N.G. est récipiendaire de bourses de la Français Fondation pour la Recherche Médicale FRM et de la Fondation Philipp ; R.S. est soutenu par la Fondation Lucile Packard pour la santé des enfants et le numéro de prix CTSA nih/NCRR de Stanford UL1 RR025744; P.S. est soutenu par une bourse Max Kade de la Fondation Max Kade et de l’Académie autrichienne des sciences et une bourse Schroedinger du Fonds autrichien pour la science (FWF): J3399-B21; S.J.G. remercie le soutien des national institutes of health subventions U19 AI104209, NS 080062 et du programme de recherche sur les maladies liées au tabac de l’Université de Californie; L.L.R. reconnaît le soutien de la Fondation nationale de la recherche sur l’arthrite (ANRF) et de la subvention K99AI110645 des National Institutes of Health.

Tous les soins et expérimentations sur les animaux ont été menés conformément aux directives des National Institutes of Health et avec l’approbation spécifique du Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université Stanford.
1. Génération et caractérisation de mastocytes cultivés dérivés de la moelle osseuse (BMCMC).
Remarque : Les BMCMC donneurs doivent être générés à partir de cellules de moelle osseuse du même fond génétique que les souris mc-déficientes réceptrices. Les BMCMC de donneurs d’origine mâle ne conviennent pas à la greffe de souris femelles. les BMCMC donneurs d’origine féminine se grefferont avec succès dans les receveurs masculins et féminins.
<ol><li>Extraction de la moelle osseuse.<ol>
<li>Verser une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans une plaque de culture de 6 puits (1 puits par souris) et la placer sur de la glace.</li>
		<li>Trempez les instruments de dissection dans de l’éthanol à 70% pour la stérilisation.</li>
		<li>Euthanasier les souris donneuses par inhalation de dioxyde de carbone (CO2)suivie d’une luxation cervicale, puis vaporiser de l’éthanol à 70% sur les sites de manipulation.</li>
		<li>Utilisez des instruments de dissection stériles pour extraire les os du fémur, du tibia et du péroné sans couper les épiphyses osseuses.</li>
		<li>Tout en fixant les os avec une pince, grattez tout le tissu des os (et jetez le péroné) à l’aide de ciseaux stériles (ou de lames de scalpel). Placer les os dans le PBS sur de la glace jusqu’à ce que tous les os soient recueillis.</li>
		<li>Effectuez toutes les étapes restantes dans la hotte de culture de tissus stériles. À l’aide d’instruments stériles, fixez les os avec une pince et coupez les deux épiphyses pour exposer la cavité médullaire.</li>
		<li>À l’aide de seringues de 3 ml et d’aiguilles de 30 G, et d’un milieu de rinçage à froid (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] complété par 10 % de sérum de veau fœtal [FCS, inactivé par la chaleur], de L-glutamine à 2 mM, de solution antibiotique-antimycostique à 1 %, de 50 μM de B-mercaptoéthanol), rincer la moelle osseuse rouge dans une boîte de Petri.</li>
		<li>Utilisez la même seringue pour dissocier les grappes de cellules de moelle osseuse rincées par aspiration douce répétée et éjection.</li>
		<li>Regrouper la moelle osseuse fémorale et tibiale de chaque souris dans un tube de centrifugation de 15 ml. Remplissez le tube d’un milieu de rinçage à froid pour laver les cellules de la moelle osseuse et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Culture BMCMC.<ol>
<li>Enlever le surnageant et récupérer les cellules granulées de la moelle osseuse dans 10 ml de milieu de culture (DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal [FCS, inactivé par la chaleur], 2 mM de L-glutamine, 1 % de solution antibiotique-antimycotique, 50 μM de B-mercaptoéthanol et 20 % de milieu cellulaire WEHI-3 [comme source d’IL-3; utilisez alternativement l’IL-3 recombinant de souris à 10 ng/ml]).</li>
		<li>Placer les cellules dans une fiole de culture tissulaire de taille appropriée(p. ex.T25 pour 1 souris, T75 pour 2 souris, etc.).</li>
		<li>1 à 2 jours après le placage des cellules, transférer le milieu et les cellules de suspension (laissant les débris et les cellules adhérentes coller au fond du ballon) dans une nouvelle fiole et ajouter du milieu de culture frais (10 ml/souris).</li>
		<li>Au cours des semaines suivantes, les cellules d’alimentation tous les 3-4 jours (ajouter 10 ml de milieu de culture par souris). Maintenir la densité cellulaire entre 2,5 x 105-1 x 106 cellules/ml. Transférer les cellules non adhérentes dans une nouvelle fiole une fois par semaine jusqu’à ce qu’aucune cellule adhérente ne soit présente dans la fiole de culture. Tester la maturité des cellules (voir ci-dessous) avant utilisation pour des essais in vitro ou une greffe chez des souris déficientes en MC. REMARQUE: La différenciation complète des BMCMC prendra 4-6 semaines.</li>
	</ol></li>
	<li>Évaluation de la maturité de la BMCMC.<ol>
<li>
Utilisation de la cytométrie de flux.
		<ol>
<li>Cellules de lavage (5 x 104-5 x 105 cellules/condition) avec tampon FACS glacé (PBS, 0,5% FCS) dans un tube de fond rond en polystyrène de 5 ml. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Surnageant aspiré.</li>
			<li>Diluer les anticorps monoclonaux anti-souris CD16/32 (clone 93 ou 2.4G2) 1:200 (2,5 μg/ml) dans le tampon FACS. Ajouter 10 μl à chaque pastille et la remise en suspension par un bref vortex. Incuber 5 min sur la glace pour bloquer la liaison Fc. Remarque : Protégez les échantillons de la lumière directe pour toutes les étapes restantes.</li>
			<li>Diluer la phycoérythrine (PE) conjuguée anti-souris Fc εRI α (clone MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) et isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjuguée contre la souris KIT (CD117; clone 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) (« solution de coloration »), ou les anticorps de contrôle d’isotype marqués respectifs dans le tampon FACS (« solution de contrôle d’isotype »).</li>
			<li>Diviser la moitié des cellules bloquées de l’étape 1.3.1.2) dans un tube de fond rond supplémentaire en polystyrène et ajouter 20 μl de « solution de coloration » dans un tube et 20 μl de « solution de contrôle d’isotype » dans l’autre tube. Incuber 30 min sur la glace.</li>
			<li>Ajouter 3 ml de tampon FACS glacé et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et le ressusciter dans un tampon FACS de 300 μl contenant 1 μg/ml d’iodure de propidium (IP, pour l’identification des cellules mortes). Procéder à l’analyse de cytométrie de flux (voir figure 2A).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilisation de coloration bleue à la toluidine.<ol>
