril bir tepsiye meme dokusunu yerleştirin ve steril plastik wrap ile tepsiyi örtün. <ol><li> Kurumunuz tarafından gerekli şekilde Radyoloji / Patoloji için kapalı tepsiye doku taşıyın. Tepsiyi açmayın. Ulaşım süreleri kurumlar içinde değişebilir. Doku kadar 45 dakika sonrası eksizyonu RT&#39;de bu kapalı tepsiye canlı kalabilir. Ancak, besin açısından zengin ortama doku istemi işleme sonraki organoid kültürü için en uygun koşulları sağlar. </li></ol></li><li> Brüt doku diseksiyonu meme dokusu içinde DCIS&#39;lı alanları tanımlamak için: doku kısırlık korumak için doku diseksiyonu sırasında steril eldiven, bıçak, neşter, doku işaretleme boyaları, ve sirke kullanın. <ol><li> % 70 etanol veya% 1 çamaşır suyu ile çalışma alanını temizleyin. Steril eldiven açın ve çalışma yüzeyine eldiven sarıcı yerleştirin. Eldiven sarıcı yüzü yukarı steril içini yerleştirin. Steril eldiven giyin. <ol><li> % 70 etanol ile örnek kabın yüzeyini temizleyin. Doku örneği kaptan plastik kaplamayı çıkarın ve eldiven sargı üzerinde numune yerleştirin. </li></ol></li><li> Doku işaretleme boyası içine iki pamuk uçlu bezlerden batırın. Doku yüzeyi boyunca bezlerden yuvarlayarak doku yüzeyine boya uygulanır. NOT: Her patoloji bölüm standart bir boya renk / doku yönlendirme protokolü vardır. Doku hastada konumu ile ilgili olarak doku yönlendirmek için boya ile etiketlenir. Boya lekelendi ya dadoku üzerine boyanmış. Doku üzerinde boya dökmeyin. Boya Dökme boya böylece cerrahi sınırların yönünü kafa karıştırıcı doku boşluklarına / çalıştırmak damla neden olabilir. Doku yönelim cerrah ve bir anatomik yerler ile patolog) doku örneği tanımlamak, ve b) tümör ile ilgili olarak cerrahi sınırların yerini belirlemek sağlar. </li><li> Steril gazlı bez üzerine damıtılmış beyaz sirke (% 5 asetik asit) dökün. Sirke batırılmış gazlı bez ile boyanmış doku kurulayın. Gazlı bez atın. Sirke boyalar işaretleme dokuyu düzeltmek için kullanılır. </li><li> Yaklaşık 5 mm kalınlığında dikey dilimler halinde meme dokusunu kesti. Doku (Şekil 2) aracılığıyla tüm yol kesmeyin. / Gözlemlemek kalsifikasyon alanları için doku palpe. Kendi karakteristik firması tarafından DCIS belirlemek, kırmızımsı çevrili görünüm soluk, (nedeniyle kalsiyum spikülleri için) cesur hissediyorum lastik sınırları. NOT: Bazı durumlarda, komedondur (sivilce gibi) alanlar olabilirBüyük çaplı DCIS lezyonlarında nekrotik malzemeyi temsil eden beyaz noktalar olarak görülmektedir. </li><li> Meme dokusunu çevreleyen küçük bir miktar da dahil olmak üzere, DCIS / kalsifiye meme dokusunu kesip. Aşama 1 &#39;de hazırlanan besleyici zengin ortam 20-30 ml ihtiva eden steril bir 50 ml tüp içine meme dokusu yerleştirin. <ol><li> Yavaşça tüpü birkaç kez ters yüz edilerek doku ve orta karıştırın. Orta atın ve taze orta ekleyin. Izole edilmiş bir kap içine doku ve ortam ihtiva eden tüp yerleştirilir ve doku kültürü laboratuara doku taşımak. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Doku Kültürü <ol><li> Biyolojik güvenlik kabininde çalışan doku ve steril bir Petri kabı içine besleyici ortam küçük bir miktar dökün. Steril bir neşter kesip ve fibröz doku atın kullanma. Adet (organoids) içine meme dokusunu yaklaşık 3 mm 2 (Şekil 1C-D) kesti. Doku kesmek için çalışın, böylece her organOSB çevreleyen stroma sahip en azından bir ayırd edilebilir kanal segmenti ihtiva eder. </li><li> Doku kültür şişesi kapağını açın. Steril cımbız veya forseps kullanılarak, şişeye organoids yerleştirin. Kapağı kapatın. Petri atın. </li><li> Doku kültür şişesine 11 mi serumsuz besin yönünden zengin ortam (aşama 1 &#39;de hazırlandı) ekleyin. Şişeyi kapatın ve organoids ve orta eşit kap yüzeyinden (Şekil 1E-F) arasında dağıtılır böylece balon girdap. </li><li> 2 gün boyunca nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. Bu süre boyunca bir balon içinde hareket ettirmeyin. </li><li> Gün 2 sonrası inkübasyon, potansiyel bakteri / mantar kontaminasyonu kontrol etmek için inkübatör şişeyi çıkarın. Şişenin ani, keskin