この作品は、LALに防衛乳癌研究プログラム（米国陸軍医学研究買収活動）受賞＃W81XVVH-10-1-0781の（1）部門によって部分的にサポートされており、VE、及び（2）スーザンG.コーメン財団助成したLALにIR122224446とVE。病理サポートと組織グロスは親切にイノーバフェアファックス病理学科、博士ハッサンネイヤー、博士Geetha A.メネゼス、博士チャールズBechertにより提供された。患者の同意とサンプル調達が巧妙イノバフェアファックス病院臨床研究コーディネーターホリーGallimore、ヘザーHuryk、そしてエミールカマルによって導かれました。

ヒト乳房組織は、国防総省、ジョージ·メイソン大学、イノバ健康システム治験審査委員会の承認されたプロトコルに続いて、書面によるインフォームドコンセントを、調査研究に登録した患者から採取した。 1.成長因子および抗生物質を栄養豊富な培地を準備<ol><li>インスリン、上皮成長因子（EGF）、硫酸ストレプトマイシンおよび硫酸ゲンタマイシンのストック溶液を調製する。 <ol><li>を10mg / mlの最終濃度に滅菌濾過された水のインスリンを再構成する。吸引し、滅菌10ml中タイプ1試薬グレードの水10ミリリットル使い捨て注射器。注射器に0.22μmのポリエーテルスルホンフィルターを取り付けます。無菌の15mlの円錐チューブに滅菌濾過された水を分配する。 </li><li>インスリン100mgのバイアルに滅菌ろ過された水の10ミリリットルを追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。氷上でのインスリンのバイアルを保管してください。インスリンストックソル450μlのを分配-20°Cでラベルし、滅菌マイクロチューブやストアにる。インスリンストック溶液を、バイアルの有効期限まで安定である。 </li><li>上皮成長因子（EGF）の原液を調製：500μgのEGF（株式を1μg/μl）を500μlの滅菌水を追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。氷の上のEGFバイアルに保管してください。 <ol><li> EGFのワーキングストック溶液を準備します（作業ストックは0.1μgの/μLになります）900μlの栄養培地への原液のEGF溶液100μlを加える。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。 -80℃でラベルし、滅菌マイクロチューブやストアに、EGF作業ストック溶液50μlを分配する。 注：EGF原液（を1μg/μl）を-80℃で1年間安定です。ストック溶液（0.1μgの/μl）を協力して-80℃で2ヶ月間安定である。 </li></ol></li><li>化学天秤で硫酸ストレプトマイシン、40mgの重量を量る。硫酸ストレプトマイシンint型を置きますOA滅菌15ミリリットルコニカルチューブ。栄養培地4mlを追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。溶液はわずかにピンク色でなければなりません。光から保護して、4℃で保存。ストレプトマイシン硫酸塩溶液は、7日間安定である。 </li><li>化学天秤で硫酸ゲンタマイシン20mgを秤量する。滅菌15ミリリットルコニカルチューブに硫酸ゲンタマイシンを置きます。栄養培地2 mlを追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。溶液は黄色でなければなりません。光から保護して、4℃で保存。硫酸ゲンタマイシン溶液は7日間安定である。 </li></ol></li><li>ヒト組換えE​​GFを補充した栄養培地の二200ミリリットルのバッチの準備（10ng / mlの最終濃度で）、インスリン（10μg/ mlの最終濃度）、硫酸ストレプトマイシン（100μg/ mlの最終濃度）および硫酸ゲンタマイシン（20 / mlの最終濃度）。 <ol><li> 0.2μmのポリエーテルスルホンフィルターフラスコ、ボトルを受信250mlで備えた真空フィルターフラスコに200ミリリットルの栄養培地を加える。 20＆を追加＃181; L作業ストックEGF、200μlのストック·インスリン、2ミリリットルの株式ストレプトマイシン硫酸、及び栄養培地200mlに400μlのストックゲンタマイシン硫酸。真空フィルターフラスコを取り付けます。メディアをフィルタリングします。