<li>Laver 1 x 105 cellules une fois avec du PBS par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à température ambiante, puis aspirer et ressusciter les cellules dans 200 μl de PBS.</li>
			<li>Transférer la suspension cellulaire dans un cytofunnel préparé attaché à une lame de microscope et procéder à la cyto-centrifugation à l’aide d’une cytocentrifugation (40 x g pendant 5 min).</li>
			<li>Lames sèches à l’air pendant 10 min et dessinez un cercle de cire autour des cellules à l’aide d’un stylo PAP. Ajouter 0,1% de solution bleue de toluidine pour couvrir les cellules. Incuber pendant 1 min. Lavez les lames dans l’eau courante du robinet pendant 1 min, puis les toboggans secs à l’air pendant 10 min.</li>
			<li>Cellules de lamelle de couverture utilisant un support de montage. Procéder à l’analyse au microscope optique (voir figure 2B)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Greffe de souris mastocytaires déficientes avec BMCMC.
<ol><li>Greffe d’oreille par injection intradermique (i.d.). REMARQUE: Pour le transfert adoptif de BMCMC dans les pennes d’oreille de souris déficientes en MC, nous vous recommandons d’effectuer deux injections de 1 x10 6 cellules chacune (pour un total de 2 x 106 cellules) par penne d’oreille. L’engraftment intradermique de BMCMC dans les pennes d’oreille de souris mc-déficientes a été employé par de nombreux investigateurs dans plusieurs modèles, y compris des modèles d’anaphylaxie cutanée passive (PCA)24,27, défense de l’hôte contre des venins28, et des réactions d’hypersensibilité chronique (CHS)29,30.<ol>
<li>Compter et ressusciter les cellules à 4 x 107 BMCMC/ml (1 x 106 BMCMC/25 μl) dans le DMEM froid. Transférer la solution BMCMC dans une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de 30 G. Conserver sur la glace jusqu’à l’injection.</li>
		<li>Anesthésier des souris MC-déficientes de 4 à 6 semaines à l’aide d’isoflurane (2,5 % v/v). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par pincement des pieds, ajustez l’isoflurane si cela est indiqué et continuez à surveiller la respiration et la réponse au pincement des pieds tout au long de la procédure. Appliquez une pommade ophtalmique avec un Q-tip pour prévenir la sécheresse des yeux.</li>
		<li>Avec l’index, créez une pression verticale sur la face dorsale du penne de l’oreille pour exposer et étirer la face ventrale.</li>
		<li>Effectuer deux injections de 25 μl i.d. de solution BMCMC dans deux sites différents de la face ventrale du penne de l’oreille, la première injection au milieu de l’oreille et la deuxième injection vers l’extrémité du penne de l’oreille. Attendez 4-6 semaines après la greffe d’i.d. avant d’effectuer des expériences in vivo. Remarque: Dans notre expérience, à ce moment-là, le nombre de MCs/mm2 de derme dans la partie centrale du penne de l’oreille est généralement similaire à celui de l’emplacement correspondant chez les souris de type sauvage, tandis que le nombre de MCs/mm2 dans la périphérie des pennes de l’oreille sont généralement sensiblement inférieurs à ceux des souris de type sauvage correspondantes 27,28. Ceci devrait être gardé à l’esprit lors de la conception des expériences avec de telles souris MC-greffées(par exemple,des agents avec des effets possibles sur la fonction mc devraient être injectés dans la partie centrale des pennes d’oreille, et l’analyse des effets de tels traitements devrait également se concentrer sur cette zone).</li>
	</ol></li>
	<li>Engraftment péritonéal de cavité par l’injection intrapéritonéale (i.p.). REMARQUE: Le transfert adoptif de BMCMC dans la cavité péritonéale des souris déficientes en MC nécessitera une injection de 2 x 106 cellules par souris. De telles injections i.p. de BMCMC chez des souris déficientes en MC ont été utilisées par de nombreux groupes pour étudier les rôles des MC dans divers modèles, y compris des modèles de défense de l’hôte contre les venins31 ou la septicémie bactérienne32,33.<ol>
<li>Comptez le nombre approprié de cellules et ressuscitez à 1 x 107 BMCMC/ml (2 x 106 BMCMC/200 μl) dans du DMEM froid. Transférer la solution BMCMC dans une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de 25 G. Conserver sur la glace jusqu’à l’injection.</li>
		<li>Effectuer 1 injection de solution bmcmc de 200 μl dans la cavité péritonéale de souris déficientes en MC de 4 à 6 semaines. Attendez 4-6 semaines après la greffe d’i.p. avant d’effectuer des expériences in vivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Greffe par injection intraveineuse (i.v.). REMARQUE: Le transfert adoptif de BMCMC par injection i.v. dans des souris déficientes en MC nécessitera une injection de 5 x 106 cellules par souris. Des injections intraveineuses (i.v.) de BMCMC chez des souris déficientes en MC ont été utilisées par de nombreux groupes pour étudier les rôles des MC dans divers modèles de maladies, y compris les modèles d’infection de la vessie34,d’asthme35,de fibrose pulmonaire36et d’arthrite médiée par les anticorps37.<ol>
<li>Comptez le nombre approprié de cellules et ressuscitez à 2,5 x 107 BMCMC/ml (5 x 106 BMCMC/200 μl) dans le DMEM froid. Transférer la solution BMCMC dans une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de 30 G. Conserver sur la glace jusqu’à l’injection.</li>
		<li>Anesthésier des souris MC-déficientes de 4 à 6 semaines à l’aide d’isoflurane (2,5 % v/v). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par pincement des pieds, ajustez l’isoflurane si cela est indiqué et continuez à surveiller la respiration et la réponse au pincement des pieds tout au long de la procédure. Appliquez une pommade ophtalmique avec un Q-tip pour prévenir la sécheresse des yeux.</li>
		<li>Effectuer une injection de 200 μl de solution BMCMC dans la veine caudale (ou, alternativement, la veine rétro-orbitale) d’une souris déficiente en MC. Attendez 12 semaines après la greffe d’i.v. avant d’effectuer des expériences in vivo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse des souris déficientes en mastocytes greffées.
<ol><li>Analyse d’engraftment d’oreille.<ol>
<li>À la fin de l’expérience, euthanasier les souris par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale.</li>