hareketler, ya da türbülans kaçının. Ters bir mikroskop sahnede şişesi yerleştirin. <ol><li> Bakteri, maya ve / veya mantar için orta dikkate alınmalıdır. Herhangi bir kirlenme tespit edilirse, bir eklenti için inkübatör şişeyi geriitional gün. Kirlenme tespit edilirse, uygun bir kap içinde bir balon içinde ve içindekileri atmak. </li></ol></li><li> 3. günde enkübasyonunda, taze ortam ile koşullandırılmış bir ortam değiştirin. <ol><li> 20-30 dakika süre ile 37 ° C &#39;de, bir steril tüp içine ortamı 11 ml yerleştirin. Inkübatör doku kültür şişesi çıkarın. Organoids bozmadan çıkarın ve steril bir serolojik pipet kullanarak şişeye içinde orta atın. </li><li> Yeni bir steril serolojik pipet kullanarak, önceden ısıtılmış taze ortam 11 ml ilave ediniz. Çok yumuşak, şişe yüzeyi boyunca orta dağıtmak üzere şişe döndürün. </li><li> Nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li></ol></li></ol> Kurulmuş organoid / Epitel Hücre Kolonileri 4. Bakım <ol><li> Her 2 haftada bir taze ortamı hazırlayın ve doku kültürü şişesinde haftada 3 kez ortamı değiştirin. <ol><li> 37 ° C&#39;de steril bir kap içinde ortam 11 ml yerleştirin20-30 dakika süreyle ° C. Inkübatör şişeyi çıkarın. Steril bir serolojik pipet kullanarak, kaldırmak ve organoids rahatsız etmemek için dikkatli olmak şişesi klimalı ortam atın. </li><li> Yeni bir steril serolojik pipet kullanarak, önceden ısıtılmış taze ortam 11 ml ilave ediniz. Çok yumuşak, şişe yüzeyi boyunca orta dağıtmak üzere şişe döndürün. Nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li></ol></li><li> 10 sonra, - 14 günlük kültür, yapışkan olmayan bir kültür şişesi içinde doku parçaları alın. <ol><li> Ksenograft transplantasyon için periyodik olarak hasat hücreleri ve / veya yeni kültür şişelerine yayılması için şişeden organoids, ya da fenotipik ve / veya moleküler analiz için. </li><li> Inkübatör doku kültür şişesi çıkarın. % 70 etanol ile balonun püskürtün. % 70 etanol ile püskürtülür olmuştur temiz bir kağıt havlu ile balona aşırı etanol silin. </li><li> Organoid yayılımı: &lt;ol&gt; <li> Şişenin kapağını açın ve biyolojik güvenlik kabini kapak yüzü yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Mikroskopik görüntüleme altında, organoid (ler) hasat edilmesi bulun. Pick-up için bir organoid steril cımbız veya forseps kullanın. </li><li> Yeni bir kültür şişesi içinde organoid yaymak için, yeni bir şişede organoid yerleştirin. 11 ml taze, sıcak orta ekleyin. 3.6.3 - adımda 3.3 de tarif edildiği gibi, bir nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Doku kültüründe, hücre kültür ortamı haftada üç kez şişe yerleştirin. </li></ol></li><li> Hücrelerin hasat: <ol><li> Direkt mikroskobik vixualization altında, hafifçe kazıyın ve aspire hücreler ve mammospheres steril tek kullanımlık pipet uçları ile 1000 ul pipet kullanarak. Hücreleri ve çevresindeki ortam aspire. Steril mikrosantrifüj tüpü içine hücre / orta koyun. </li></ol></li><li> 5 saniye boyunca 12.100 xg&#39;de mini-santrifüj kısaca hücreleri Spin. Çıkarın ve orta atın. &lt;ol&gt; <li> DNA analizi için hemen -80 ° C &#39;de, uzun süreli saklama, ortam (10 ul), küçük bir hacim içinde, kuru buz üzerinde hücre pelletini dondurma. </li><li> Proteomik analizi, kütle spektrometrisi veya batı benekleme / ters fazlı protein mikrodizilerinin 2x SDS Tris-glisin tamponu 8 M üre, 10 ml içinde hücreler lize edildi. Alternatif olarak, immünohistokimyasal analizi için hücre smear yapmak için bir Sitosantrifüj hücreleri dönerler. </li></ol></li><li> Bir şişeye hücreleri hasat ettikten sonra, kaldırmak ve kalan orta atın. Sıcak, taze besin zengin ortamdan 11 ml ekleyin. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shaughnessy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+intraepithelial+neoplasia:+an+important+target+for+accelerated+new+agent+development.">Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development.