フィルタを破棄し、「栄養豊富な媒体」としてフラスコにラベルを付ける。 14日まで4℃で保管してください。 </li></ol></li></ol> 2.組織の取得と興行収入<ol><li>手術室では、乳房組織を調達した後、無菌技術を維持している。滅菌トレイに乳房組織を置き、滅菌プラスチックラップでトレイをカバーしています。 <ol><li>あなたの機関の必要に応じて放射線科/病理に覆われたトレイに組織を輸送する。トレイを開けないでください。輸送時間は、機関内で変わる。組織は、最大45分後に切除RTでこのカバーされたトレイに生存し続けることができます。しかし、栄養豊富な培地への組織の迅速な処理は、その後のオルガノイド培養のための最適な条件を提供しています。 </li></ol></li><li>グロス組織切開は乳房組織内DCISの領域を識別するために：組織の無菌性を維持するために、組織切開中に滅菌手袋、ブレード、メス、組織マーキング染料、酢を使用してください。 <ol><li> 70％エタノールまたは1％の漂白剤と作業エリアを清掃してください。滅菌手袋を開き、作業台の上に手袋のラッパーを置く。グローブラッパー表向きの無菌インテリアを配置します。滅菌手袋を着用してください。 <ol><li> 70％エタノールで検体容器の表面を清掃してください。組織検体容器からプラスチックラップを外し、手袋ラッパーに試料を置きます。 </li></ol></li><li>組織マーキング染料に2綿綿棒を浸し。組織表面全体に綿棒を転がすことによって組織の表面に染料を適用します。 注：各病理部門は、標準化された染料の色/組織の向きプロトコルを持っています。組織は、患者内の位置に関連して組織を配向する色素で標識されている。染料がブロットされているか組織上に描いた。組織の上に染料をかけないでください。染料を注ぐことは、染料は、このように切除縁の向きを混乱組織割れ目に/ドリップを実行する可能性があります。組織配向は、外科医の解剖学的特徴を有する病理学者）組織標本を記述し、そしてb）は、腫瘍に関連して切除縁の位置を決定を提供する。 </li><li>滅菌ガーゼパッド上で蒸留ホワイトビネガー（5％酢酸）に注ぐ。酢に浸したガーゼで染め組織ブロット。ガーゼを捨てる。酢は、色素を組織マーキングを固定するために使用される。 </li><li>約5mmの厚さの垂直スライスに乳房組織をカット。組織（ 図2）を介してすべての道を切断しないでください。観察/石灰化の領域のための組織を触診。その特徴的なしっかりした、（これはカルシウム骨片に）ザラザラを感じる赤みがかった、ゴム状の境界線に囲まれた淡い出現によってDCIS病変を識別します。 注：いくつかのケースでは、コメド（にきびのような）の領域とすることができる大口径DCIS病変から壊死物質を表す、白い点として見え。 </li><li>乳房組織を取り巻く少量含む、DCIS /石灰化乳房組織の領域を切り出した。ステップ1で調製した栄養豊富な培地20-30 mlを含む滅菌した50ミリリットルチューブに乳房組織を置きます。 <ol><li>優しくチューブを数回反転させることにより組織やメディアを混ぜる。培地を捨て、新鮮な培地を追加します。断熱容器への組織及び培地を含むチューブを置き、組織培養ラボへ組織を輸送する。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3.組織培養<ol><li>生物学的安全キャビネットの中で作業し、無菌のペトリ皿に組織および栄養培地を少量注ぐ。滅菌メスを使用すると、離れてカットし、線維組織を捨てる。ピース（オルガノイド）約3mm 2（ 図1C-D）に乳房組織をカット。各臓器ように組織を切断しようとするOID周囲の間質を有する少なくとも一つの識別可能なダクトセグメントが含まれています。 </li><li>組織培養フラスコの蓋を開きます。滅菌ピンセットまたは鉗子を用いて、フラスコ内にオルガノイドを置く。ふたを閉じます。ペトリ皿を捨てる。 </li><li>組織培養フラスコに11ミリリットルの無血清栄養豊富な培地（ステップ1で調製）を加える。フラスコを閉じ、オルガノイド及び媒体が均等にフラスコ表面全体に分散されるように（ 図1E-F）をフラスコを旋回。 </li><li> 2日間加湿5.0％CO 2雰囲気中37℃でフラスコをインキュベートする。この期間中にフラスコを動かさないでください。 </li><li> 2日後のインキュベーションでは、潜在的な真菌/細菌汚染をチェックするためにインキュベーターからフラスコを取り外します。