		<li>Isoler les pennes de l’oreille et fixer dans 10 % (vol/vol) de forcine tamponnée pendant la nuit à 4 °C. Incorporez des pennes d’oreille fixes dans de la paraffine, coupez des sections de pennes d’oreille de 4 μm et montez sur des lames de verre.</li>
		<li>Colorer les lames avec une solution bleue de toluidine à 0,1% pendant 1 min à température ambiante. Lavez les lames à l’eau du robinet pendant 1 min, puis les lames sèches à l’air pendant 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Lames de couverture à l’aide d’un support de montage, puis comptez le nombre de MC greffés par sections de pennes à l’aide d’un microscope optique. Évaluer l’efficacité de l’engraftment en comparant le pourcentage et la distribution des MC dans la peau de l’oreille des souris greffées par rapport aux souris de type sauvage.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse péritonéale d’engraftment de cavité.<ol>
<li>Évaluation du nombre de mastocytes dans la cavité péritonéale.<ol>
<li>À la fin de l’expérience, euthanasier les souris par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale. Retirez soigneusement la peau ventrale des souris sans casser la cavité péritonéale.</li>
			<li>Injecter 5 ml de PBS froid ou à température ambiante dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 5 ml équipée d’une aiguille de 25 G. Utilisez le PBS froid pour réduire le risque d’activation des cellules péritonéales (ceci est très important lors de l’évaluation de la dégnulation péritonéale de MC ou des niveaux de certains produits dérivés de MC dans le liquide de lavage péritonéal). Effectuez un massage de l’abdomen pendant 20 secondes pour récolter les cellules péritonéales.</li>
			<li>Aspirer lentement le lavage péritonéal à l’aide d’une seringue de 5 ml équipée d’une aiguille de 22 G. Enregistrer le volume de lavage aspiré (attendez-vous à récupérer jusqu’à 80% du volume injecté).</li>
			<li>Transférer le liquide de lavage péritonéal dans un tube de fond rond en polystyrène de 5 ml et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Surnageant aspiré. Récupérer la pastille dans du PBS froid de 400 μl.</li>
			<li>Comptez le nombre total de cellules péritonéales à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre. Utiliser la moitié de la suspension cellulaire pour une analyse cytométrique en flux (comme décrit à l’étape 1.3.1), afin d’évaluer le pourcentage et l’expression marqueur des MC greffés dans la cavité péritonéale. Multipliez le nombre total de cellules péritonéales par le pourcentage de MC pour obtenir le nombre absolu de MC péritonéaux.</li>
			<li>Effectuer une cytocentrifugation avec les cellules restantes comme décrit à l’étape 1.3.2.2. Sécher à l’air les lames pendant 10 min à température ambiante et dessiner un cercle de cire autour des cellules à l’aide d’un stylo PAP.</li>
			<li>Couvrir les cellules avec une solution de coloration May-Grünwald non diluée pendant 5 min, suivie d’un lavage en PBS pendant 5 min, les deux à température ambiante. Couvrir les cellules avec la tache giemsa diluée 1:20 avec de l’eau désionisée et incuber 20 min à température ambiante. Lavez les lames 2 fois dans l’eau du robinet pendant 1 min, puis les lames sèches à l’air.</li>
			<li>Cellules de lamelle à l’aide d’un support de montage, et calculer le pourcentage de MC greffés à l’aide d’un microscope optique (en comptant au moins 400 cellules totales). Évaluer l’efficacité de l’engraftment en comparant le pourcentage de MC dans le lavage péritonéal des souris greffées par rapport aux souris de type sauvage.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Évaluation des mastocytes dans les fenêtres mésentériques.<ol>
<li>Suite au lavage péritonéal décrit à l’étape 3.2.1, ouvrir la membrane péritonéale pour exposer le tractus intestinal des souris. Disposez 4 à 5 fenêtres mésentériques par souris sur une diapositive.</li>
			<li>Fixer les lames pendant 1 heure dans une solution de carnoy (3:2:1 vol/vol/vol d’éthanol, de chloroforme et d’acide acétique glacial) à température ambiante. Sécher à l’air les lames et enlever l’intestin (les fenêtres mésentériques fixes resteront attachées aux lames).</li>
			<li>Colorer les préparations pendant 20 min à température ambiante avec la solution de coloration Csaba (bleu Alcian/Safranin O).<ol>
<li>Pour faire 500 ml de coloration Csaba, préparer 500 ml de tampon acétate en mélangeant 100 ml de solution d’acétate de sodium 1 M avec 120 ml de HCl 1 M. Porter jusqu’à 500 ml avec de l’eau désionisée et ajuster le pH à 1,42. Ensuite, dissoudre 90 mg de Safranin [identifie les « MC matures » en rouge], 1,8 g de bleu d’Alcian [identifie les « MC immatures » en bleu] et 2,4 g de sulfate d’ammonium ferriqueNH4Fe(SO(SO)2dans 500 ml de tampon acétate.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Lames de couverture à l’aide d’un support de montage, puis comptez le nombre de MC greffés par fenêtre mésentérique à l’aide d’un microscope optique. Évaluer l’efficacité de l’engraftment en comparant le pourcentage et la distribution des MC dans les fenêtres mésentériques des souris greffées par rapport aux souris de type sauvage.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de l’engraftment I.v.<ol>
<li>À la fin de l’expérience, euthanasier les souris par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale, et prélever les tissus d’intérêt(par exemple, poumon, peau ou rate) et fixer pendant la nuit dans 10 % (vol/vol) de fortérine tamponnée à 4 °C.</li>
		<li>Incorporez des tissus fixes dans de la paraffine, coupez des sections de 4 μm et montez sur des lames de verre. Colorer les lames avec une solution bleue de toluidine à 0,1% pendant 1 min à température ambiante. Lavez les lames à l’eau du robinet pendant 1 min, puis les lames sèches à l’air pendant 10 min.</li>
		<li>Lames de couverture utilisant le support de montage et évaluer le nombre et la distribution de MCs greffés par sections de tissu utilisant un microscope de lumière.</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Près de 30 ans après sa description initiale38, l’approche «mastocyte knock-in» continue de fournir des informations précieuses sur ce que les MC peuvent faire ou ne peuvent pas faire in vivo. Les fonctions de MCs ont été longtemps pensées pour être limitées à leur rôle dans l’allergie. Les données générées à l’aide de l’approche «mastocyte knock-in» ont changé ce point de vue, en fournissant des preuves que les MC peuvent, entre autres fonctions, jouer de...

