עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי (1) שד משרד ההגנה תכנית לחקר סרטן (צבא ארה&quot;ב למחקר רפואי רכישת פעילות) הפרס # W81XVVH-10-1-0781 לLAL וVE, ו- (2) מענק סוזן ג &#39;קומן הקרן IR122224446 לאל וVE. תמיכת פתולוגיה וגילום רקמה סופקו באדיבות על ידי Inova Fairfax פתולוגיה מחלקה, ד&quot;ר חסן נייער, ד&quot;ר גיתה א מנזס, ודר &#39;צ&#39;ארלס בכרט. הסכמת מטופל ורכש מדגם מודרך במומחיות על ידי רכזי מחקר קליני Inova Fairfax בית החולים הולי Gallimore, הת&#39;ר Huryk, ואמיל קמר.

רקמת שד אנושית שנאספו מחולים שהשתתפו במחקר, עם סכמה בכתב הודיעה, לאחר משרד הגנה, אוניברסיטת ג&#39;ורג &#39;מייסון, והפרוטוקולים המאושרים של מערכת בריאות Inova Institutional Review Board. 1. הכנת תזונתי עשיר בינוני עם גורמי גדילה ואנטיביוטיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות של אינסולין, גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), סולפט סטרפטומיצין סולפט גנטמיצין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש אינסולין במים מסוננים סטרילי לריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מיליליטר. לשאוב 10 מיליליטר של מים כיתה מגיב מסוג 1 במזרק חד פעמי 10 מיליליטר סטרילי. צרף מסנן 0.22 מיקרומטר polyethersulfone למזרק. לוותר מים המסוננים סטרילי לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של מים מסוננים סטרילי לבקבוקון 100 מ&quot;ג של אינסולין. מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. שמור את בקבוקון האינסולין על קרח. לוותר 450 μl של מניית אינסולין solution לכותרת, צינורות סטרילית microcentrifuge ולאחסן ב -20 ° C. פתרון מניות אינסולין הוא יציב עד לתאריך התפוגה על הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF): הוסף 500 μl מים סטריליים 500 מיקרוגרם EGF (1 מיקרוגרם / μl מלאי). מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. שמור את בקבוקון EGF על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות חוזר של EGF: הוסף של פתרון EGF המניה 100 μl 900 בינוני מזין μl (מלאי עבודה יהיה 0.1 מיקרוגרם / μl). מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. לוותר 50 μl של פתרון EGF עובד המניות שלכותרתו צינורות microcentrifuge סטרילי, ולאחסן ב -80 ° C. הערה: פתרון מניות EGF (1 מיקרוגרם / μl) הוא יציב במשך השנה 1 ב -80 מעלות צלזיוס; עובד פתרון מניות (0.1 מיקרוגרם / μl) הוא יציב במשך 2 חודשים ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 40 מ&quot;ג של סולפט סטרפטומיצין על איזון אנליטיים. הנח את int סולפט סטרפטומיציןOA 15 מיליליטר סטרילי צינור חרוטי. הוסף 4 מיליליטר של מדיום מזין. מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. הפתרון צריך להיות ורוד במקצת. חנות ב 4 ° C מוגנת מפני אור. פתרון סולפט סטרפטומיצין יציב למשך 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 20 מ&quot;ג של סולפט גנטמיצין על איזון אנליטיים. הנח את סולפט גנטמיצין לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי. הוסף 2 מיליליטר של מדיום מזין. מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. הפתרון צריך להיות צהוב. חנות ב 4 ° C מוגנת מפני אור. פתרון סולפט גנטמיצין יציב למשך 7 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני 200 מיליליטר קבוצות של מדיום מזין בתוספת EGF האנושי רקומביננטי (10 ng / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.), אינסולין (10 מיקרוגרם / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.), סולפט סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.) וסולפט גנטמיצין (20 מיקרוגרם / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני 200 מיליליטר מזין בבקבוק מסנן אבק מצויד בבקבוק 0.2 מיקרומטר לסנן polyethersulfone ובקבוק שקיבל 250 מיליליטר. הוסף 20 &amp;181 #; המניה עובדת l EGF, 200 אינסולין μl מניות, 2 מיליליטר סולפט סטרפטומיצין המניות, ו -400 סולפט גנטמיצין מניית μl ל-200 מיליליטר של מדיום מזין. צרף את בקבוק המסנן לואקום. סינון הבינוני. מחק את המסנן ואת תווית הבקבוק כמו &quot;מדיום עשיר מזין&quot;. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 14 ימים. </li></ol></li></ol> 2. רקמות רכישה וגילום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוויטת ההפעלה, לשמור על טכניקה סטרילית אחרי רכישת רקמת השד. הנח את רקמת השד במגש סטרילי ולכסות את המגש בניילון הנצמד סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הרקמה במגש המכוסה לרדיולוגיה / פתולוגיה כנדרש במוסד שלך. אל תפתחו את המגש. פעמים תחבורה להשתנות בתוך מוסדות. רקמה יכולה להישאר קיימא במגש מכוסה זה ב RT להודעה כריתה עד 45 דקות. עם זאת, עיבוד מהיר של הרקמה לתוך מדיום עשיר מזין מספק תנאים אופטימליים לתרבות organoid שלאחר מכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיחת רקמות ברוטו לזהות אזורים של DCIS בתוך רקמת השד: השתמש בכפפות סטריליות, להבים, אזמלים, צבעי סימון רקמה, וחומץ בנתיחת רקמה לרקמה לשמור על סטריליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את אזור העבודה עם אתנול 70% או אקונומיקה 1%. פתח את כפפות סטריליות ולמקם את עטיפת הכפפה על משטח העבודה. הנח את הפנים סטרילי של עטיפת כפפה עם הפנים כלפי מעלה. לשים על כפפות סטריליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את פני השטח של מיכל הדגימה עם 70% אתנול. הסר את עטיפת הפלסטיק מיכל דגימת הרקמה ומקום הדגימה על עטיפת הכפפה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים צמר הטה שתי כותנה לצבע הרקמה לציון. החל הצבע אל פני השטח של הרקמה על ידי גלגול ספוגיות על פני