突然、鋭い動きを避けるため、あるいはフラスコの旋回。倒立顕微鏡ステージ上にフラスコを置きます。 <ol><li>細菌、酵母、および/または真菌のための媒体を守ってください。汚染が認められない場合、アドインキュベーターにフラスコを返すitional日。汚染が指摘されている場合は、適切な容器にフラスコ及び内容を破棄。 </li></ol></li><li> 3日後のインキュベーションでは、新鮮な培地で馴化培地を交換してください。 <ol><li> 20〜30分間37℃で滅菌したチューブ内の培地11ミリリットルを置きます。インキュベーターからの組織培養フラスコを外します。オルガノイドを乱すことなく、無菌の血清学的ピペットを用いてフラスコ内の培地を除去し、廃棄する。 </li><li>新しい無菌の血清学的ピペットを用いて、予め温めておいた新鮮な培地11ミリリットルを追加します。非常に静かにフラスコ表面全体にメディアを配布し、フラスコを回転させます。 </li><li>加湿し、5.0％CO 2雰囲気下で37℃でフラスコをインキュベートする。 </li></ol></li></ol>設立オルガノイド/上皮細胞コロニー4.メンテナンス<ol><li> 2週間毎に新鮮な培地を用意し、組織培養フラスコ内で週に3回メディアを交換。 <ol><li> 37で滅菌容器内の培地11ミリリットルを置き20〜30分間のC°。インキュベーターからフラスコを外します。無菌の血清学的ピペットを用いて、フラスコからの馴化培地を除去し、廃棄し、オルガノイドを乱さないように注意しながら。 </li><li>新しい無菌の血清学的ピペットを用いて、予め温めておいた新鮮な培地11ミリリットルを追加します。非常に静かにフラスコ表面全体にメディアを配布し、フラスコを回転させます。加湿し、5.0％CO 2雰囲気下で37℃でフラスコをインキュベートする。 </li></ol></li><li> 10の後 - 培養14日後、付着していない培養フラスコ中の組織のいずれかの部分を削除します。 <ol><li>収穫細胞および/または新しい培​​養フラスコに伝播するため、異種移植のために、または表現型および/または分子解析用のフラスコからのオルガノイドを定期的に。 </li><li>インキュベーターからの組織培養フラスコを外します。 70％エタノールでフラスコをスプレーします。 70％エタノールを噴霧された清潔なペーパータオルでフラスコに過剰のエタノールを拭き取る。 </li><li>オルガノイド伝播：&lt;オール&gt; <li>フラスコの蓋を開き、生物学的安全キャビネット内蓋フェイスアップを置く。微視的な可視化の下では、収穫されるオルガノイド（複数可）を見つけます。ピックアップするオルガノイドを滅菌ピンセットまたは鉗子を使用してください。 </li><li>新しい培養フラスコ内のオルガノイドを伝播するために、新しいフラスコ内オルガノイドを置く。 11ミリリットルの新鮮な、温かい培地を追加します。 3.6.3 -ステップ3.3で説明したように、加湿した5％CO 2雰囲気中、37℃でインキュベートする。組織培養フラスコ中で1週間に3回、細胞培養培地を交換する。 </li></ol></li><li>細胞を回収。 <ol><li>直接顕微鏡vixualizationの下で、優しくこすりおよび吸引細胞とマンモスフィアは、無菌の使い捨てピペットチップ1,000μlのピペットを用いて。細胞や周囲の培地を吸引除去する。滅菌マイクロチューブに細胞/培地を分注する。 </li></ol></li><li> 5秒間12100×gでミニ遠心機で簡単に細胞をスピン。培地を除去し、廃棄する。 &lt;オール&gt; <li> DNA分析のために、直ちに-80℃で長期保存して、培地（10μl）を、少量の、ドライアイス上で細胞ペレットを凍結する。 </li><li>プロテオーム解析のために、質量分析又はウェスタンブロッティング/逆相タンパク質マイクロアレイのための2×SDSトリス - グリシン緩衝液のための8 M尿素10μlの細胞を溶解する。あるいはまた、免疫組織化学的分析のための細胞塗抹標本を作るために細胞遠心で細胞をスピン。 </li></ol></li><li>フラスコからの細胞を回収した後、残りの培地を除去し、廃棄する。暖かく、新鮮な栄養豊富な培地11ミリリットルを追加します。加湿した5％CO 2雰囲気下、37℃でフラスコをインキュベートする。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することは何もない。

