We would like to thank the Texas Pierce&#8217;s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

1 Culture Cellulaire REMARQUE: les lignées cellulaires de Homalodisca établies par le laboratoire Dr. Wayne Hunter au USDA Agricultural Research Service (Ft. Pierce, FL USA) ont été utilisés pour initier un stock de laboratoire composé de stades cellulaires mixtes incluant les fibroblastes initiales et monocouches. <ol><li> Effectuez les procédures suivantes dans un environnement de laboratoire stérile maintenue dans une plage de température de 20-24 ° C avec 25 cm 2 flacons de culture. </li><li> Cultiver et maintenir les cultures dans 25 cm 2 flacons de culture de tissu en utilisant un milieu H2G + cicadelle, un média d&#39;abeilles WH2 modifié 10 (tableau 1). </li><li> Incuber des flacons de culture à 24 ° C avec ~ 53% d&#39;humidité. </li><li> Utilisez un microscope inversé à un grossissement total (TM) de 100X pour surveiller la croissance de la culture, par exemple, vérifier toute croissance cellulaire anormale, surveiller les contaminants potentiels, et vérifier les progrès de la croissance dans le culsurface ture. </li><li> Effectuer un changement de milieu complet (~ 4 ml de milieu de culture par flacon) tous les 7 - 10 jours sans perturber la surface de culture. </li><li> Faire passer les cultures lorsque la surface de culture est d&#39;environ 80% couvert par une croissance cellulaire (confluent) en utilisant 0,25% de trypsine contenant de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour dissocier les cellules. Ajouter ~ 2 - 3 ml de trypsine à chaque flacon de culture et d&#39;exposer la culture (s) de l&#39;enzyme de courtes périodes de temps (5-10 minutes) pour réaliser une dissociation complète des cellules. </li><li> Ajouter une quantité égale de milieu frais au récipient de culture (s) (~ 2 - 3 ml) pour arrêter l&#39;activité enzymatique et de transférer l&#39;ensemble de la solution dans un tube conique de centrifugation. </li><li> cellules de pellets par centrifugation à 4 ° C pendant 6 minutes à 350 x g. </li><li> Eliminer le surnageant sans perturber le culot de cellules et ajouter ~ 8 ml de milieu frais à chaque tube. Homogénéiser doucement cellules à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> cultures de Split à un ratio 1: 2 pour 25 cm 2 flacons (~ 4 ml de soluti cellulairepar ballon sur) et laisser les cultures fraîchement passés au repos pendant 48 heures pour permettre aux cellules en suspension à attacher à la surface du ballon. REMARQUE: La culture de cellules de 48 puits stériles, des plaques de culture de tissu avec une surface de 1 cm 2 de croissance est également possible et on peut être maintenue de la même façon que les flacons de culture à une réduction de volume du milieu de culture à ~ 250 ul. </li></ol> 2 Extraction de virus entier <ol><li> Homogénéiser corps entiers de virus H. positif vitripennis dans un tampon phosphate, pH ~ 7,2, avec diéthyldithiocarbamate de sodium à 0,02% trihydrate (DETCA) par vortex pendant ~ 10 secondes d&#39;intervalle jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y ait plus de grosses touffes de tissus présents. Extrait virus via superspeed centrifugation à 124 500 g pendant 4 heures à 4 ° C ou 22 000 g pendant 16 heures à 4 ° C. Si un précipité se forme à la surface, les retirer avec un coton-tige stérile 11. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Recueillir le culot etdissoudre avec 5 ml de tampon phosphate 10 mM (pas de DETCA), pH ~ 7,2, contenant 0,4% d&#39;acide désoxycholique et Na-éther de polyéthylène glycol d&#39;hexadécyle de 4% (Brij 52). <ol><li> Pour bien mélanger le culot, retirez la boulette du côté du tube et écraser jusqu&#39;à en solution si nécessaire. </li><li> Ajouter plus de tampon phosphate 10 mM dans ~ 5 ml incréments pour aider le culot aller dans une solution en cas de besoin et de les combiner en 2 tubes 11. </li></ol></li><li> Centrifuger la solution à 300 g pendant 15 min 11. </li><li> Enlever le surnageant et passer la solution à travers un filtre de 0,45 um, et recueillir le filtrat dans un tube à grande collection 11. </li><li> Transférer le filtrat sur ​​une membrane de dialyse avec un poids moléculaire coupée (MWCO) de 3,5 kD, en utilisant de petites quantités de tampon phosphate 10 mM (pH 7) contenant aucun DETCA 11 si nécessaire. </li><li> Placer la membrane de dialyse dans un grand bol rempli de trou DDH 2 O à 4 ° C. Changer le trou DDH 2 O chaque heure fou 5-6 heures, jusqu&#39;à ce qu&#39;un précipité blanc se forme dans la membrane 11. </li><li> Recueillir le virus purifié à partir de l&#39;intérieur de la membrane et de soumettre la solution de virus à 100% pour une série de dilutions de 10 fois par l&#39;ajout de 10 ul de solution de 90 pl de trou DDH 2 O. Ensuite ajouter 10 ul de la dilution d&#39;un autre 90 ul de trou DDH 2 O jusqu&#39;à une dilution de 1: 100 000. </li><li> solution de virus de magasin à -80 ° C. </li></ol> 3. réplication virale <ol><li> cellules de semences dans des plaques de culture de 48 puits et se développent toutes les lignes jusqu&#39;à ce que la croissance des cellules est de 80% de confluence (environ post-passe 72 heures si les cellules se développent à un taux moyen). </li><li> Inoculer chaque rangée de cellules