הרקמה. הערה: כל מחלקה הפתולוגית יש פרוטוקול נטייה צבע לצבוע / רקמה סטנדרטית. רקמה מסומנת בצבע כדי לכוון את הרקמה ביחס לעמדתה בסבלנות. או לצבוע נמחקצייר על הרקמה. אין לשפוך הצבע על הרקמות. לשפוך הצבע יכול לגרום לצבע לרוץ / לטפטף לתוך נקיקי רקמות ובכך מבלבלים את הכיוון של שוליים ניתוחיים. נטייה רקמה מספקת למנתח ופתולוג עם ציוני אנטומיים ל) מתאר את דגימת הרקמות, ו ב) לקבוע את המיקום של השוליים הניתוחיים ביחס לגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים חומץ לבן מזוקק (5% חומצה אצטית) על פדה גזת סטרילי. למחוק את הרקמה צבועה עם הגזה ספוגה בחומץ. מחק את הגזה. חומץ משמש כדי לתקן רקמת סימון צבעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את רקמת השד לפרוסות אנכיות כ 5 מ&quot;מ עובי. לא לחתוך את כל הדרך דרך הרקמה (איור 2). שים לב / למשש את הרקמה לאזורים של הסתיידות. לזהות נגעי DCIS על ידי משרד עורכי האופייניים שלהם, חיוור הופעה מוקפת אדמדם, גבולות גומי שמרגישים גרגירי (עקב spicules סידן). הערה: במקרים מסוימים, comedo אזורים (כמו פצעון) יכולים להיותנתפס כנקודות לבנות, המייצגות את חומר נימקי מנגעי DCIS בקוטר גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור תחומי DCIS / רקמת שד מסוידת, כולל כמות קטנה של רקמה הסובבת שד. הנח את רקמת השד לתוך צינור 50 מיליליטר סטרילי המכיל 20-30 מיליליטר של מדיום עשיר מזין מוכן בשלב 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הרקמה ובינוני על ידי בעדינות את צינור היפוך מספר פעמים. מחק את בינוני ומוסיף בינוניים טרי. מניחים את הצינור המכיל את הרקמה ובינוני למכל מבודד ולהעביר את הרקמה למעבדה תרבית רקמה. </li></ol></li></ol></li></ol> תרבות 3. רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , עובד בארון בטיחות ביולוגי לשפוך הרקמה וכמות קטנה של המדיום מזין לתוך צלחת פטרי סטרילית. באמצעות אזמל סטרילי לחתוך ולסלק את הרקמה הסיבית. חותך את רקמת השד לחתיכות (organoids) כ 3 מ&quot;מ 2 (איור 1 ג-ד). נסה לחתוך את הרקמה, כך שכל איברOID מכיל קטע צינור להבחין לפחות אחד עם סטרומה שמסביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את המכסה של הבקבוק בתרבית הרקמה. בעזרת פינצטה או מלקחיים סטריליות, למקם את organoids לתוך הבקבוק. סגור את המכסה. מחק את צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני 11 מיליליטר מזין סרום ללא עשיר (מוכן בשלב 1) לבקבוק תרבית רקמה. סגור את הבקבוק ולערבל את הבקבוק כך organoids והבינוני מפוזרים באופן שווה על פני הבקבוק (איור 1E-F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס באווירת CO humidified 5.0% 2 במשך 2 ימים. אל תזיז את הבקבוק בזמן הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 לאחר דגירה על, להסיר את הבקבוק מן החממה כדי לבדוק זיהום פטרייתי / חיידקים פוטנציאליים. הימנע פתאומי, תנועות חדות, או מתערבל של הבקבוק. הנח את הבקבוק על במה מיקרוסקופ הפוכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב למדיום לחיידקים, שמרים, ו / או פטרייה. אם אין זיהום יצוין, להחזיר את הבקבוק לחממה לתוספתיום itional. אם הזיהום יצוין, להשליך את הבקבוק ותכנים במכל מתאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 לאחר דגירה על, להחליף את המדיום המותנה עם מדיום חדש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 11 מיליליטר של מדיום בצינור סטרילי על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-30 דקות. הסר את בקבוק תרבות רקמה מן החממה. מבלי להפריע את organoids, להסיר ולסלק הבינוני בבקבוק בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי חדשה, להוסיף 11 מיליליטר של המדיום הטרי מראש חימם. מאוד בעדינות לסובב את הבקבוק כדי להפיץ את המדיום על פני הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס ב5.0% אווירת CO 2 humidified. </li></ol></li></ol> 4. תחזוקה של מושבות תאי Organoid / אפיתל הוקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום טרי כל 2 שבועות ולהחליף את התקשורת בבקבוק תרבות הרקמה 3 פעמים בשבוע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 11 מיליליטר של מדיום במכל סטרילי ב 37° C במשך 20-30 דקות. הסר את הבקבוק מן החממה. בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי, להסיר ולסלק בינוני המותנה מהבקבוק, נזהר שלא להפריע organoids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי חדשה, להוסיף 11 מיליליטר של המדיום הטרי מראש חימם. מאוד בעדינות לסובב את הבקבוק כדי להפיץ את המדיום על פני הבקבוק. דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס ב5.0% אווירת CO 2 humidified. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10-14 ימים בתרבות, להסיר כל חתיכות של רקמות בבקבוק התרבות שאינן חסיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מעת לעת קציר ו / או organoids מהבקבוק להתפשטות לתוך צלוחיות תרבות חדשות, להשתלת xenograft, או לפנוטיפי ו / או ניתוח מולקולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בקבוק תרבות רקמה מן החממה. תרסיס הבקבוק עם אתנול 70%. נגב את אתנול עודף על הבקבוק עם מגבת נייר נקייה שרוססה עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות Organoid: &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את המכסה של הבקבוק ולשים את המכסה כלפי מעלה בארון הבטיחות הביולוגי. תחת להדמיה מיקרוסקופית, לאתר את organoid (ים) להיות שנקטפו. להשתמש בפינצטה או מלקחיים סטריליות לאיסוף organoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפיץ organoid בבקבוק תרבות חדש, מקום organoid בבקבוק החדש. הוסף בינוני טרי, חם 11 מיליליטר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, באווירת 