Les mastocytes (MC) sont des cellules hématopoïétiques qui proviennent de progéniteurs pluripotents de moelle osseuse1-3. Après l’évacuation de la moelle osseuse, les progéniteurs des MC migrent dans divers tissus où ils se développent en MC matures sous l’influence des facteurs de croissance locaux1-3. Les MC résidants dans les tissus sont stratégiquement situés aux interfaces hôte-environnement, telles que la peau, les voies respiratoires et le tractus gastro-intestinal, où ils se comportent comme une première ligne de défense contre les insultes externes3-6. Les MC sont souvent sous-classés en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques « de base » et de leurs emplacements anatomiques. Chez la souris, deux types de MC ont été décrits: les MC de type « tissu conjonctif » (CTMCs) et les MCs muqueux (MMCs)1-3,7,8. Les CTMCs sont souvent situés autour des veinules et près des fibres nerveuses, et résident dans les cavités sérales, tandis que les MMC occupent des emplacements intraépithéliaux dans l’intestin et la muqueuse respiratoire1-3.
De nombreuses méthodologies ont été appliquées pour étudier les fonctions biologiques des MC9-13. De nombreux groupes se sont concentrés sur des approches in vitro utilisant soit des lignées cellulaires (telles que les lignées MC humaines HMC114 ou LAD215,16),des MC dérivées in vitro (telles que les MC17dérivées du sang périphérique humain, ou des MC cultivés dérivés de la moelle osseuse de souris [BMCMC]18,des MC cultivés dérivés de la peau fœtale [FSCMC]19 et des MC dérivés de cellules péritonéales [PCMC]20) ou des MC isolés ex vivo provenant de différents sites anatomiques. Tous ces modèles sont largement utilisés pour étudier les détails moléculaires de la biologie de MC, tels que les voies de signalisation impliquées dans l’activation de MC. Cependant, un aspect important de la biologie des MC est que leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles(par exemple,la teneur en protéase des granules cytoplasmiques ou la réponse à différents stimuli) peuvent être modulées par localisation anatomique et microenvironnement2,7. Étant donné que le mélange exact de tels facteurs rencontrés in vivo peut être difficile à reproduire in vitro,nous privilégions l’utilisation d’approches in vivo pour obtenir des informations sur les fonctions des MC9.
Il existe plusieurs souches de souris présentant une déficience génétique en MC, telles que les souris WBB6F1-Kit W/W-v ou C57BL/6-Kit W-sh/W-sh largement utilisées. Ces souris manquent d’expression et/ou d’activité de KIT (CD117), le récepteur du principal facteur de cellules souches de facteur de croissance MC (SCF)21,22. En conséquence, ces souris ont un déficit profond en MC mais ont également des anomalies phénotypiques supplémentaires liées à leurs mutations c-kit (chez les souris WBB6F1-Kit W/W-v) ou aux effets de la grande inversion chromosomique qui entraîne une réduction de l’expression duc- kit (chez les souris C57BL/6- Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Plus récemment, plusieurs souches de souris présentant un déficit constitutif indépendant de MC enc- kitont été signalées24-26. Toutes ces souris et quelques nouveaux types supplémentaires de souris inductibles mc-déficientes ont été récemment examinés en détail9,10,13.
Ici, nous décrivons des méthodes pour la génération de MCs cultivés moelle-dérivés de souris (BMCMCs), leur transfert adoptif dans les souris MC-déficientes, et l’analyse des nombres et de la distribution de MCs adoptivement transférés à différents emplacements anatomiques. Cette méthode dite de « mastocyte knock-in » peut être utilisée pour évaluer les fonctions des MC et des produits dérivés de MC in vivo. Nous discutons des avantages et des limites de cette méthode, à la lumière des approches alternatives qui ont été développées ces dernières années.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