</a> Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+precursor+cells+pre-exist+in+human+breast+DCIS+and+require+autophagy+for+survival.">Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival.</a> PLoS One. 5 (4), (2010).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Farnie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+technique+for+primary+ductal+carcinoma+in+situ:+role+of+Notch+and+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+pathways.">Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways.</a> J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).</li><li>Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+collagen+requirements+for+attachment+and+growth+of+mammary+epithelium.">Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium.</a> Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).</li><li>Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+malignant+nature+of+human+ductal+carcinoma+in+situ.">What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ.</a> Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin+1+and+autophagy+are+required+for+the+tumorigenicity+of+breast+cancer+stem-like/progenitor+cells.">Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells.</a> Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).</li><li>Simon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+glycoprotein+is+a+member+of+a+family+of+epithelial+cell+surface+antigens+homologous+to+nidogen,+a+matrix+adhesion+protein.">Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein.</a> PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).</li><li>Ma, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+human+breast+cancer+progression.">Gene expression profiles of human breast cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).</li><li>Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+prognostic+index+for+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.+Are+we+there+yet.">Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet.</a> Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).</li><li>Sgroi, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+breast+cancer.">Preinvasive breast cancer.</a> Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).</li><li>Asch, H. L., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+keratin+expression+in+mouse+mammary+hyperplastic+alveolar+nodules+and+adenocarcinomas.">Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas.</a> Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).</li><li>LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+microenvironments+and+mammary+stem+cells.">Of microenvironments and mammary stem cells.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).</li><li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity.">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+picture+of+the+mouse+mammary+stem+cell.">The emerging picture of the mouse mammary stem cell.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cap+associated+focal+adhesions+and+their+distinct+role+in+cellular+mechanosensing.">Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing.</a> Sci Rep. 2, 555 (2012).</li><li>Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attacking+breast+cancer+at+the+preinvasion+stage+by+targeting+autophagy.">Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy.</a> Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).</li><li>D'amonte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+behavior+is+programmed+in+the+precancer+stem+cell.">Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif kültür sistemi temel ve translasyonel araştırma çalışmaları için yaşayan pre-invaziv neoplastik meme hücreleri üretmek için yeni bir model oluşturmaktadır. Geçmişte, pre-malignan göğüs kanserindeki ilerlemeler, tipik olarak üç farklı yöntem kullanılarak incelenmiştir. İlk yöntem histopatolojik ve microdissected dondurulmuş veya sabit insan örneklerinin 12-14 genetik analizi. İkinci yöntem, insan pre-invaziv meme lezyonlarının 15 benzer olduğu düşün...