5% CO 2 humidified כמתואר בשלבים 3.3 - 3.6.3. החלף את מדיום תרבית תאים בתרבית רקמת בקבוקון שלוש פעמים בשבוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת vixualization המיקרוסקופי ישיר, בעדינות לגרד ותאים לשאוב וmammospheres באמצעות פיפטה 1,000 μl עם טיפים פיפטה חד פעמי סטרילי. לשאוב את התאים ובינוניים שמסביב. לוותר תאים / בינוני לתוך צינור microcentrifuge סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים לזמן קצר במיני-צנטריפוגות ב XG 12,100 במשך 5 שניות. להסיר ולסלק הבינוני. &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח ה- DNA, להקפיא באופן מיידי את התא גלולה בקרח יבש, בנפח קטן של מדיום (10 μl), עם אחסון לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח proteomic, lyse התאים 10 μl של 8 מ &#39;אוריאה לספקטרומטר מסה או חיץ טריס-גליצין 2x SDS סופגים / microarrays חלבון המערבי הפוך שלב. לחלופין, ספין תאים בcytocentrifuge לעשות מריחות תא לניתוח immunohistochemical. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קצירת תאים מבקבוק, להסיר ולסלק בינוניים שנותר. להוסיף 11 מיליליטר של מדיום עשיר חם, מזין טרי. דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס, באווירת 5% CO 2 humidified. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shaughnessy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+intraepithelial+neoplasia:+an+important+target+for+accelerated+new+agent+development.">Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development.</a> Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+precursor+cells+pre-exist+in+human+breast+DCIS+and+require+autophagy+for+survival.">Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival.</a> PLoS One. 5 (4), (2010).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Farnie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+technique+for+primary+ductal+carcinoma+in+situ:+role+of+Notch+and+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+pathways.">Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways.</a> J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).</li><li>Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+collagen+requirements+for+attachment+and+growth+of+mammary+epithelium.">Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium.</a> Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).</li><li>Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+malignant+nature+of+human+ductal+carcinoma+in+situ.">What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ.</a> Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin+1+and+autophagy+are+required+for+the+tumorigenicity+of+breast+cancer+stem-like/progenitor+cells.">Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells.</a> Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).</li><li>Simon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+glycoprotein+is+a+member+of+a+family+of+epithelial+cell+surface+antigens+homologous+to+nidogen,+a+matrix+adhesion+protein.">Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein.</a> PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).</li><li>Ma, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+human+breast+cancer+progression.">Gene expression profiles of human breast cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).</li><li>Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+prognostic+index+for+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.+Are+we+there+yet.">Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet.</a> Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).</li><li>Sgroi, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+breast+cancer.">Preinvasive breast cancer.</a> Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).</li><li>Asch, H. L., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+keratin+expression+in+mouse+mammary+hyperplastic+alveolar+nodules+and+adenocarcinomas.">Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas.</a> Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).</li><li>LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+microenvironments+and+mammary+stem+cells.">Of microenvironments and mammary stem cells.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).</li><li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity.">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+picture+of+the+mouse+mammary+stem+cell.">The emerging picture of the mouse mammary stem cell.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cap+associated+focal+adhesions+and+their+distinct+role+in+cellular+mechanosensing.">Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing.</a> Sci Rep. 2, 555 (2012).</li><li>Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attacking+breast+cancer+at+the+preinvasion+stage+by+targeting+autophagy.">Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy.</a> Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).</li><li>D'amonte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+behavior+is+programmed+in+the+precancer+stem+cell.">Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