par le virus dilué en série lorsque la croissance cellulaire atteint la confluence, c&#39;est à dire, une ligne d&#39;une dilution de 1:10, une ligne d&#39;une dilution de 1: 100, etc, à l&#39;exception de la rangée du haut. Utilisez la rangée du haut comme témoin et ajouter 10 ul de ddH 2 O dans chaque puits comme un contrôle de volume. <ol><li> Afin d&#39;établir une concentration de cellules de base de départ pour la comparaison avec le nombre de cellules expérimentales, de dissocier et de compter le premier puits de chaque rangée avant l&#39;inoculation initiale de tous les puits dans les cultures infectées par le virus. </li></ol></li><li> Surveiller les plaques de culture toutes les 24 h après l&#39;inoculation virale de tout changement de couleur dans le milieu indiquant un changement de pH et des éventuelles modifications de la morphologie des cellules. </li><li> L&#39;image d&#39;une colonne de la plaque d&#39;essai à chaque point de temps, à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé à 100X TM. </li><li> Retirez tout support de la colonne qui a été reproduite à chaque point de temps de 24 heures et le stocker à court terme à -20 ° C pour l&#39;extraction de l&#39;ARN et la quantification virale ou à long terme à -80 ° C. </li><li> Dissocier les cellules des puits après l&#39;élimination du milieu tel que décrit précédemment dans les étapes 1.6 à 1.9, en utilisant seulement ~ 250 pl de 0,25% d&#39;EDTA à la trypsine et du milieu frais pour arrêter l&#39;activité enzymatique et ~ 250 pl de milieu frais pour remettre en suspension la pelle cellulairet. </li><li> Ajouter 10 ul de 0,4% trypan bleuissement à chaque tube contenant des cellules pour effectuer des comptages de cellules après dissociation de cellule pour chaque période de 24 heures sur une semaine. Laisser tache à reposer pendant 10 min avant d&#39;effectuer la numération des cellules. <ol><li> Effectuer le nombre de cellules dans 1 heure d&#39;exposition à tacher ou cellules viables va commencer à absorption tache ainsi que les cellules non-viables. </li></ol></li><li> Ajouter lentement 10 ul de la solution de cellules colorées de chaque côté d&#39;un hémocytomètre standard à l&#39;aide d&#39;une micropipette. Laisser la solution pour être repris par une action capillaire pour éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Compter le nombre de cellules viables (non colorées) des deux côtés de l&#39;hématimètre (l&#39;équivalent de 4 chefs d&#39;accusation de 16 places dans le hématimètre). Effectuer le nombre de cellules de chaque puits de la colonne qui a été supprimé. </li><li> En moyenne le nombre de cellules de chaque colonne et utiliser la formule suivante pour obtenir le nombre total de comptage cellulaire: (nombre moyen de cellules / 4) x facteur de dilution = nombre de cellules x 10 <sup&gt; 4 ml. Il s&#39;agit de la densité cellulaire ou le nombre de cellules viables dans la culture. </li></ol> 4. Virus Extraction de culture cellulaire <ol><li> Retirer H. traité vitripennis cellules provenant des flacons de culture tel que décrit précédemment dans les étapes 1.6 à 1.8, en utilisant seulement ~ 250 ul d&#39;EDTA 0,25% de trypsine et du milieu frais pour arrêter l&#39;activité enzymatique. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Extrait virus à partir des cellules de culture en suivant le protocole précédemment décrit dans les étapes 2.3 à 2.8. </li></ol> 5 Extraction de l&#39;ARN <ol><li> Extraire l&#39;ARN à partir d&#39;échantillons prélevés au cours de chaque moyen d&#39;essai de virus d&#39;une semaine à l&#39;aide d&#39;une extraction thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium conçu pour des échantillons liquides par le protocole du fabricant. </li><li> Magasin extrait des échantillons à -80 ° C. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Établir des normes viraux pour la RT-PCR en exécutant PCR traditionnelle utilisant lepaire d&#39;amorces primaire HoCV RT-PCR 1 (avant 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, 5&#39;-inverser ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;) par le virus isoler de tout corps H. vitripennis. </li><li> Sous réserve de produit de PCR à une électrophorèse sur gel de 60 min à 120 V dans un gel d&#39;agarose à 2% contenant 0,1% de bromure d&#39;éthidium. </li><li> Exciser les bandes à partir du gel et on purifie en utilisant un kit d&#39;extraction de gel selon le protocole du fabricant. </li><li> Piscine toute excisée et le produit purifié sur gel et purifier davantage par précipitation à l&#39;éthanol de base. On élue le produit de précipitation dans environ 30 ul de Tris EDTA (TE) pour augmenter la concentration de l&#39;échantillon global. </li><li> Quantifier le niveau de l&#39;ADNc dans les échantillons mis en commun par spectrophotométrie en utilisant les paramètres de longueur d&#39;onde 260/230 pour la détection d&#39;acide nucléique. </li><li> Effectuer une série de dilution en série de dix fois de l&#39;échantillon purifié allant de 57 ng / ul à 57 ag / ul (10 -18). Réaliser des dilutions en série du même type que celui décrit in 2.8 avec des ajustements effectués pour la différence dans les exigences de concentration. </li><li> Déterminer les limites de détection de la série de dilutions en effectuant