Ce travail a été soutenu en partie par (1) le ministère de la Défense Programme Cancer Research (Recherche Acquisition Activité US Army Medical) de prix # W81XVVH-10-1-0781 à LAL et VE, et (2) la subvention de la Fondation Susan G. Komen Breast IR122224446 Lal et VE. des services de pathologie et extrapolation de tissu a été gracieusement fournie par Inova Fairfax département de pathologie, le Dr Hassan Nayer, le Dr Geetha A. Menezes, et le Dr Charles Bechert. Le consentement du patient et la collecte des échantillons a été savamment guidés par l&#39;hôpital Inova Fairfax coordonnateurs de recherche clinique de Holly Gallimore, Heather Huryk, et Emil Kamar.

Tissu mammaire humain ont été recueillies auprès des patients participant à une étude de recherche, avec le consentement éclairé écrit, suivant ministère de la Défense, de l&#39;Université George Mason, et les protocoles approuvés par le Conseil d&#39;examen institutionnel du système de santé d&#39;Inova. 1. Préparer riche en nutriments moyen de facteurs de croissance et des antibiotiques <ol><li> Préparation des solutions mères de l&#39;insuline, le facteur de croissance épidermique (EGF), le sulfate de streptomycine et de sulfate de gentamicine. <ol><li> Reconstituer l&#39;insuline dans l&#39;eau filtrée stérile à une concentration finale de 10 mg / ml. Aspirer 10 ml de type 1 eau de qualité réactif dans une seringue de 10 ml stérile à usage unique. Fixer un filtre de 0,22 um de polyéthersulfone à la seringue. Verser l&#39;eau filtrée stérile dans un tube de 15 ml conique stérile. </li><li> Ajouter 10 ml d&#39;eau filtrée stérile à un flacon de 100 mg d&#39;insuline. Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. Conserver le flacon d&#39;insuline sur la glace. Distribuer 450 ul de l&#39;insuline actions solution dans étiquetés, des microtubes stériles et conserver à -20 ° C. Solution de réserve d&#39;insuline est stable jusqu&#39;à la date de péremption indiquée sur le flacon. </li><li> Préparer une solution stock de facteur de croissance épidermique (EGF): Ajouter 500 pi d&#39;eau stérile à 500 ug EGF (stock 1 pg / pl). Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. Conserver le flacon FEM sur la glace. <ol><li> Préparer une solution de travail de l&#39;action de l&#39;EGF: Ajouter 100 ul de la solution mère de l&#39;EGF à 900 milieu nutritif pi (stock de travail sera de 0,1 pg / pl). Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. Distribuer 50 pl de la solution de travail des stocks EGF dans étiquetés, des microtubes stériles et conserver à -80 ° C. REMARQUE: EGF solution stock (1 pg / pl) est stable pendant 1 an à -80 ° C; Solution de travail de stock (0,1 ug / ul) est stable pendant 2 mois à -80 ° C. </li></ol></li><li> Peser 40 mg de sulfate de streptomycine sur une balance analytique. Placer le int de sulfate de streptomycineo stériles tube de 15 ml conique. Ajouter 4 ml de milieu nutritif. Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. La solution doit être légèrement rosée. Conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. Une solution de sulfate de streptomycine est stable pendant 7 jours. </li><li> Peser 20 mg de sulfate de gentamicine sur une balance analytique. Placer le sulfate de gentamicine dans un tube conique de 15 ml stérile. Ajouter 2 ml de milieu nutritif. Mélanger brièvement le contenu sur un vortex. La solution doit être jaune. Conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. Une solution de sulfate de gentamicine est stable pendant 7 jours. </li></ol></li><li> Préparer deux 200 ml lots de milieu nutritif additionné d&#39;EGF humain recombinant (10 ng / concentration finale ml.), De l&#39;insuline (10 ug / ml de concentration finale.), Du sulfate de streptomycine (100 ug / ml de concentration finale.) Et de sulfate de gentamicine (20 ug / ml de concentration finale.). <ol><li> Ajouter 200 ml de milieu nutritif à un ballon filtrant à vide équipé d&#39;un filtre de 0,2 um ballon de polyéthersulfone et une bouteille de 250 ml de réception. Ajouter 20 &amp;# 181; l stock de travail du FEM, 200 pi actions insuline, 2 ml de sulfate de streptomycine stock, et 400 pi actions sulfate de gentamicine à 200 ml de milieu nutritif. Fixez le flacon de filtre à vide. Filtrer le milieu. Jeter le filtre et l&#39;étiquette du flacon comme «un milieu riche en nutriments&quot;. Conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 14 jours. </li></ol></li></ol> 2. Acquisition de tissus et extrapolation <ol><li> Dans la salle d&#39;opération, maintenir