מערכת התרבות המתוארת כאן מהווה מודל חדש ליצירת תאי גידולים קדם-פולשנית המתגוררים שד למחקרים בסיסיים וtranslational. בעבר, התקדמות סרטן השד טרום ממארת יש בדרך כלל נחקרה תוך שימוש בשלוש שיטות שונות. השיטה הראשונה היא היסטופתולוגיות וניתוח גנטי של דגימות אנושיות קפוא או קבוע...

התפשטות של תאי האפיתל בתחומי צינוריות שד וalveoli (קרצינומה ductal באתר) מוכרת כמבשר מחייב לductal פולשני וסרטן השד לובולרי. עם זאת, המנגנונים המולקולריים ודינמיקה של אוכלוסיות תאים המאפשרים התקדמות לסרטן פולשני הם הבינו היטב. הבהרת מנגנוני ההישרדות בשימוש על ידי תאים טרום-פולשנית סרטן השד, או כל גידול טרום פולשני, עשויה לחשוף אסטרטגיות טיפוליות להריגה, או אפילו מניעה, שאתות מראש פולשנית 1. עם זאת, שיטות עלות נמוכה פשוטות לנגעים טרום-פולשנית אנושיות תפקודי לומדים כבר חסרות. למרות שתרבות monolayer במבחנה של שורות תאים הפכו שיטת מעבדה הוקמה, פנוטיפ לבין הגנוטיפ של שורות תאים הונצחו אלה נכשל לשחזר את המצב המולקולרי של תאים סרטניים אנושיים ראשוניים 2. יתר על כן, אפילו שורת התאים שאינם סרטנית MCF-10A, שrecapitulates 3-D ארכיטקטורת בלוטת החלב, לא מייצגת את הפנוטיפ הפונקציונלי ומאפיינים מולקולריים של נגע השד מראש פולשנית של המטופל 3,4 כראוי. כדי לקבוע אם תאי גידולים כמו גזע מסוגלים פלישה היו קיימים בתוך קרצינומה ductal באתרו (DCIS) אוכלוסיית תאים, שפתחנו מתודולוגיה לאיסוף וculturing רקמת שד האנושי סטרילי בזמן הניתוח (איור 1) 5. ex vivo מערכת תרבות organoid השד שלנו אינה מסתמכת על הפרעה אנזימטית רקמה, מטריצת תמצית קרום במרתף, או דלדול פיברובלסטים, לבידוד ומתפשט תאי יוצרי mammosphere מרקמת קרצינומה ductal שד האנושי הטרי 6-8. המערכת החדשה שלנו מבוססת על העיקרון של הזרמה / נדידת תאי 5. הצינורות ניכרו השד, וסטרומה מסביב שקועים בהיקף מינימאלי של מדיום מזין סרום ללא (רק דוארnough כדי לכסות את שברי הצינור) על מנת למקסם את חילוף גזים, עם פני השטח החתך של הצינור נחשף לתרבות בינונית, אבל בשום כיוון מסוים בבקבוק (איור 1E-F). מערכת זו התרבות מאפשרת לתאים לנדוד אל מחוץ לצינור ול/ על בקבוק סטרומה ותרבות אוטולוגי. בינוני המזין, בתוספת רק עם עוריות Growth Factor (EGF), אינסולין, ואנטיביוטיקה, תומך בצמיחה של אוכלוסיות תאים מעורבות שנכללו בגין את organoid. יש בקבוק תרבות רקמת מכסה המאפשר organoids ו / או התאים להיות שנקטפו מבלי לשבש את organoids הבקבוק או השכן כל, תוך שמירה על סביבת humidified סטרילי נשלף, מחדש סגר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A405-P</td>
			<td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water, sterile filtered</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic disposable syringe, sterile</td>
			<td style="width:187px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2&#181;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin, human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11376497001</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GF144</td>
			<td>100&#181;g/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S1567</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G19114</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration flask and filter top, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>0.22&#181;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>4489</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4488</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:353px;">Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td>
			<td style="width:187px;">CDI</td>
			<td style="width:119px;">MD2000</td>
			<td style="width:365px;">after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cotton tipped applicators, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>23-400-115</td>
			<td>single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Gauze pads, 10x10cm, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td>
			<td style="width:187px;">Samco</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Vinegar, white distilled</td>
			<td style="width:187px;">household use</td>
			<td></td>
			<td style="width:365px;">5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">#10 scalpels, sterile, disposable&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>31-200-32&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">petri dish, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TPP 115cm2 flask, with removable lid</td>
			<td style="width:187px;">MidSci</td>
			<td style="width:119px;">90652</td>
			<td>screw cap with filter</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:353px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>5% CO2, 37 oC, humidified chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">inverted light microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olypmus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">8M urea</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-500</td>
			<td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2X SDS tris-glycine buffer</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>optional, for preparing cell smears</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