qRT-PCR en utilisant un kit de qRT-PCR avec une quantification fiable de transcrits de faible abondance. REMARQUE: Les concentrations virales inférieure à 5 x 10 -3 copies ne sont pas détectables. </li><li> Extraire l&#39;ARN à partir d&#39;échantillons expérimentaux comme décrit précédemment à l&#39;étape 5.1 et de quantifier par spectrophotométrie. </li><li> Normaliser tous les échantillons prélevés à 5 ng / ul avec de l&#39;eau sans nucléase. </li><li> Effectuer qRT-PCR sur tous les échantillons, en double, que les réactions 25 ul en utilisant un kit qRT-PCR en une seule étape avec la possibilité de détecter un faible nombre de copies de la manière suivante: 50 ° C pendant 10 min tenir; 95 ° C pendant 5 min; 30 cycles de 95 ° C pendant 10 sec, 60 ° C pendant 30 s; faire fondre de 50 à 99 ° C pendant 5 secondes à chaque étape. <ol><li> Faire le mélange maître de sorte que chaque mélange réactionnel contient 12,5 pi de maste 1xr mélange, 1,0 pi (0,3 M) de l&#39;amorce de l&#39;avant, 1,0 pi (0,3 M) de l&#39;amorce inverse, 0,25 ul de la transcriptase inverse et des quantités variables de modèle basé sur des valeurs de normalisation. </li><li> Amener le volume réactionnel total de 25 ul avec de l&#39;eau libre de la RNase. </li><li> Inclure les cinq concentrations standard dans chaque PCR effectuées avec les nombres de copies suivantes: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 et 5 x 10 -2 copies. Régler le seuil pour chaque course juste au-dessous d&#39;une fluorescence de 10x -2,5 à réduire le bruit lors de l&#39;acquisition précoce au début de chaque course. </li></ol></li></ol> 7. microscopie confocale <ol><li> Cultiver les cellules Homalodisca de douze dans une même plaque contenant des lamelles de verre mesurant 18 mm de diamètre dans chaque puits. </li><li> Inoculer une colonne sur la plaque toutes les 24 heures pendant une période de quatre jours, une fois par monocouche est obtenue. Veiller à ce que chaque cOLONNE puits contient un contrôle, une faible dilution virale (1:10) et ainsi une dilution virale élevée (1: 100.000) bien. Utiliser des solutions de virus obtenus à l&#39;étape 2.8. </li><li> Retirez tous les supports sur le cinquième jour et laver les cellules deux fois avec 1x PBS (pH 7,4). </li><li> Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% à froid à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Ajouter 500 ul de 1x tampon phosphate salin (PBS) pour les cellules et les laver pendant 10 min à température ambiante sur un agitateur à faible vitesse. Laver les cellules trois fois. </li><li> Ajouter 500 ul de 0,1% de Triton X-100 aux cellules pour les perméabiliser. Laisser reposer pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules de nouveau tel que décrit précédemment à l&#39;étape 7.5. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;une albumine de sérum bovin (BSA), une solution à 5% pour bloquer les cellules à température ambiante. Laisser reposer pendant 2 h puis retirez. </li><li> Diluer actions rhodamine phalloïdine conjugué à du rouge (RCP) 1: 250 dans du PBS 1X contenant 5% de BSA et ajouter 250 microlitres de la dilution à chaque puits pour tache de F-actine. </li><li> Plaque de couverture en aluminium fhuile pour empêcher le colorant de blanchiment et incuber les cellules à 4 ° CO / N. </li><li> Retirez le RCP après 12 heures d&#39;incubation et le remplacer par 250 pi de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (250 pg / ml) dilué dans du PBS 1X contenant 5% de BSA, pour colorer les noyaux des cellules . </li><li> Incuber les cellules contenant du DAPI à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS 1x, comme décrit précédemment à l&#39;étape 7.5. </li><li> Retirez délicatement les lamelles des puits et installer des lames de microscope à l&#39;aide d&#39;un milieu de montage avec un réactif anti-fade. </li><li> Laisser sécher les lames en opaque boîtes à être examinés au microscope confocal. Voir préparé diapositives dès que possible en tant que colorants peuvent s&#39;estomper rapidement. </li><li> Images colorées cellules en utilisant un système confocal équipé d&#39;un microscope contenant une lentille 63X (huile) Plan-apochromate. <ol><li> Définissez les longueurs d&#39;onde laser à 543 ± 10 nm excitation et 575 ± 10 nm émission pour Rhoadmine phalloïdine rouge-conjucated, Et 369 ± 10 nm excitation et 450 ± 30 nm émission pour DAPI. </li><li> Utilisation gain identique et les paramètres pour compenser le détecteur afin d&#39;obtenir toutes les images. </li><li> Traiter les images en utilisant un logiciel approprié pour le traitement de l&#39;image et de tri et d&#39;importer des images de votre choix dans un logiciel de gestion d&#39;image. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Préoccupations croissantes concernant l&#39;introduction d&#39;espèces invasives agricoles ont conduit à une demande accrue de nouvelles méthodes pour se défendre contre les ravageurs et agents pathogènes émergents. Un centre de prévention et de gestion de la maladie implique la gestion des vecteurs de pathogènes et était la cible principale de cette étude. Economie jouent un rôle essentiel dans la décision de produire ce type de biopesticide pour gérer les vecteurs de pathogènes dans l&#39;agriculture pa...

Le vitreux ailé tireur (Homalodisca vitripennis Germar 1821) a été identifié comme le vecteur principal de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l&#39;agent causal de la maladie de Pierce de la vigne (PD) en Amérique du Nord 1. Gestion des populations d&#39;insectes est rapidement devenu le centre de recherche pour lutter contre ce problème dévastateur pour l&#39;industrie de la viticulture en Californie et dans le sud des États-Unis. Un sens positif, virus à ARN simple brin appartenant à la famille Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) a été identifié dans H. sauvage populations vitripennis et démontré que l&#39;augmentation de la mortalité chez les populations de 2-4, tout en réduisant la résistance de l&#39;insecte aux insecticides. Développement de méthodes de manière efficace arrière infecté H. vitripennis à l&#39;âge adulte dans un environnement de laboratoire ont été difficiles car <em&gt; H. vitripennis ont des besoins nutritionnels spécifiques de stade qui nécessitent une grande variété de plantes hôtes 5-8. Installations spécifiques sont nécessaires pour H. direct arrière vitripennis aux États-Unis; Par conséquent, la culture cellulaire est plus économique et une alternative viable, ainsi que de plus en plus vital pour HoCV-01 détection et la réplication 2,9. Bien que les méthodes de base pour établir des cultures de cellules de H. vitripennis sont décrites, ces méthodes n&#39;ont pas encore été utilisées pour la production commerciale d&#39;agents de lutte biologique, tels que les virus 2. L&#39;objectif global des procédures suivantes est de produire une forte concentration de HoCV-01 convient pour une utilisation comme agent de lutte biologique. La réplication virale nécessite une cellule vivante, ce qui explique pourquoi cultiver avec succès et l&#39;optimisation de H. vitripennis cultures est vitale pour le progrès de produire des niveaux rentables de virus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;cell culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430168</td>
			<td>Surface area 25&#160;cm2, canted neck, cap (plug seal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Inverted microscope and camera</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA &#8226; 4Na per liter of Hanks&#8242; Balanced Salt Solution with phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8937</td>
			<td>48 wells (TC treated with lid)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DETCA&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>228680</td>
			<td style="width:167px;">Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;bottle-top vacuum filter system</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431206</td>
			<td>Cellulose acetate membrane, pore size 0.45&#160;&#956;m, membrane area 54.5&#160;cm2, filter capacity 500&#160;mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Brij 52</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>388831</td>
			<td>Polyethylene glycol hexadecyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate buffer solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5244</td>
			<td>Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">TRIzol LS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>For electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E7637</td>
			<td>BioReagent, for molecular biology, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect qRT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>204243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148&#160;</td>
			<td>Reagent grade, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368</td>
			<td style="width:167px;">Phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Rhodamine red-conjugated phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>R415</td>
			<td>Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM510 Meta Confocal System&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM Zen 2007 Software</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grace&#8217;s Insect medium (supplemented, 1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G8142</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-histidine monohydrate</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H8125</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 199 (10X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 1066 (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0422</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salts (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>51322C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM, amino acid mix (50X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>56419C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 M MgCl solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pen-Strep (w/ Glutamine)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G6784</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nystatin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>N6261</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>46305</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture

Le tireur vitreux ailé (Homalodisca vitripennis) est un insecte extrêmement polyphage et vagile trouvé dans tout le sud-ouest des États-Unis. Ces insectes sont les vecteurs prédominants de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), une bactérie du xylème limitée qui est l&#39;agent causal de la maladie de Pierce (PD) de vigne. La maladie de Pierce est économiquement dommageable; Ainsi, H. vitripennis sont devenus une cible pour des stratégies de gestion de l&#39;agent pathogène. Un dicistrovirus identifié comme virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) a été associée à une mortalité accrue chez H. populations vitripennis. En raison d&#39;une cellule hôte est nécessaire pour la réplication HoCV-01, la culture de la cellule fournit un environnement uniforme pour la réplication qui est ciblé sur le plan logistique et une valeur économique pour la production de bio-pesticide. Dans cette étude, un système de propagation à grande échelle de H. vitripennis cellules via la culture de tissus a été développé, pournir un mécanisme de réplication virale. HoCV-01 a été extrait des insectes de tout le corps et utilisée pour inoculer H. culture vitripennis cellules à différents niveaux. Le milieu de culture a été prélevé toutes les 24 h pendant 168 heures, l&#39;ARN extrait et analysé par qRT-PCR. Les cellules ont été colorées avec du bleu trypan et on les compte pour quantifier la survie des cellules en utilisant la microscopie optique. Particules virales entières ont été extraites jusqu&#39;à 96 heures après l&#39;infection, qui a été le point d&#39;être déterminé avant l&#39;effondrement total de culture cellulaire a eu lieu de temps. Les cellules ont été également soumis à coloration fluorescente et visualisés en utilisant la microscopie confocale pour étudier l&#39;activité virale sur l&#39;intégrité de l&#39;attachement et des noyaux F-actine. La conclusion de cette étude est que H. cellules vitripennis sont capables d&#39;être cultivées et utilisées pour la production de masse de HoCV-01 à un niveau approprié pour permettre la production d&#39;un biopesticide.