technique stérile après procurer le tissu mammaire. Placez le tissu mammaire dans un plateau stérile et recouvrir le plateau d&#39;une pellicule de plastique stérile. <ol><li> Transporter le tissu dans le bac couvert de radiologie / Pathologie tel que requis par votre institution. Ne pas ouvrir le tiroir. Les temps de transport varient au sein des institutions. Les tissus peuvent rester viables dans ce bac couvert à température ambiante pendant jusqu&#39;à 45 minutes après l&#39;excision. Cependant, le traitement rapide des tissus dans un milieu riche en nutriments offre des conditions optimales pour la culture organoïde ultérieure. </li></ol></li><li> Dissection du tissu brut d&#39;identifier les zones de CCIS dans le tissu du sein: Utiliser des gants stériles, des lames, des scalpels, tissus colorants de marquage et de vinaigre lors de la dissection de tissu pour maintenir la stérilité de tissu. <ol><li> Nettoyer la zone de travail avec 70% d&#39;éthanol ou 1% eau de Javel. Ouvrez les gants stériles et placer l&#39;enveloppe de gant sur la surface de travail. Placez l&#39;intérieur du gant stérile emballage vers le haut. Mettre les gants stériles. <ol><li> Nettoyer la surface du récipient d&#39;échantillon avec 70% d&#39;éthanol. Retirer la pellicule de plastique du contenant d&#39;échantillon de tissu et placer l&#39;échantillon sur l&#39;emballage de gants. </li></ol></li><li> Trempez deux cotons-tiges basculé dans la teinture de marquage de tissu. Appliquer le colorant à la surface du tissu en faisant rouler les tampons à travers la surface du tissu. REMARQUE: Chaque département de pathologie a un protocole standardisé d&#39;orientation couleur de teinture / tissu. Le tissu est marqué avec un colorant pour orienter le tissu par rapport à sa position dans le patient. Le colorant est effacé oupeint sur le tissu. Ne pas verser le colorant sur le tissu. Verser le colorant peut provoquer le colorant pour exécuter / goutte à goutte dans les crevasses de tissus nuisant ainsi à l&#39;orientation des marges chirurgicales. orientation tissulaire fournit le chirurgien et avec des repères anatomiques pathologiste à a) décrire le spécimen de tissu, et b) déterminer l&#39;emplacement des marges chirurgicales par rapport à la tumeur. </li><li> Verser le vinaigre blanc distillé (acide acétique à 5%) sur des tampons de gaze stériles. Tamponnez le tissu teint avec la gaze imbibée de vinaigre. Jeter la gaze. Le vinaigre est utilisé pour fixer les colorants marquage de tissu. </li><li> Couper le tissu mammaire en tranches verticales d&#39;environ 5 mm d&#39;épaisseur. Ne pas couper tout le chemin à travers le tissu (Figure 2). Observer / palper le tissu pour les zones de calcification. Identifier les lésions de CCIS par leur entreprise caractéristique, pâle apparition entouré de rouge, les frontières caoutchouteux qui se sentent graveleux (en raison de spicules de calcium). REMARQUE: Dans certains cas, les zones comédon (bouton-like) peuvent êtrevu comme des points blancs, représentant matériau nécrotique de grand diamètre lésions CCIS. </li><li> Découpez les zones de CCIS tissu mammaire / entartrée, y compris une petite quantité de tissu mammaire environnant. Placer le tissu mammaire dans un tube stérile de 50 ml contenant de 20 à 30 ml de milieu riche en nutriments préparé à l&#39;étape 1. <ol><li> Mélanger le tissu et moyen en retournant doucement le tube plusieurs fois. Jeter le moyen et ajouter du milieu frais. Placer le tube contenant le tissu et le milieu dans un récipient isolé et transporter le tissu au laboratoire de culture de tissus. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Culture de tissu <ol><li> Travailler dans une enceinte de sécurité biologique, verser le tissu et une petite quantité de milieu nutritif dans une boîte de Pétri stérile. Avec un scalpel stérile coupé et jeter le tissu fibreux. Couper le tissu mammaire en morceaux (organites) d&#39;environ 3 mm 2 (figure 1C-D). Essayez de couper le tissu de sorte que chaque organeOID contient au moins un segment de canal discernable avec stroma environnant. </li><li> Ouvrir le couvercle de la fiole de culture de tissu. Avec des ciseaux ou des pinces stériles, placer les organites dans le ballon. Fermez le couvercle. Jeter la boîte de Pétri. </li><li> Ajouter 11 ml de milieu riche en nutriments sans sérum (préparé à l&#39;étape 1) dans le ballon de culture tissulaire. Fermer le flacon et agiter la fiole de sorte que les organites et le milieu sont distribués uniformément sur ​​toute la surface du