קרצינומה של צינוריות שד באתרו (DCIS), בהגדרה, היא התפשטות של תאי אפיתל גידולים בתחומי צינוריות השד, מבלי לפרוץ את הקרום במרתף collagenous. בעוד DCIS הוא מבשר שאינו מחייב לסרטן שד פולשני, המנגנונים המולקולריים ואוכלוסיות תאים המאפשרים התקדמות לסרטן פולשני אינם ידועים במלואו. כדי לקבוע אם תאים מסוגלים פלישה היו קיימים בתוך אוכלוסיית תאי DCIS, שפיתחנו מתודולוגיה לאיסוף וculturing רקמת שד האנושי סטרילי בזמן הניתוח, ללא הפרעה אנזימטית של רקמה. רקמת שד סטרילי המכילה קטעי ductal שנקטפו מרקמת שד שנכרת בניתוח לאחר בדיקה פתולוגית שגרתית. רקמה המכילה DCIS ממוקמת במדיום מזין עשיר, המכיל אנטיביוטיקה, סרום חופשי, ומועברת למעבדה תרבית רקמה. רקמת השד היא dissecte נוסףד לבודד את האזורים המסוידים. חתיכות מרובות רקמת שד (organoids) ממוקמות בנפח מינימאלי של מדיום סרום ללא בבקבוק עם מכסה נשלף ותרבותי בCO 2 באינקובטור humidified. אוכלוסיות תאי אפיתל ופיברובלסטים לצאת מorganoid לאחר 10-14 ימים. באופן ספונטני Mammospheres יוצר על ומסביב monolayer תאי אפיתל. ניתן לקצור אוכלוסיות תאים ספציפיות ישירות מהבקבוק מבלי לשבש תאים שכנים. מערכת התרבות שלנו אינה אנזימטית רקמה אמינה מגלה תאי cytogenetically חריגים, חודרניים אב מנגעי DCIS אנושיים טריים.