attachement cellulaire et la croissance a été observée dans les 48 heures de passage dans les deux petites et grandes flacons de culture, de cultures primaires et les passages continus. la croissance des fibroblastes et le développement a également été observée dans ce laps de temps. Lorsque flacons nouvellement ensemencées ont été perturbés avant 48 h, il y avait un déclin visible dans la fixation des cellules, conduisant à des cultures à croissance plus lente et parfois pas de fixation ou de croissance ...

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Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Nous présentons ici un protocole de propager les cellules de Homalodisca et HoCV-1 in vitro. Le milieu a été retiré de HoCV-1 et des cultures positives ARN extrait tous les 24 h pendant 168 h. Cellule de survie a été quantifiée par coloration au bleu trypan. Particules virales entières ont été extraits après l&#39;infection. L&#39;ARN extrait a été quantifiée par qRT-PCR.

Propagation d&#39;<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Par<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Culture Cellulaire

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

11.6K vues.  University of Texas at Tyler.  Nous présentons ici un protocole de propager les cellules de Homalodisca et HoCV-1 in vitro. Le milieu a été retiré de HoCV-1 et des cultures positives ARN extrait tous les 24 h pendant 168 h. Cellule de survie a été quantifiée par coloration au bleu trypan. Particules virales entières ont été extraits après l'infection. L'ARN extrait a été quantifiée par qRT-PCR. 

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Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Recherche

Immunologie et infection

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoïdes de modèle pour les maladies infectieuses: la culture des droits humains et murins organoïdes d&#39;estomac et microinjection de Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identification des médiateurs du récepteur des cellules T signalisation via la projection des bibliothèques inhibiteur chimique

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

Culture cellulaire bactérienne au niveau unicellulaire à l'intérieur des vésicules géantes

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Purification des préparations extracellulaires de vésicule à haut rendement loin du virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 times of its original size. Clinical and experimental studies have shown that small aneurysms may rupture, while a subpopulation of large aneurysms may remain stable. Thus, in addition to the measurement of intraluminal diameter of the aorta, knowledge of structural traits of the vessel wall may provide important information to assess the stability of the AAA. Aortic stiffening has recently emerged as a reliable tool to determine early changes in the vascular wall. Pulse propagation velocity (PPV) along with the distensibility and radial strain are highly useful ultrasound-based methods relevant for assessing aortic stiffness. The primary purpose of this protocol is to provide a comprehensive technique for the use of ultrasound imaging system to acquire images and analyze the structural and functional properties of the aorta as determined by MILD, PPV, distensibility and radial strain.

This manuscript describes a detailed protocol for using high frequency ultrasound imaging to measure luminal diameter, pulse propagation velocity, distensibility and radial strain on a mouse model of abdominal aortic aneurysm.

Mesure de la vitesse de propagation des impulsions, de la disxsibilité et de la souche dans un modèle abdominal de souris d’anévrisme aortique

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune system during early development. The Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) infection model has been well-established in studying host immune response against mycobacterial infection. It has been suggested that different macrophage cell death types will lead to the diverse outcomes of mycobacterial infection. Here we describe a protocol using intravital microscopy to observe macrophage cell death in zebrafish embryos following M. marinum infection. Zebrafish transgenic lines that specifically label macrophages and neutrophils are infected via intramuscular microinjection of fluorescently labeled M. marinum in either the midbrain or the trunk. Infected zebrafish embryos are subsequently mounted on low melting agarose and observed by confocal microscopy in X-Y-Z-T dimensions. Because long-term live imaging requires using low laser power to avoid photobleaching and phototoxicity, a strongly expressing transgenic is highly recommended. This protocol facilitates the visualization of the dynamic processes in vivo, including immune cell migration, host pathogen interaction, and cell death.

This protocol describes a technique for visualizing macrophage behavior and death in embryonic zebrafish during Mycobacterium marinum infection. Steps for the preparation of bacteria, infection of the embryos, and intravital microscopy are included. This technique may be applied to the observation of cellular behavior and death in similar scenarios involving infection or sterile inflammation.

Visualisation de la mort des cellules lytiques de Macrophage pendant l'infection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par l'intermédiaire de la microscopie intravitale

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagation du parasite microsporidien Edhazardia aedis chez les moustiques Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Étude de la calcification de la valve aortique par isolement et culture de lymphocytes T à l’aide de cellules nourricières de Buffy Coat irradié

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...