Les mastocytes (MC) sont des cellules hématopoïétiques qui résident dans divers tissus et sont particulièrement abondantes aux sites exposés à l’environnement externe, tels que la peau, les voies respiratoires et le tractus gastro-intestinal. Mieux connus pour leur rôle néfaste dans les réactions allergiques IgE-dépendantes, les MCs ont également émergé en tant qu’acteurs importants dans la défense de l’hôte contre le venin et envahissant les bactéries et les parasites. Le phénotype et la fonction de MC peuvent être influencés par des facteurs microenvironnementaux qui peuvent différer selon l’emplacement anatomique et/ou basé sur le type ou le stade de développement des réponses immunitaires. Pour cette raison, nous et d’autres avons favorisé les approches in vivo sur les méthodes in vitro pour mieux comprendre les fonctions mc. Ici, nous décrivons des méthodes pour la génération de MCs cultivés moelle-dérivés de souris (BMCMCs), leur transfert adoptif dans les souris génétiquement MC-déficientes, et l’analyse du nombre et de la distribution de MCs adoptivement transférés à différents emplacements anatomiques. Cette méthode, appelée l’approche« mastocyte knock-in », a été largement utilisée au cours des 30 dernières années pour évaluer les fonctions des MCcs et des produits dérivés de MC in vivo. Nous discutons des avantages et des limites de cette méthode, à la lumière des approches alternatives qui ont été développées ces dernières années.

Un aperçu de l’approche del’enramationdes mastocytes est montré à la figure 1,et comprend la génération de BMCMC, le nombre de cellules qui devraient être greffées i.p., i.d. ou i.v. dans des souris déficientes en MC (le nombre peut être varié si indiqué en fonction de la conception expérimentale) et l’intervalle entre la greffe et l’expérience en fonction du site d’injection (cet intervalle peut également varier, si indiqué; par exemple,le contenu des médiateu...

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Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

Nous décrivons une méthode pour la génération des mastocytes dérivés in vitro, leur greffe en souris mastocytaires-déficientes, et l’analyse du phénotype, des nombres et de la distribution des mastocytes engrafted à différents emplacements anatomiques. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les fonctions des mastocytes in vivo.

Analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

10.2K vues.  Stanford University School of Medicine. Nous décrivons une méthode pour la génération des mastocytes dérivés in vitro, leur greffe en souris mastocytaires-déficientes, et l’analyse du phénotype, des nombres et de la distribution des mastocytes engrafted à différents emplacements anatomiques. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les fonctions des mastocytes in vivo.

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recherche

Immunologie et infection

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

L&#39;induction de la réaction du greffon contre l&#39;hôte et des maladies<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des lymphocytes T utilisant un modèle murin MHC-apparié

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation d&#39;un solvant organique

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d&#39;exocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca2 +-imagerie et des essais de dégranulation

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Génération des cellules de knock-out primaire et élargi NK humaine à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.