ballon (figure 1E-F). </li><li> Incuber le ballon à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5,0% pendant 2 jours. Ne déplacez pas le ballon pendant cette période. </li><li> 2 jours après l&#39;incubation, enlever le ballon de l&#39;incubateur pour vérifier la contamination fongique / bactérienne potentiel. Évitez coup, les mouvements brusques, ou tourbillonnant du ballon. Placer le ballon sur une platine du microscope inversé. <ol><li> Observer le support de bactéries, de levures et / ou moisissures. Si aucune contamination est à noter, retourner le ballon à l&#39;incubateur pour un complémentjour tradition-. Si la contamination est à noter, jeter le ballon et son contenu dans un récipient approprié. </li></ol></li><li> Le jour 3 après incubation, remplacer le milieu conditionné par un milieu frais. <ol><li> Placer 11 ml de milieu dans un tube stérile à 37 ° C pendant 20 à 30 min. Retirer le flacon de culture de tissu à partir de l&#39;incubateur. Sans déranger les organites, retirez et jetez le milieu dans la fiole à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique stérile. </li><li> En utilisant une nouvelle pipette sérologique stérile, ajouter 11 ml de milieu frais préchauffé. Très tourner doucement le flacon pour distribuer le fluide sur la surface du ballon. </li><li> Incuber le ballon à 37 ° C dans 5,0% de CO 2, atmosphère humidifiée. </li></ol></li></ol> 4. Maintien d&#39;établi des colonies cellulaires Organoid / épithéliales <ol><li> Préparer milieu frais toutes les 2 semaines et remplacer les médias dans le flacon de culture de tissu 3 fois par semaine. <ol><li> Placer 11 ml de milieu dans un récipient stérile à 37° C pendant 20 à 30 min. Enlever le ballon de l&#39;incubateur. L&#39;utilisation d&#39;un sérologique pipette stérile, retirez et jetez le milieu conditionné du ballon, en faisant attention de ne pas déranger les organites. </li><li> En utilisant une nouvelle pipette sérologique stérile, ajouter 11 ml de milieu frais préchauffé. Très tourner doucement le flacon pour distribuer le fluide sur la surface du ballon. Incuber le ballon à 37 ° C dans 5,0% de CO 2, atmosphère humidifiée. </li></ol></li><li> Après 10 - 14 jours de culture, de supprimer tous les morceaux de tissus dans le flacon de culture qui ne sont pas adhérentes. <ol><li> Des cellules et / ou les organites de la fiole de propagation dans de nouvelles fioles de culture, la récolte périodique de transplantation de xénogreffe, ou pour phénotypique et / ou d&#39;une analyse moléculaire. </li><li> Retirer le flacon de culture de tissu à partir de l&#39;incubateur. Vaporiser le ballon avec 70% d&#39;éthanol. Essuyez l&#39;excès de l&#39;éthanol sur le ballon avec une serviette en papier propre qui a été pulvérisé avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Propagation Organoid: &lt;ol&gt; <li> Ouvrez le couvercle du flacon et placez le couvercle face vers le haut dans l&#39;enceinte de sécurité biologique. Sous visualisation microscopique, localiser la organoïde (s) à être récoltés. Utilisez des pinces ou des pinces stériles pour ramasser un organoïde. </li><li> Pour propager la organoïde dans un nouveau flacon de culture, placez le organoïde dans le nouveau flacon. Ajouter 11 ml fraîche, milieu chaud. Incuber à 37 ° C, dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée, comme décrit dans les étapes 3.3 - 3.6.3. Remplacer le milieu de culture cellulaire dans la culture de tissus ballon à trois fois par semaine. </li></ol></li><li> La récolte des cellules: <ol><li> Sous vixualization microscopique direct, gratter délicatement et cellules aspirer et mammospheres aide d&#39;une pipette de 1000 pi avec des embouts de pipette jetables stériles. Aspirer les cellules et le milieu environnant. Distribuer les cellules / milieu dans un tube à centrifuger stérile. </li></ol></li><li> Faites tourner les cellules brièvement dans un mini-centrifugeuse à 12 100 g pendant 5 sec. Retirez et jetez le milieu. &lt;ol&gt; <li> Pour l&#39;analyse de l&#39;ADN, geler immédiatement le culot de cellules sur de la glace sèche, dans un petit volume de milieu (10 pi), avec un stockage à long terme à -80 ° C. </li><li> Pour l&#39;analyse protéomique, la lyse des cellules dans 10 ul de 8 M urée pour la spectrométrie de masse ou 2x SDS tampon tris-glycine pour blot / arrière des puces à protéines de la phase de l&#39;Ouest. Sinon, tourner cellules dans un cytocentrifugeuse à faire des frottis cellulaires pour l&#39;analyse immunohistochimique. </li></ol></li><li> Après la récolte des cellules d&#39;un flacon, retirez et jetez le milieu restant. Ajouter 11 ml de milieu de culture riche en nutriments frais chaud. Incuber le ballon à 37 ° C, dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Les auteurs ont rien à divulguer.