זרימת עבודה עבור רכישה וculturing קרצינומה ductal שד סטרילי ברקמה באתר עקרות רקמת שד נשמרת מחדר הניתוח למעבדה תרבית תאים באמצעות שינויים קלים בעבודת פתולוגיה בבית החולים טיפוסית (איור 1). רקמה מועברת במכל סטרילי עם מכסה פלסט...

Watch this Scientific Journal Video about Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres at JoVE.com

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימטית. organoids השד בר-קיימא ל&gt; 6 חודשים.

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  George Mason University.  תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימט?...

Video: Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

לטווח ארוך של תרבות האדם סרטן השד דוגמאות וניתוח שלהם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca and, in particular, of the granulosa cell layer profoundly change their morphological, physiological, and molecular characteristics and form the progesterone-producing corpus luteum that is responsible for maintaining pregnancy. Cell culture models are essential tools to study the underlying regulatory mechanisms involved in the folliculo-luteal transformation. The presented protocol focuses on the isolation procedure and cryopreservation of bovine GC from small- to medium-sized follicles (&#60; 6 mm). With this technique, a nearly pure population of GC can be obtained. The cryopreservation procedure greatly facilitates time management of the cell culture work independent of a direct primary tissue (ovaries) supply. This protocol describes a serum-free cell culture model that mimics the estradiol-active status of bovine GC. Important conditions that are essential for a successful steroid-active cell culture are discussed throughout the protocol. It is demonstrated that increasing the plating density of the cells induces a specific response as indicated by an altered gene expression profile and hormone production. Furthermore, this model provides a basis for further studies on GC differentiation and other applications.

A long-term culture model of bovine granulosa cells under serum-free conditions is described. This model allows researchers to study the effects of diverse factors and conditions as different plating densities on the characteristics of estrogen-producing bovine granulosa cells.

מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן Granulosa שור ראשי תאים

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

אוסף רקמות של עטלפים עבור-ניתוח Omics ותרבות התא הראשוני

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...