Meme kanalları ve alveollere (in situ duktal karsinom) sınırları içinde epitel hücrelerinin çoğalması invaziv duktal ve lobüler meme kanserine bağlı zorunlu bir habercisi olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, invaziv kansere ilerlemesinin izin moleküler mekanizmalar ve hücre popülasyon dinamiği tam olarak anlaşılamamıştır. Önceden istilacı meme karsinomu hücreleri veya herhangi bir ön-invaziv tümör tarafından kullanılan hayatta kalma mekanizmalarını, açıklık getirecek öldürme, ya da, ön-invazif neoplazmaların 1 önlenmesi için tedavi stratejileri ortaya çıkarabilir. Ancak, işlevsel okuyan insan pre-invaziv lezyonlar için düşük maliyetli basit yöntemler eksik edilmiştir. Dönüştürülmüş hücre çizgileri in vitro tek tabakalı kültürü oluşturulmuş bir laboratuar yöntemi olup, bu ölümsüz kılınmış hücre kuşaklarının fenotip ve genotip olsa da, birincil insan tümör hücreleri 2 moleküler durumunu özetlemek için başarısız olur. Bunun da ötesinde, Tümörjenik MCF-10A hücre hattı, burada recapitulates 3-D meme bezi mimarisi, yeterince fonksiyonel fenotip ve bireysel bir hastanın pre-invaziv meme lezyonu 3,4 moleküler özelliklerini yansıtmamaktadır. Işgalinin yeteneğine kök benzeri neoplastik hücrelerin in situ (DCIS) hücre popülasyonunda duktal karsinom içinde mevcut olup olmadığını belirlemek için, (Şekil 1) 5 toplanması ve cerrahi sırasında steril insan meme dokusu kültürü için bir yöntem geliştirdi. Bizim ex vivo meme organoid kültür sistemi izole ve taze insan meme duktal karsinoma dokusunun 6-8 mammosphere oluşturan hücrelerin çoğaltılmasına yönelik, enzimatik doku bozulması, bazal membran ekstresi matris veya fibroblast tükenmesine dayanmaz. Yeni sistem, hücre akış / göç 5 esasına dayanır. Fark meme kanalı, ve çevresindeki stromal serumsuz Besleyici ortam (sadece e ait minimum bir hacmi içinde batıkKültür ortamının etkisine maruz kalan kanal kesme yüzeyi ile, gaz alış-verişini en üst düzeye çıkarmak, ama şişenin (Şekil 1E-F) belli bir yön olarak) kanal parçalarını kapsayacak şekilde nough. Bu kültür sistemi hücreleri otolog stroma ve kültür şişesi üzerine kanalın dışına ve / &#39;a taşımasına olanak tanır. Sadece Epidermal Büyüme Faktörü (EGF), insülin ve antibiyotikler ile takviye edilmiş bir besin ortamı, organoid çıkan karma hücre popülasyonlarının büyümesini desteklemektedir. Doku kültürü şişesi Steril nemlendirilmiş bir ortamı muhafaza ederken, organoids ve / veya hücreler tüm şişe veya komşu organoids bozmadan hasat edilmesine olanak tanıyan çıkartılabilir, tekrar kapatılabilen bir kapak yer alır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A405-P</td>
			<td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water, sterile filtered</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic disposable syringe, sterile</td>
			<td style="width:187px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2&#181;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin, human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11376497001</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GF144</td>
			<td>100&#181;g/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S1567</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G19114</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration flask and filter top, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>0.22&#181;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>4489</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4488</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:353px;">Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td>
			<td style="width:187px;">CDI</td>
			<td style="width:119px;">MD2000</td>
			<td style="width:365px;">after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cotton tipped applicators, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>23-400-115</td>