Le système de culture décrit ici constitue un nouveau modèle pour générer des cellules vivantes mammaires néoplasiques pré-invasives pour les études de base et de recherche translationnelle. Dans le passé, la progression du cancer du sein pré-malin a généralement été étudié en utilisant trois procédés différents. La première méthode est histopathologique et l&#39;analyse génétique des échantillons humains congelés ou fixes microdisséquées 12-14. La deuxième méthode utilise des mod...

La prolifération des cellules épithéliales dans les limites de canaux du sein et les alvéoles (carcinome canalaire in situ) est reconnu comme un précurseur obligatoire à canalaire infiltrant et le carcinome lobulaire. Néanmoins, les mécanismes moléculaires et la dynamique des populations de cellules qui permettent la progression vers un cancer invasif sont mal comprises. Élucider les mécanismes de survie utilisées par les cellules de carcinome du sein pré-invasives, ou toute tumeur pré-invasive, peut révéler des stratégies thérapeutiques pour le meurtre, voire d&#39;empêcher, les tumeurs pré-invasives 1. Cependant, les méthodes simples et peu coûteuses pour l&#39;étude fonctionnelle des lésions pré-invasives humaines ont fait défaut. Bien que la monocouche de culture in vitro de lignées de cellules transformées est une méthode de laboratoire établi, le phénotype et le génotype de ces lignées cellulaires immortalisées ne parvient pas à récapituler l&#39;état moléculaire des cellules tumorales humaines primaires 2. En outre, même la lignée de cellules MCF-10A non-tumorigène, qui RecApitulates 3-D architecture de la glande mammaire, ne représente pas de manière adéquate le phénotype fonctionnel et caractéristiques moléculaires de la lésion du sein pré-invasive d&#39;un patient individuel 3,4. Pour déterminer si les cellules souches néoplasiques comme capables d&#39;invasion existaient dans le carcinome canalaire in situ (CCIS) population de cellules, nous avons développé une méthodologie de collecte et de culture de tissu stérile maternel au moment de la chirurgie (Figure 1) 5. Notre ex vivo sein du système de culture organoïde ne dépend pas de perturbation enzymatique de tissu, matrice de membrane basale de l&#39;extrait, ou l&#39;appauvrissement des fibroblastes, pour l&#39;isolement et la propagation de cellules formant mammosphere de frais canalaire du sein carcinome humain tissu 8.6. Notre nouveau système est basé sur le principe de la cellule de streaming / 5 migration. Les canaux du sein perceptibles, et le stroma environnant sont immergés dans un volume minimal de milieu nutritif sans sérum (juste enough à recouvrir les fragments de conduits) afin de maximiser l&#39;échange de gaz, avec la surface de la gaine exposée au milieu de culture de coupure, mais pas dans une orientation spécifique dans le ballon (figure 1E-F). Ce système de culture de cellules permet de migrer hors de la gaine et dans / sur le stroma et ballon de culture autologue. Le milieu nutritif, complétée seulement par facteur de croissance épidermique (EGF), l&#39;insuline et des antibiotiques, favorise la croissance de populations cellulaires mixtes issues de la organoïde. Le flacon de culture de tissu a une refermable couvercle amovible, qui permet aux organites et / ou des cellules qui doivent être récoltées, sans perturber le ballon ou voisins organites entiers, tout en maintenant un environnement stérile humidifié.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A405-P</td>
			<td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water, sterile filtered</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic disposable syringe, sterile</td>
			<td style="width:187px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2&#181;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin, human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11376497001</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GF144</td>
			<td>100&#181;g/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S1567</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G19114</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration flask and filter top, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>0.22&#181;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>4489</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4488</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:353px;">Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td>