本明細書中に記載の培養系は、基本およびトランスレーショナルリサーチ研究のために生きている前浸潤腫瘍性乳房細胞を生成するための新しいモデルを構成する。過去には、前悪性乳癌の進行は、典型的には、3つの異なる方法を用いて研究されてきた。第一の方法は、顕微解剖凍結または固定ヒト検体の組織病 ​​理学的および遺伝的分析12-14です。第二の方法は、ヒトプレ浸潤?...

乳管および肺胞（ 非浸潤性乳管癌）の範囲内で上皮細胞の増殖は、浸潤性乳管および小葉乳癌に対する絶対的前駆体として認識されている。それにもかかわらず、浸潤癌への進行を許可する分子機構および細胞個体群動態はよく理解されていない。前浸潤乳癌細胞、または任意の前浸潤腫瘍で使用される生存メカニズムを解明することは殺す、あるいは、前浸潤腫瘍1を防止するための治療戦略を明らかにすることができる。しかし、機能的にヒト前浸潤の病変を研究するための単純な低コストの方法が欠けてきた。形質転換細胞株のin vitroでの単層培養は、確立された実験室方法であるが、これらの不死化細胞株の表現型と遺伝子型は、一次ヒト腫瘍細胞の分子の状態2を再現することができない。さらに、偶数のRecA非腫瘍形成性MCF-10A細胞株、pitulates 3-D乳腺アーキテクチャは、十分に機能的表現型および個々の患者の事前浸潤性乳癌病変3,4の分子特性を表すことができない。 侵略のできる幹様腫瘍性細胞は（DCIS） 非浸潤性乳管癌の中に存在した場合に細胞集団を決定するために、我々は手術の時点（ 図1）5 位の無菌ヒト乳房組織を採取し、培養するための方法論を開発しました。我々のex vivoでの乳癌オルガノイド培養系は、単離し、新鮮なヒト乳管癌組織6-8からマンモスフェア形成細胞を増殖させるために、酵素的組織破壊、基底膜抽出物のマトリックス、または線維芽細胞の枯渇に依存しない。当社の新しいシステムは、セルストリーミング/移行5の原理に基づいている。識別可能な乳管、及び周囲の間質は、無血清栄養培地（ちょうど電子の最小体積中に浸漬されている培地に曝露され、ダクトの切断面と、ガス交換を最大化するが、フラスコ内の不特定の向き（ 図1E-F）にする）ダクト断片をカバーするnough。この培養系は、細胞は、自己由来間質および培養フラスコ上にダクトから出て、/の中に移動することができます。唯一の上皮成長因子（EGF）、インスリン、および抗生物質を補充した栄養培地は、オルガノイドから発せられる混合細胞集団の増殖を支持する。組織培養フラスコは、無菌加湿環境を維持しながら、オルガノイドおよび/または細胞がフラスコ全体又は隣接オルガノイドを中断せずに採取することができ、取り外し可能、再シール可能な蓋を有する。