			<td>single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Gauze pads, 10x10cm, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td>
			<td style="width:187px;">Samco</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Vinegar, white distilled</td>
			<td style="width:187px;">household use</td>
			<td></td>
			<td style="width:365px;">5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">#10 scalpels, sterile, disposable&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>31-200-32&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">petri dish, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TPP 115cm2 flask, with removable lid</td>
			<td style="width:187px;">MidSci</td>
			<td style="width:119px;">90652</td>
			<td>screw cap with filter</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:353px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>5% CO2, 37 oC, humidified chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">inverted light microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olypmus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">8M urea</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-500</td>
			<td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2X SDS tris-glycine buffer</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>optional, for preparing cell smears</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

In situ (DCIS) Meme duktal karsinom, tanımı gereği, kollajenöz bazal membran ihlal etmeden, meme kanalının sınırları içinde neoplastik epitel hücrelerinin proliferasyonudur. DCIS invaziv meme kanserleri olmayan bir zorunlu habercisi iken, invaziv kansere ilerlemesinin izin moleküler mekanizmalar ve hücre popülasyonları tam olarak bilinmemektedir. Işgalinin yeteneğine progenitör hücrelerin DCIS hücre popülasyonu içinde mevcut olup olmadığını belirlemek için, doku enzimatik bozulma olmadan, ameliyat sırasında steril insan meme dokusu toplanması ve kültürü için bir yöntem geliştirdi. Duktal segmentleri içeren steril meme dokusu rutin patolojik incelemede aşağıdaki cerrahi olarak çıkarıldı meme dokusu hasat edilir. DCIS ihtiva eden doku, doku kültürü laboratuara besin yönünden zengin, antibiyotik içeren, serumsuz ortama yerleştirilebilir, ve nakledilir. Meme dokusu daha dissecte olduğunud kalsifiye alanları izole etmek. Birden fazla meme dokusu parçaları (organoids) nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde çıkarılabilir bir kapak ve kültürlenmiş olan bir şişe içinde, serum barındırmayan ortam içinde en az bir hacim içinde yerleştirilir. 14 gün - epitel ve fibroblast hücre popülasyonları 10 sonra organoid ortaya. Kendiliğinden oluşan ve epitel hücre tek tabaka etrafında Mammospheres. Özgül hücre popülasyonları arasında, komşu hücreleri bozmadan şişeden doğrudan hasat edilebilir. Bizim enzimatik olmayan doku kültürü sistemi, güvenilir taze insan DCIS lezyonlarında gelen sitogenetik anormal, invaziv ata hücreleri ortaya koymaktadır.

Yerinde dokusunda steril meme duktal karsinom tedarik ve kültürleme için iş akışı Meme dokusu kısırlık tipik bir hastane patoloji iş akışı içinde küçük değişiklikler (Şekil 1) üzerinden hücre kültürü laboratuvara ameliyathane muhafaza ediliyor. Doku doku sterilite korurken radyolojik değerlendirmesi izin veren bir plastik film kapağı ile steril bir kaba taşınır. Bir göğüs lumpektomi veya mastektomi numunenin brüt mendil steril eldive...

Watch this Scientific Journal Video about Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres at JoVE.com

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Görüntüleme.  George Mason University.  Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids> 6 ay için geçerli kalır. 