			<td style="width:187px;">CDI</td>
			<td style="width:119px;">MD2000</td>
			<td style="width:365px;">after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cotton tipped applicators, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>23-400-115</td>
			<td>single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Gauze pads, 10x10cm, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td>
			<td style="width:187px;">Samco</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Vinegar, white distilled</td>
			<td style="width:187px;">household use</td>
			<td></td>
			<td style="width:365px;">5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">#10 scalpels, sterile, disposable&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>31-200-32&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">petri dish, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TPP 115cm2 flask, with removable lid</td>
			<td style="width:187px;">MidSci</td>
			<td style="width:119px;">90652</td>
			<td>screw cap with filter</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:353px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>5% CO2, 37 oC, humidified chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">inverted light microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olypmus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">8M urea</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-500</td>
			<td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2X SDS tris-glycine buffer</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>optional, for preparing cell smears</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

Sein carcinome canalaire in situ (CCIS), par définition, est la prolifération des cellules épithéliales néoplasiques dans les limites de la conduite du sein, sans porter atteinte à la membrane basale de collagène. Bien CCIS est un précurseur non obligatoire pour les cancers du sein invasifs, les mécanismes moléculaires et les populations de cellules qui permettent la progression vers un cancer invasif ne sont pas complètement connus. Pour déterminer si les cellules souches capables d&#39;invasion existaient au sein de la population de cellules CCIS, nous avons développé une méthodologie de collecte et de culture de tissu stérile maternel au moment de la chirurgie, sans perturbation enzymatique de tissu. Tissu mammaire stérile contenant des segments canalaires est récolté à partir de tissu mammaire excisé chirurgicalement après examen pathologique de routine. Tissu contenant DCIS est placé en milieu riche en nutriments, contenant l&#39;antibiotique, sans sérum, et transporté au laboratoire de culture de tissus. Le tissu mammaire est également dissected pour isoler les zones calcifiées. Morceaux de tissu du sein multiples (organites) sont placés dans un volume minimal de milieu sans sérum dans un flacon muni d&#39;un couvercle amovible et cultivées dans un incubateur à CO2 humidifié. Populations de cellules épithéliales et fibroblastes émergent de la organoïde après 10 - 14 jours. Mammospheres former spontanément sur et autour de la monocouche de cellules épithéliales. Populations spécifiques de cellules peuvent être récoltées directement du ballon sans perturber les cellules voisines. Notre système de culture de tissu non-enzymatique révèle fiable cytogénétique anormaux, des cellules progénitrices invasives de lésions humaines fraîches de DCIS.

Workflow pour l&#39;acquisition et la culture de carcinome canalaire du sein stérile dans les tissus in situ stérilité du tissu mammaire est maintenue de la salle d&#39;opération au laboratoire de culture cellulaire par des changements mineurs dans typique flux hôpital de pathologie (figure 1). Le tissu est transportée dans un récipient stérile avec une couverture en film plastique qui permet une évaluation radiologique, tout en maintenant la stérili...

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Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d&#39;épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant&gt; 6 mois.

Non enzymatique, sans sérum de culture de tissus de lésions mammaires pré-invasives pour la génération spontanée de mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K vues.  George Mason University.  Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant> 6 mois. 