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>A405-P</td><td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td></tr><tr><td>18 M&amp;Omega;-cm water, sterile filtered</td><td></td><td></td><td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td></tr><tr><td>10 cc plastic disposable syringe, sterile</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2520</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropylene conical tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>02-681-331</td><td></td></tr><tr><td>nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>with L-glutamine</td></tr><tr><td>Insulin, human recombinant</td><td>Roche</td><td>11376497001</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td><td>Millipore</td><td>GF144</td><td>100 &amp;micro;g/ml stock</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1567</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G19114</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Filtration flask and filter top, sterile</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>0.22 &amp;micro;m PES membrane</td></tr><tr><td>25 ml sterile, disposable pipettes</td><td>Fisher</td><td>4489</td><td>paper-plastic wrapped</td></tr><tr><td>10 ml sterile, disposable pipettes</td><td>Fisher</td><td>4488</td><td>paper-plastic wrapped</td></tr><tr><td>Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td><td>CDI</td><td>MD2000</td><td>after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td></tr><tr><td>Cotton tipped applicators, sterile</td><td>Fisher</td><td>23-400-115</td><td>single use only</td></tr><tr><td>Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile</td><td>Fisher</td><td>2187</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td><td>Samco</td><td>202-20S</td><td></td></tr><tr><td>Vinegar, white distilled</td><td>household use</td><td></td><td>5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td></tr><tr><td>#10 scalpels, sterile, disposable</td><td>Thermo Scientific</td><td>31-200-32</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish, sterile</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>TPP 115 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; flask, with removable lid</td><td>MidSci</td><td>90652</td><td>screw cap with filter</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Fisher</td><td>13-998-074</td><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C, humidified chamber</td></tr><tr><td>inverted light microscope</td><td>Olypmus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>8 M urea</td><td>Fisher</td><td>BP169-500</td><td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td></tr><tr><td>2X SDS tris-glycine buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>optional, for preparing cell smears</td></tr></tbody></table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

その場での乳管癌（DCIS）は、定義により、コラーゲン性基底膜を破ることなく、乳管の範囲内で腫瘍性上皮細胞の増殖である。 DCISは、浸潤性乳癌に非偏性前駆体であるが、浸潤癌への進行を可能にする分子機構および細胞集団は完全には知られていない。侵入可能な前駆細胞はDCIS細胞集団内に存在かどうかを決定するために、我々は、組織の酵素を中断することなく、手術時に無菌のヒト乳房組織を採取し、培養するための方法論を開発した。 乳管セグメントを含む滅菌乳房組織は、通常の病理検査次外科的に切除された乳房組織から採取される。 DCISを含む組織は、栄養豊富な、抗生物質を含む、無血清培地に入れ、組織培養研究室に輸送される。乳房組織はさらにdissecteです石灰化領域を分離するためのdの。複数の乳房組織片（オルガノイド）は、加湿CO 2インキュベーター中で取り外し可能な蓋と、培養したフラスコ内の無血清培地の最小容積に配置されます。 14日 - 上皮および線維芽細胞集団は10の後オルガノイドから出てくる。マンモスフィアは自然に形成し、上皮細胞単層の周り。特定の細胞集団は、隣接する細胞を破壊することなく、フラスコから直接採取することができる。我々の非酵素的な組織培養系は、確実に新鮮なヒトDCIS病変からの細胞遺伝学的に異常な、侵襲性の前駆細胞を明らかにする。

その場での組織中の滅菌乳管癌を調達し、培養するためのワークフロー乳房組織の無菌性は、典型的な病院の病理ワークフロー（ 図1）の小さな変化を介して、手術室からの細胞培養室に維持される。組織は、組織の無菌性を維持しつつ、放射線学的評価を可能にするプラスチックフィルムカバーを滅菌容器に搬送される。乳房の腫瘍摘出手術ま?...

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Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

無傷の組織オルガノイドを用いた初代培養細胞は、多細胞のin vivoでの微小環境を模倣するモデル系を提供する。我々は、酵素的組織破壊することなく、形態分化混合細胞培養系統や展示を永続無血清原発性乳房上皮組織培養モデルを開発した。乳オルガノイド&gt;は6ヶ月間生存したまま。

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K ビュー.  George Mason University. 無傷の組織オルガノイドを用いた初代培養細胞は、多細胞のin vivoでの微小環境を模倣するモデル系を提供する。我々は、酵素的組織破壊することなく、形態分化混合細胞培養系統や展示を永続無血清原発性乳房上皮組織培養モデルを開発した。乳オルガノイド>は6ヶ月間生存したまま。 

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

医学

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

細胞培養のための人間の削減乳房形成や乳房切除組織の処理

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

がん研究

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. The role of mammary stem cells (MaSCs) is widely studied both in the physiological/developmental context and with regards to breast carcinogenesis. In this aspect, ex vivo studies focused on MaSC properties are highly sought after. Mammosphere cultures represent a surrogate of organ formation and have become a valuable tool for both basic and translational research. Here, we present a detailed protocol for the generation of murine primary mammosphere cultures and the quantitation of MaSC growth properties. The protocol includes mammary gland collection and digestion, isolation of primary mammary epithelial cells (MECs), establishment of primary mammosphere cultures, serial passaging, quantitation of mammosphere growth parameters and interpretation of the results. As an example, we present the effect of low-level constitutive Myc expression on normal MECs leading to increased self-renewal and proliferation.

Here, we describe the implementation and interpretation of the results of an in vitro mammosphere self-renewal quantitative assay.

マウスマンモスフィア培養における自己再生の定量

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

発生生物学

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

人間のティッシュからの乳腺の上皮細胞を単離するためのプロトコル

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are the origin cells of breast cancer and other breast-related inflammatory diseases, have garnered considerable attention. However, isolating and culturing primary HMECs in vitro for research purposes has been challenging due to their highly differentiated, keratinized nature and their short lifespan. Therefore, developing a simple and efficient method to isolate and culture HMECs is of great scientific value for the study of breast biology and breast-related diseases. In this study, we successfully isolated primary HMECs from small amounts of mammary tissue by digestion with a mixture of enzymes combined with an initial culture in 5% fetal bovine serum-DMEM containing the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632, followed by culture expansion in serum-free keratinocyte medium. This approach selectively promotes the growth of epithelial cells, resulting in an optimized cell yield. The simplicity and convenience of this method make it suitable for both laboratory and clinical research, which should provide valuable insights into these important areas of study.

著者スポットライト:肉芽腫性乳房炎の治療のための東洋医学と西洋医学の統合

The present study reports an easier, time-saving, and economical protocol to efficiently isolate and grow primary human mammary epithelial cells (HMECs) from small amounts of mammary tissue. This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs both for laboratory and clinical applications.

初代ヒト乳腺上皮細胞の単離と培養

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

要約

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ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

細胞培養のための人間の削減乳房形成や乳房切除組織の処理

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

マウスマンモスフィア培養における自己再生の定量

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ

初代ヒト乳腺上皮細胞の単離と培養

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

要約

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ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

細胞培養のための人間の削減乳房形成や乳房切除組織の処理

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

マウスマンモスフィア培養における自己再生の定量

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ

初代ヒト乳腺上皮細胞の単離と培養

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド